引用本文： 唐熹, 陈易华, 范严严, 简燚. 纵隔结节硬化型霍奇金淋巴瘤的临床病理分析. 华西医学, 2016, 31(11): 1842-1845. doi: 10.7507/1002-0179.201600505 复制
纵隔发生的霍奇金淋巴瘤绝大多数为结节硬化型，常表现为纵隔的巨大肿块，多数患者就诊时已为临床Ⅱ期症状。目前国内关于该疾病的报道较少，本文通过回顾性分析3例纵隔结节硬化型霍奇金淋巴瘤（NSHL）及复习文献，分析该疾病临床病理、免疫表型及分子生物学特征以提高对疾病的认识和诊断水平并为临床治疗提供帮助。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集成都军区总医院2003年－2012年纵隔NSHL手术切除3例患者的病历资料。其中，男1例，女2例，年龄25～29岁；病程1周～半年；其余一般资料见表 1。3例患者均由2名主任医师复核确诊，其影像学资料由成都军区总医院CT室提供。
表1
3例纵隔NSHL患者一般资料
1.2 方法
1.2.1 免疫标记及结果判定
3例手术切除标本均经4%中性甲醛固定、石蜡包埋切片、苏木精-伊红（HE）染色后制成4 μm常规HE染色切片；采用EnVision两步法按说明书进行免疫组织化学（免疫组化）标记[阴性对照采用磷酸缓冲盐溶液（PBS）]，所用一抗CD30、CD15、CD20、PAX-5、间变性淋巴瘤激酶（ALK）、CD45、细胞角蛋白（CK）、CD79α、S-100蛋白、Ki-67购于丹麦Dako公司。肿瘤细胞（陷窝细胞、RS细胞）的细胞膜和（或）细胞质、或细胞核着色判定为免疫标记阳性。
1.2.2 EB病毒编码小RNA（EBER）原位杂交及结果判定
石蜡切片脱蜡水化蛋白酶消化、再固定脱水后滴加含EBER探针的杂交液进行杂交，再经NBT-BCIP显色、甲基绿复染后观察细胞核着色情况；EBER（+）的淋巴瘤标本[标本来自成都军区总医院已确认的EBER（+）的淋巴瘤患者]作为阳性对照，PBS代替EBER探针作为空白对照。EBER原位杂交试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。细胞核呈蓝紫色判定为阳性。
1.2.3 T细胞受体（TCR）γ及IgH基因重排
石蜡切片脱蜡，采用微切割剔除RS隐窝型瘤细胞提取DNA，-20℃保存备用；TCRγ及IgH基因引物序列采用文献报道的BIOMED-2标准化序列[1]，交由重庆生博医学生物工程科技有限公司进行合成；将12.5 μL Mix、上下游引物各1 μL、DNA 1 μL及9.5 μL 重蒸水（共25 μL）混合经预变性及30个变性、退火及延伸循环[即聚合酶链反应（PCR）]扩增目的基因，产物放入琼脂糖凝胶中100 V电泳20～30 min后成像拍照；采用有TCRγ及IgH基因重排的淋巴瘤标本作为阳性对照（标本来自成都军区总医院已经确诊的有TCRγ及IgH基因重排的淋巴瘤患者），慢性淋巴结炎伴淋巴组织反应性增生标本作为空白对照组。
1.2.4 观察指标
3例患者病变的病理形态、免疫表型、EBER原位杂交和TCRγ及IgH基因重排。
2 结果
2.1 病理形态
