引用本文： 李扬, 黄巧容, 李雪, 曾婷婷, 朱焕玲, 孟文彤. 建立九色流式细胞术定量检测血浆中不同来源微粒. 华西医学, 2016, 31(12): 1989-1994. doi: 10.7507/1002-0179.201600546 复制
微粒是存在于血浆中的直径为0.1~1.0 μm的膜性小囊[1]，血小板、红细胞、内皮细胞、单核细胞、粒细胞和淋巴细胞等受到活化或凋亡刺激时均可产生微粒，其具有促凝、促炎症、促进血管生成和调节内皮功能等作用。不同来源的微粒与多种疾病的发生密切相关，如心血管疾病、肿瘤、糖尿病、免疫性疾病和感染等。抑制微粒产生，可作为特定疾病治疗新策略[1-4]。分析微粒的类型及数量的变化，可为诊断疾病及治疗监测提供一个潜在的和有用的工具[1]。检测微粒的方法较多，不同实验室的检测方法也不尽相同，如电子显微镜、酶联免疫吸附测定（ELISA）、蛋白质印迹法和流式细胞术等[2, 5-6]。近年来，流式细胞术逐渐成为检测微粒的首选方法，但用多色流式细胞术同时检测多种来源的微粒的报道少见，尚未见到使用多色流式细胞术同时检测红细胞、血小板、粒细胞、内皮细胞、单核细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞来源微粒的报道[4, 7]。我们建立了九色流式细胞术定量检测血浆中不同来源微粒的方法。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 一般资料
2014年12月-2015年1月收集10例正常成人的体检标本，年龄20~35岁，男女比例1:1，无高血压、高血脂、糖尿病及肿瘤性疾病史。另有2例糖尿病酮症酸中毒患者作稀释试验用，均为男性，年龄分别为45和57岁。
1.2 材料
Annexin-V和细胞表面抗体CD235a、CD41a、CD45、CD34、CD66b、CD20、CD3和CD14，均购自美国BD公司（抗体染色方案见表 1）。平均直径为10.0 μm的定量荧光微球（浓度1 045个/μL），购自美国Beckman Coulter公司；平均直径分别为0.22、0.45、0.88、1.34 μm的系列标准直径微球，直径范围分别为0.1~0.3 μm、0.4~0.6 μm、0.7~0.9 μm和1.0~1.9 μm，购自美国Spherotech公司。10×结合缓冲液（binding buffer），购自美国BD公司。
表1
九色流式细胞术分析微粒染色方案
1.3 方法
1.3.1 标本收集
所有血液标本均为采集空腹静脉血2.0 mL，枸橼酸钠抗凝。室温条件下，2 500×g离心10 min，取上清液，2 500×g再次离心10 min，取上清液于塑料试管中，得到乏血小板血浆（PPP），-80℃冰箱冻存。
1.3.2 单色染色
正常人的PPP准备9管，其中第1管作为空白对照。每管取PPP 10.0 μL，加入Annexin-V和10×结合缓冲液各1.0 μL，充分混匀后室温避光孵育10 min，然后按表 1方案在其中的8管中分别加入1种特异性抗体1.0 μL，空白对照管不加入特异性抗体，充分混匀后室温避光孵育20 min，再加入1×结合缓冲液130 μL，充分混匀后上流式细胞仪检测。分析时，利用前向散射FSA/Annexin-V设门，确定微粒群，对设门微粒取双对数参数分析补偿，并作相应调整。
1.3.3 缺一色染色
正常人PPP样品准备8管，按照1.3.2中操作步骤分别加入表 1方案中缺1个抗体的染色后上机检测。分析时，将缺一色染色与单色染色后各抗体的阳性微粒群比例进行比较，以该样品的单色染色目的微粒群阳性比例为靶值，计算缺一色染色中目的微粒群阳性比例变化值，计算方法为：变化值（%）=（单色染色阳性比例-缺一色染色阳性比例）/单色染色阳性比例×100%。
1.3.4 标本检测
取正常人PPP标本10.0 μL，加入Annexin-V和10×结合缓冲液各1.0 μL，充分混匀后室温避光孵育10 min；按表 1方案加入各种特异性抗体各1.0 μL，充分混匀后室温避光孵育20 min；加入1×结合缓冲液130 μL，再加入10.0 μL定量荧光微球（浓度1 045个/μL），充分混匀后上流式细胞仪（BD FACSAria）检测，低速获取至少记录1.5×105个颗粒，用FACSDiva（BD）软件分析数据。在每次实验时，均有1管不加抗体，而加入PPP、Annexin-V和标准直径微球（平均直径分别为0.22、0.45、0.88和1.34 μm），用于直径范围设定微粒门区域。