① 大体标本检查：3例患者病变均表现为直径为6.5～13.0 cm的巨大瘤块，包膜增厚，切面灰白色、呈结节状、实性质软，其中1例局灶区域出现坏死。② 显微镜检查：3例患者病变均具有相似的病理形态（图 1～4）：胶原纤维显著增生成束状并分割淋巴组织，使原有的淋巴结结构被破坏，形成多个大小不一的结节；结节边缘见肿瘤细胞或合体细胞，细胞界清、细胞质空亮、单核或数目不等的小核仁，2例查见经典里德-斯德伯格（RS） 细胞，1例结节中出现坏死。结节背景有大量的炎细胞浸润，如浆细胞、嗜酸性细胞、小淋巴细胞等，其中1例还可见粉色胶质样渗出物；患者3的标本可见肿瘤细胞穿透淋巴结被膜侵犯肺组织。
图1
肿瘤组织镜下病理形态（HE ×100） 可见增生的胶原纤维组织分割淋巴组织 图 2 肿瘤组织镜下病理形态（HE ×400） 肿瘤细胞体积较小、分叶状单核、细胞质透明、细胞膜清晰，另见典型RS细胞 图 3肿瘤组织镜下病理形态（HE ×400） 结节背景有大量炎细胞浸润，嗜酸性粒细胞明显 图 4肿瘤组织镜下病理形态（HE ×200） 肿瘤背景中有较多粉色胶质样渗出物 图 5肿瘤细胞CD15免疫表型（EnVision法×400） 肿瘤细胞CD15细胞膜强（+） 图 6肿瘤细胞PAX-5免疫表型（EnVision法×200） 肿瘤细胞PAX-5细胞核（+）
2.2 免疫表型
3例标本中肿瘤细胞均表达CD15、CD30及PAX-5（图 5、6），部分肿瘤细胞表达CD20，均不表达ALK、CD45、CK、CD79α、S-100等标记（表 2）。
表2
3例纵隔NSHL患者免疫表型
2.3 原位杂交和基因重排
3例患者的肿瘤细胞EBER原位杂交均（-）。有TCRγ基因重排的标本在190 bp处出现阳性条带，有IgH基因重排的标本在110 bp处出现阳性条带，而纵隔NSHL在110 bp或190 bp处未出现阳性条带，提示纵隔NSHL无TCRγ及IgH基因单克隆重排（图 7）。
图7
肿瘤组织基因重排检测 PCR检测TCRγ及IgH基因重排（1：Marker；2：TCRγ阳性标本；3：肿瘤TCRγ基因；4：肿瘤IgH基因；5：IgH阳性标本；6：空白对照组）
3 讨论
NSHL是一种少见的B淋巴细胞性恶性肿瘤，常见于青年，好发于纵隔、颈部及锁骨上淋巴结，其次为脾脏和肺、骨、骨髓、肝[2]；其发病与染色体6p21.32的单核苷酸多态性（SNP）、人类疱疹病毒6型（HHV-6）感染有显著关系[3]；临床多表现为无痛性的纵隔、颈部或锁骨上淋巴结进行性肿大，也可出现发热盗汗、疲乏、消瘦、酒后局部皮肤瘙痒等非特异性症状；某些患者CT可观察到颈部、纵隔、肺门淋巴结肿大；临床现采用化学治疗（化疗）为主的放射治疗（放疗）、化疗综合治疗，预后较好。
NSHL具有诊断意义的3个组织学形态是：① 胶原纤维束增生明显，不同患者增生程度不同，这些组织在偏振光学显微镜下呈现绿色双折光性。② 淋巴组织被增生的胶原束分割成多个境界清楚的结节，结节中可有坏死和炎细胞浸润，淋巴结正常结构被破坏。③ 特征性的RS细胞不常见，更多见的是一种特殊类型的RS细胞，该细胞一般位于结节或是残存的淋巴滤泡周围、体积较小、分叶状单核或有多个小核仁、细胞质透明、细胞膜清晰，因甲醛固定后细胞质收缩、与周围组织间形成空间，细胞好似位于陷窝中，故称为“陷窝细胞”；陷窝细胞的核仁也可呈现多形性，这与病理组织中炎性成分的比例有关[4]。除典型的病理形态外，本文还在患者1的标本HE切片中观察到肿瘤背景中有较多的粉色胶质样渗出物，该物质与NSHL是否有关还需进一步研究。
NSHL免疫表型为CD30（+）、CD15（+）、CD20（-/+）、CD3（-）、CD45（-）、CD79α（-）、CK（-）、胎盘碱性磷酸酶（-）、S-100（-）、Melan-A（-）、上皮膜抗原（EMA）（-）、ALK（-）[5]；有研究借助免疫组化方法观察到T/B、CD4+/CD8+及GrB+/TIA-1+的细胞比值与NSHL的预后分别呈现正相关和负相关的关系[6]。Hudnall等[7]还发现EBV（-）的NSHL患者瘤组织中调节性T细胞数目增加，与经典霍奇金淋巴瘤其他亚型相比T/B细胞数比例最高；随后Ma等[8]进一步研究发现增多的主要是CD4+CD26-T细胞，这些细胞表达CD25、CTLA4、OX40及CCR4，不表达Th1和Th2相关细胞因子白细胞介素（IL）-2、干扰素-γ、IL-13、IL-12B、IL-4、IL-5及CRTH2。另外，有研究也发现金属硫蛋白（MT）对于霍奇金淋巴瘤的分型有一定的帮助，NSHL与MCHL淋巴结中MT含量较其他亚型高[9]。国内朱梅刚等[10]发现，用CD21及CD35标记滤泡树突细胞（FDC）的存在对NSHL分型有一定的辅助诊断作用。
需要与之鉴别的纵隔疾病有：① 混合细胞型霍奇金淋巴瘤：临床与传染性单核细胞增多症有密切联系，病理形态炎症背景重、无纤维组织增生，原位杂交EBER（+）。② 霍奇金淋巴瘤样间变性大细胞性淋巴瘤：形态上与NSHL易混淆，免疫标记，CD30、ALK、EMA、CD25、CD43、CD45、perforin（+）而CD15、CD20、PAX-5（-）[11-12]。③ 纵隔灰区淋巴瘤：部分病例可出现类似于RS细胞形态的大细胞，免疫标记：CD20、CD45、CD30、CD15（+）[13]。④ 原发纵隔大B细胞性淋巴瘤：有泡状纤维分割肿瘤，可出现陷窝细胞样细胞，形态与NSHL极为相似，免疫标记：CD19、CD20、CD45及CD79α（+）而CD30（-）[14]。⑤ 胸腺瘤：当宽大的纤维结缔组织分隔胸腺组织时同样可形成大小不一的结节，但结节中无RS细胞或陷窝细胞，炎症背景中浆细胞与嗜酸性粒细胞少见，免疫标记上皮细胞CK、CD3、CD5及TdT（+）。⑥ 硬化性纵隔炎：纵隔NSHL纤维组织增生明显时极易被误诊为该病，因此若临床症状符合淋巴瘤表现，显微镜检查又观察到纤维组织增生、硬化，即使未查见陷窝细胞也应高度怀疑是NSHL；应连续切片或重新取材。⑦ 坏死性淋巴结炎：NSHL发生于纵隔时可出现坏死，使肿瘤的特征被掩盖从而导致误诊，应仔细在坏死灶边缘寻找陷窝细胞，其核仁通常较小，又易与组织细胞混淆，免疫标记CD30可区别（NSHL+，坏死性淋巴结炎-）。⑧ 还应与恶性纤维组织细胞瘤、转移性癌、精原细胞瘤等相鉴别，仔细寻找陷窝细胞及做免疫组化标记可提高诊断的准确性。
NSHL临床治疗多采用MOPP（氮芥、长春新碱、甲苄肼、泼尼松联合）或ABVD（多柔比星、博来霉素、长春花碱、氮烯唑胺联合）化疗方案为主，放疗为辅的方式；疾病早期局部放疗后行短期化疗，晚期通常采用单纯的长期化疗；对于早期治疗后复发者多采用自体干细胞移植联合高剂量化疗的方式；若自体干细胞移植联合高剂量化疗失败或不符合移植，则可考虑使用色瑞替尼注射液、姑息性化疗、同种异基因骨髓细胞移植等方法。
目前研究发现NSHL高表达细胞外基质类蛋白versican、fibulin-1、periostin及S100-A8，它们参与了肿瘤细胞的黏附过程，抑制其表达可降低肿瘤细胞的黏附性和转移率；这些蛋白是否能成为潜在的抗肿瘤侵袭的药物尚需进一步研究[5]。且NSHL是一种高遗传率的特殊疾病[15]，因此我们认为有必要对患者子女进行定期随访观察以便及时发现与治疗。