1.3.5 检测及分析
完成单色染色和缺一色染色，确定补偿和电压后，按照1.3.4中的操作步骤做正常人标本检测。确定不同来源微粒的流式细胞术分析策略如下（图 1）：①用平均直径分别为0.22、0.45、0.88、1.34 μm的标准直径荧光微球设定前向检测区，确定微粒大小（直径0.1~1.0 μm）；②以FSA/Annexin-V设门来确定微粒群；③微粒群中，以CD41a/CD235a设门分别确定血小板及红细胞来源，CD14/CD66b设门分别确定单核细胞及粒细胞来源，CD20/CD3设门分别确定B淋巴细胞及T淋巴细胞来源，CD34/CD45设门确定内皮细胞来源；④按照以下计算公式，分别计算不同来源微粒的绝对数：微粒绝对数（个/μL）=定量荧光微球浓度×不同来源荧光抗体阳性颗粒检测值/血浆稀释倍数×定量荧光微球检测值。
图1
不同来源微粒流式分析策略 a.用标准直径微球设定前向检测区，确定微粒大小范围；图中右上角可见用于定量分析的直径为10.0 μm的标准数量微球b. FSA/Annexin-V设门来确定微粒群c.微粒群中，CD41a/CD235a设门分别确定血小板及红细胞来源微粒d. CD14/CD66b设门分别确定单核细胞及粒细胞来源微粒e. CD20/CD3设门分别确定B淋巴细胞及T淋巴细胞来源微粒f. CD34/D45设门确定内皮细胞来源微粒
1.4 方法学评价
1.4.1 重复试验
在相同的实验条件下按1.3.4中步骤重复测定同一PPP标本10次，再按1.3.5中策略进行分析，求出各种不同来源微粒的浓度均数及变异系数。
1.4.2 稀释试验
筛选出血小板和红细胞来源微粒浓度分别较高的2例糖尿病酮症酸中毒患者PPP标本，其中血小板来源微粒浓度较高的PPP用磷酸盐缓冲液连续对倍稀释8个梯度（1/1，1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，1/128），做血小板来源微粒稀释试验用；红细胞来源微粒浓度较高的PPP标本用磷酸盐缓冲液连续对倍稀释5个梯度（1/1，1/2，1/4，1/8，1/16），做红细胞来源微粒稀释试验用。按1.3.4中步骤上流式细胞仪检测，再按1.3.5中策略进行分析，以PPP稀释度为横坐标，分别以血小板和红细胞来源微粒浓度为纵坐标作图。
2 结果
2.1 单色染色
分别作了Annexin-V和8种抗体的单色染色，确定了检测电压并调节荧光补偿，各荧光检测通路间信号检测无影响，见图 2。
图2
CD41a-FITC单色染色实验 a~g.分别表示CD41a-FITC阳性微粒对PE、PE-Cy7、PE-CF594、PerCP-Cy5.5、APC-Cy7、BV421、BV510的荧光检测通路的信号无影响
2.2 缺一色染色
比较了3例正常成人的PPP标本分别用8种抗体单色染色及缺一色染色中的阳性微粒群比例变化（表 2），其中CD41a为（2.2±1.1）%，变化最小，变化较大的是CD3和CD14，分别为（12.1±2.7）%和（12.7±0.8）%，但这些变化均＜15%，表明方案中使用的各抗体的相互作用小。
表2
缺一色与单色染色中各抗体阳性微粒群比例变化的比较（n=3，x±s，%）
2.3 检测并分析标本
检测10例正常成人的PPP标本，分别计算出标本不同来源微粒的浓度均数及实际检测范围。见表 3。
表3
正常成人PPP标本不同来源微粒平均浓度及实际检测范围（n=10，个/μL）
2.4 方法学评价
2.4.1 重复试验
红细胞、血小板和粒细胞来源微粒的变异系数均＜10%；内皮细胞、单核细胞、B淋巴细胞及T淋巴细胞来源微粒的变异系数均＞10%，但均＜20%，体现了其具有较好的稳定性。见表 4。
表4
10次微粒浓度重复试验结果（n=10）
2.4.2 稀释试验
将PPP标本系列对倍稀释后，分别进行了血小板和红细胞来源微粒检测并作微粒浓度和稀释度的相关性分析，其直线相关系数分别为0.999 6和0.995 4，有良好的线性关系，见图 3、4。
图3
血小板来源微粒稀释试验
图4
红细胞来源微粒稀释试验
3 讨论