综上，本文对NSHL的病理学形态、免疫表型、分子生物学特征等进行分析，有利于病理医师进行早期诊断、避免漏诊和误诊，也可帮助临床判断化疗方案疗效；还能为靶向治疗药物的研发提供一些依据。
纵隔发生的霍奇金淋巴瘤绝大多数为结节硬化型，常表现为纵隔的巨大肿块，多数患者就诊时已为临床Ⅱ期症状。目前国内关于该疾病的报道较少，本文通过回顾性分析3例纵隔结节硬化型霍奇金淋巴瘤（NSHL）及复习文献，分析该疾病临床病理、免疫表型及分子生物学特征以提高对疾病的认识和诊断水平并为临床治疗提供帮助。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集成都军区总医院2003年－2012年纵隔NSHL手术切除3例患者的病历资料。其中，男1例，女2例，年龄25～29岁；病程1周～半年；其余一般资料见表 1。3例患者均由2名主任医师复核确诊，其影像学资料由成都军区总医院CT室提供。
表1
3例纵隔NSHL患者一般资料
1.2 方法
1.2.1 免疫标记及结果判定
3例手术切除标本均经4%中性甲醛固定、石蜡包埋切片、苏木精-伊红（HE）染色后制成4 μm常规HE染色切片；采用EnVision两步法按说明书进行免疫组织化学（免疫组化）标记[阴性对照采用磷酸缓冲盐溶液（PBS）]，所用一抗CD30、CD15、CD20、PAX-5、间变性淋巴瘤激酶（ALK）、CD45、细胞角蛋白（CK）、CD79α、S-100蛋白、Ki-67购于丹麦Dako公司。肿瘤细胞（陷窝细胞、RS细胞）的细胞膜和（或）细胞质、或细胞核着色判定为免疫标记阳性。
1.2.2 EB病毒编码小RNA（EBER）原位杂交及结果判定
石蜡切片脱蜡水化蛋白酶消化、再固定脱水后滴加含EBER探针的杂交液进行杂交，再经NBT-BCIP显色、甲基绿复染后观察细胞核着色情况；EBER（+）的淋巴瘤标本[标本来自成都军区总医院已确认的EBER（+）的淋巴瘤患者]作为阳性对照，PBS代替EBER探针作为空白对照。EBER原位杂交试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。细胞核呈蓝紫色判定为阳性。
1.2.3 T细胞受体（TCR）γ及IgH基因重排
石蜡切片脱蜡，采用微切割剔除RS隐窝型瘤细胞提取DNA，-20℃保存备用；TCRγ及IgH基因引物序列采用文献报道的BIOMED-2标准化序列[1]，交由重庆生博医学生物工程科技有限公司进行合成；将12.5 μL Mix、上下游引物各1 μL、DNA 1 μL及9.5 μL 重蒸水（共25 μL）混合经预变性及30个变性、退火及延伸循环[即聚合酶链反应（PCR）]扩增目的基因，产物放入琼脂糖凝胶中100 V电泳20～30 min后成像拍照；采用有TCRγ及IgH基因重排的淋巴瘤标本作为阳性对照（标本来自成都军区总医院已经确诊的有TCRγ及IgH基因重排的淋巴瘤患者），慢性淋巴结炎伴淋巴组织反应性增生标本作为空白对照组。
1.2.4 观察指标
3例患者病变的病理形态、免疫表型、EBER原位杂交和TCRγ及IgH基因重排。
2 结果
2.1 病理形态
① 大体标本检查：3例患者病变均表现为直径为6.5～13.0 cm的巨大瘤块，包膜增厚，切面灰白色、呈结节状、实性质软，其中1例局灶区域出现坏死。② 显微镜检查：3例患者病变均具有相似的病理形态（图 1～4）：胶原纤维显著增生成束状并分割淋巴组织，使原有的淋巴结结构被破坏，形成多个大小不一的结节；结节边缘见肿瘤细胞或合体细胞，细胞界清、细胞质空亮、单核或数目不等的小核仁，2例查见经典里德-斯德伯格（RS） 细胞，1例结节中出现坏死。结节背景有大量的炎细胞浸润，如浆细胞、嗜酸性细胞、小淋巴细胞等，其中1例还可见粉色胶质样渗出物；患者3的标本可见肿瘤细胞穿透淋巴结被膜侵犯肺组织。
图1
肿瘤组织镜下病理形态（HE ×100） 可见增生的胶原纤维组织分割淋巴组织 图 2 肿瘤组织镜下病理形态（HE ×400） 肿瘤细胞体积较小、分叶状单核、细胞质透明、细胞膜清晰，另见典型RS细胞 图 3肿瘤组织镜下病理形态（HE ×400） 结节背景有大量炎细胞浸润，嗜酸性粒细胞明显 图 4肿瘤组织镜下病理形态（HE ×200） 肿瘤背景中有较多粉色胶质样渗出物 图 5肿瘤细胞CD15免疫表型（EnVision法×400） 肿瘤细胞CD15细胞膜强（+） 图 6肿瘤细胞PAX-5免疫表型（EnVision法×200） 肿瘤细胞PAX-5细胞核（+）
2.2 免疫表型
3例标本中肿瘤细胞均表达CD15、CD30及PAX-5（图 5、6），部分肿瘤细胞表达CD20，均不表达ALK、CD45、CK、CD79α、S-100等标记（表 2）。
表2
3例纵隔NSHL患者免疫表型
2.3 原位杂交和基因重排
3例患者的肿瘤细胞EBER原位杂交均（-）。有TCRγ基因重排的标本在190 bp处出现阳性条带，有IgH基因重排的标本在110 bp处出现阳性条带，而纵隔NSHL在110 bp或190 bp处未出现阳性条带，提示纵隔NSHL无TCRγ及IgH基因单克隆重排（图 7）。
图7
肿瘤组织基因重排检测 PCR检测TCRγ及IgH基因重排（1：Marker；2：TCRγ阳性标本；3：肿瘤TCRγ基因；4：肿瘤IgH基因；5：IgH阳性标本；6：空白对照组）
3 讨论
NSHL是一种少见的B淋巴细胞性恶性肿瘤，常见于青年，好发于纵隔、颈部及锁骨上淋巴结，其次为脾脏和肺、骨、骨髓、肝[2]；其发病与染色体6p21.32的单核苷酸多态性（SNP）、人类疱疹病毒6型（HHV-6）感染有显著关系[3]；临床多表现为无痛性的纵隔、颈部或锁骨上淋巴结进行性肿大，也可出现发热盗汗、疲乏、消瘦、酒后局部皮肤瘙痒等非特异性症状；某些患者CT可观察到颈部、纵隔、肺门淋巴结肿大；临床现采用化学治疗（化疗）为主的放射治疗（放疗）、化疗综合治疗，预后较好。
NSHL具有诊断意义的3个组织学形态是：① 胶原纤维束增生明显，不同患者增生程度不同，这些组织在偏振光学显微镜下呈现绿色双折光性。② 淋巴组织被增生的胶原束分割成多个境界清楚的结节，结节中可有坏死和炎细胞浸润，淋巴结正常结构被破坏。③ 特征性的RS细胞不常见，更多见的是一种特殊类型的RS细胞，该细胞一般位于结节或是残存的淋巴滤泡周围、体积较小、分叶状单核或有多个小核仁、细胞质透明、细胞膜清晰，因甲醛固定后细胞质收缩、与周围组织间形成空间，细胞好似位于陷窝中，故称为“陷窝细胞”；陷窝细胞的核仁也可呈现多形性，这与病理组织中炎性成分的比例有关[4]。除典型的病理形态外，本文还在患者1的标本HE切片中观察到肿瘤背景中有较多的粉色胶质样渗出物，该物质与NSHL是否有关还需进一步研究。