微粒是哺乳动物细胞在不同因素作用下，细胞膜内层带有负电荷的磷脂酰丝氨酸翻转暴露于膜外层，细胞膜向外伸展变形，以出芽的方式形成小泡或伪足脱落进入微循环中形成微粒[1]。微粒的直径为0.1~1.0 μm，其检测方法较多，不同实验室的方法也不尽相同，如电子显微镜、ELISA、蛋白质印迹法和流式细胞术等[2, 5-6]。与流式细胞术相比，电子显微镜能准确检测微粒大小及形态，但操作繁琐，且不能确定微粒的来源和进行定量分析[2]；ELISA能确定微粒的来源和进行定量分析，但却不能将微粒与标本中混入的细胞、凋亡小体和其他细胞外小囊泡进行区分[7]；蛋白质免疫法为半定量分析，灵敏度低，适合于微粒含量高的标本[6]。随着流式细胞术及单克隆抗体技术的发展，流式细胞术在对微粒的定性及定量研究等方面展现出明显优势，其检测方便快速，能识别微粒来源，已成为研究微粒的首选方法[7-8]。近年来，基于能同时检测6种及以上不同荧光的多色流式分析技术逐渐运用到临床领域，并显示了其强大的分析功能和适宜性[9-10]。在微粒的检测分析中，高通量的多色流式分析技术与常规流式分析技术（6色以下）相比有明显优势：其不仅能提高识别微粒的准确性，而且处理的管数减少，节约了样本及抗体用量、上样检测及处理样本时间，能更有效地计数大量微粒，并便于实验标准化。目前微粒的流式检测方法并未标准化，不同的实验室采用不同的抗体组合来分析特定疾病中的微粒，然而多数的抗体组合都包含相似的骨干抗体，因而可总结出标准化的微粒流式检测方案[8]。
目前检测微粒使用的血浆标本有3种：富血小板血浆、PPP和无血小板血浆。本实验采用抗凝血2 500×g离心2次后取上清液，得到PPP后于-80℃冰箱冻存。该方法操作简便快捷，便于标本储存，是多数实验室常用的方法[11]。多色流式细胞术检测微粒是基于微粒大小及表面含有的亲本细胞抗原，通过识别表面抗原的荧光抗体对各种微粒进行鉴别[8]。由于同一种细胞表面可表达多种特异性抗原，且亲本细胞及其来源的微粒细胞表面抗原分布存在差异，因此不同的实验室之间选用的荧光抗体也有差别[7-8, 11-12]。本实验采用的检测微粒选用8种抗体：CD235a（红细胞）、CD41a（血小板）、CD14（单核细胞）、CD66b（粒细胞）、CD20（B淋巴细胞）、CD3（T淋巴细胞）、CD45和CD34（内皮细胞），这些抗体对应的抗原稳定性好，均在亲本细胞及其微粒表面特异性强表达或无表达[7-8, 13]。采用的大部分抗体与其他实验室一致[8]，不同的是针对内皮细胞的抗体，在不同实验室基于不同实验目的存在较大差异，如CD31、CD51、CD105、CD144、CD146等[5, 7-8, 12]，但这几种抗原在其他细胞表面也存在不同程度的异质性表达[8, 13-14]，不能完全反映内皮来源微粒；而CD45-和CD34+能更好地鉴别内皮细胞及其来源微粒[14]，故本实验选用CD45- CD34+作为内皮来源微粒的标记。本实验采用在一个样品管同时测定血小板、红细胞、内皮细胞、单核细胞、粒细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞来源的微粒。先用标准直径微球设定前向检测区，确定微粒大小（直径0.1~1.0 μm），再用Annexin-V阳性确定微粒，针对不同细胞表面抗原的特异性荧光抗体确定微粒来源。由于要检测9种荧光，使荧光之间的相互干扰较强，荧光补偿的调节复杂，需要对方案中的抗体进行单色染色来确定荧光补偿；同时使用抗体数量增加，抗体间相互作用的机会也伴随增加，利用缺一色染色来确定抗体间的相互作用，比较实验中缺一色时各阳性微粒群的比例和平均荧光强度的变化，观察抗体间的是否作用及强度[15-16]。结果显示3例正常成人的PPP标本缺一色染色中阳性微粒群比例变化均＜15%，表明方案中使用的各抗体的相互作用小且具有较强的稳定性。