NSHL免疫表型为CD30（+）、CD15（+）、CD20（-/+）、CD3（-）、CD45（-）、CD79α（-）、CK（-）、胎盘碱性磷酸酶（-）、S-100（-）、Melan-A（-）、上皮膜抗原（EMA）（-）、ALK（-）[5]；有研究借助免疫组化方法观察到T/B、CD4+/CD8+及GrB+/TIA-1+的细胞比值与NSHL的预后分别呈现正相关和负相关的关系[6]。Hudnall等[7]还发现EBV（-）的NSHL患者瘤组织中调节性T细胞数目增加，与经典霍奇金淋巴瘤其他亚型相比T/B细胞数比例最高；随后Ma等[8]进一步研究发现增多的主要是CD4+CD26-T细胞，这些细胞表达CD25、CTLA4、OX40及CCR4，不表达Th1和Th2相关细胞因子白细胞介素（IL）-2、干扰素-γ、IL-13、IL-12B、IL-4、IL-5及CRTH2。另外，有研究也发现金属硫蛋白（MT）对于霍奇金淋巴瘤的分型有一定的帮助，NSHL与MCHL淋巴结中MT含量较其他亚型高[9]。国内朱梅刚等[10]发现，用CD21及CD35标记滤泡树突细胞（FDC）的存在对NSHL分型有一定的辅助诊断作用。
需要与之鉴别的纵隔疾病有：① 混合细胞型霍奇金淋巴瘤：临床与传染性单核细胞增多症有密切联系，病理形态炎症背景重、无纤维组织增生，原位杂交EBER（+）。② 霍奇金淋巴瘤样间变性大细胞性淋巴瘤：形态上与NSHL易混淆，免疫标记，CD30、ALK、EMA、CD25、CD43、CD45、perforin（+）而CD15、CD20、PAX-5（-）[11-12]。③ 纵隔灰区淋巴瘤：部分病例可出现类似于RS细胞形态的大细胞，免疫标记：CD20、CD45、CD30、CD15（+）[13]。④ 原发纵隔大B细胞性淋巴瘤：有泡状纤维分割肿瘤，可出现陷窝细胞样细胞，形态与NSHL极为相似，免疫标记：CD19、CD20、CD45及CD79α（+）而CD30（-）[14]。⑤ 胸腺瘤：当宽大的纤维结缔组织分隔胸腺组织时同样可形成大小不一的结节，但结节中无RS细胞或陷窝细胞，炎症背景中浆细胞与嗜酸性粒细胞少见，免疫标记上皮细胞CK、CD3、CD5及TdT（+）。⑥ 硬化性纵隔炎：纵隔NSHL纤维组织增生明显时极易被误诊为该病，因此若临床症状符合淋巴瘤表现，显微镜检查又观察到纤维组织增生、硬化，即使未查见陷窝细胞也应高度怀疑是NSHL；应连续切片或重新取材。⑦ 坏死性淋巴结炎：NSHL发生于纵隔时可出现坏死，使肿瘤的特征被掩盖从而导致误诊，应仔细在坏死灶边缘寻找陷窝细胞，其核仁通常较小，又易与组织细胞混淆，免疫标记CD30可区别（NSHL+，坏死性淋巴结炎-）。⑧ 还应与恶性纤维组织细胞瘤、转移性癌、精原细胞瘤等相鉴别，仔细寻找陷窝细胞及做免疫组化标记可提高诊断的准确性。
NSHL临床治疗多采用MOPP（氮芥、长春新碱、甲苄肼、泼尼松联合）或ABVD（多柔比星、博来霉素、长春花碱、氮烯唑胺联合）化疗方案为主，放疗为辅的方式；疾病早期局部放疗后行短期化疗，晚期通常采用单纯的长期化疗；对于早期治疗后复发者多采用自体干细胞移植联合高剂量化疗的方式；若自体干细胞移植联合高剂量化疗失败或不符合移植，则可考虑使用色瑞替尼注射液、姑息性化疗、同种异基因骨髓细胞移植等方法。
目前研究发现NSHL高表达细胞外基质类蛋白versican、fibulin-1、periostin及S100-A8，它们参与了肿瘤细胞的黏附过程，抑制其表达可降低肿瘤细胞的黏附性和转移率；这些蛋白是否能成为潜在的抗肿瘤侵袭的药物尚需进一步研究[5]。且NSHL是一种高遗传率的特殊疾病[15]，因此我们认为有必要对患者子女进行定期随访观察以便及时发现与治疗。
综上，本文对NSHL的病理学形态、免疫表型、分子生物学特征等进行分析，有利于病理医师进行早期诊断、避免漏诊和误诊，也可帮助临床判断化疗方案疗效；还能为靶向治疗药物的研发提供一些依据。