另外，在稀释试验中，血小板及红细胞来源微粒实测最小浓度分别为17、13个/μL；同时，检测都呈现了良好的直线相关性。在重复试验中，红细胞、血小板、粒细胞来源微粒的变异系数均＜10%，内皮细胞、单核细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞来源微粒的变异系数均＞10%但＜20%，也体现了较好的稳定性；其中内皮细胞、单核细胞、B淋巴细胞和T淋巴来源微粒变异系数＞10%，主要是因为它们在PPP中绝对含量低，也受到常规流式细胞仪光学系统设计的限制所致。目前有高速荧光检测和颗粒照相技术的有效组合的影像流式细胞术，可根据拍摄颗粒的像素来确定微粒的大小，克服常规流式光电系统检测限制的不足，提高实验稳定性，但该仪器2007年开始商业提供，且设备昂贵，目前很少有临床实验室采用[8, 17]。用建立的九色方案检测了10例正常人的PPP标本，均检测到了血小板、红细胞、内皮细胞、单核细胞、粒细胞、B淋巴细胞及T淋巴细胞来源微粒，其中血小板来源微粒浓度为60.6~288.9个/μL，平均132.6个/μL。Yuana等[11]采用同样的离心方法得到PPP，用CD41作为血小板来源微粒的标记，测得的正常人血小板来源微粒平均浓度为63~291个/μL，平均141个/μL，本实验与其结果具有一致性。
综上所述，我们成功建立了九色流式细胞术定量检测人血浆中不同来源微粒的实验方案，该方法简单实用，适合临床推广应用。
微粒是存在于血浆中的直径为0.1~1.0 μm的膜性小囊[1]，血小板、红细胞、内皮细胞、单核细胞、粒细胞和淋巴细胞等受到活化或凋亡刺激时均可产生微粒，其具有促凝、促炎症、促进血管生成和调节内皮功能等作用。不同来源的微粒与多种疾病的发生密切相关，如心血管疾病、肿瘤、糖尿病、免疫性疾病和感染等。抑制微粒产生，可作为特定疾病治疗新策略[1-4]。分析微粒的类型及数量的变化，可为诊断疾病及治疗监测提供一个潜在的和有用的工具[1]。检测微粒的方法较多，不同实验室的检测方法也不尽相同，如电子显微镜、酶联免疫吸附测定（ELISA）、蛋白质印迹法和流式细胞术等[2, 5-6]。近年来，流式细胞术逐渐成为检测微粒的首选方法，但用多色流式细胞术同时检测多种来源的微粒的报道少见，尚未见到使用多色流式细胞术同时检测红细胞、血小板、粒细胞、内皮细胞、单核细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞来源微粒的报道[4, 7]。我们建立了九色流式细胞术定量检测血浆中不同来源微粒的方法。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 一般资料
2014年12月-2015年1月收集10例正常成人的体检标本，年龄20~35岁，男女比例1:1，无高血压、高血脂、糖尿病及肿瘤性疾病史。另有2例糖尿病酮症酸中毒患者作稀释试验用，均为男性，年龄分别为45和57岁。
1.2 材料
Annexin-V和细胞表面抗体CD235a、CD41a、CD45、CD34、CD66b、CD20、CD3和CD14，均购自美国BD公司（抗体染色方案见表 1）。平均直径为10.0 μm的定量荧光微球（浓度1 045个/μL），购自美国Beckman Coulter公司；平均直径分别为0.22、0.45、0.88、1.34 μm的系列标准直径微球，直径范围分别为0.1~0.3 μm、0.4~0.6 μm、0.7~0.9 μm和1.0~1.9 μm，购自美国Spherotech公司。10×结合缓冲液（binding buffer），购自美国BD公司。
表1
九色流式细胞术分析微粒染色方案
1.3 方法
1.3.1 标本收集
所有血液标本均为采集空腹静脉血2.0 mL，枸橼酸钠抗凝。室温条件下，2 500×g离心10 min，取上清液，2 500×g再次离心10 min，取上清液于塑料试管中，得到乏血小板血浆（PPP），-80℃冰箱冻存。
1.3.2 单色染色
正常人的PPP准备9管，其中第1管作为空白对照。每管取PPP 10.0 μL，加入Annexin-V和10×结合缓冲液各1.0 μL，充分混匀后室温避光孵育10 min，然后按表 1方案在其中的8管中分别加入1种特异性抗体1.0 μL，空白对照管不加入特异性抗体，充分混匀后室温避光孵育20 min，再加入1×结合缓冲液130 μL，充分混匀后上流式细胞仪检测。分析时，利用前向散射FSA/Annexin-V设门，确定微粒群，对设门微粒取双对数参数分析补偿，并作相应调整。
1.3.3 缺一色染色
正常人PPP样品准备8管，按照1.3.2中操作步骤分别加入表 1方案中缺1个抗体的染色后上机检测。分析时，将缺一色染色与单色染色后各抗体的阳性微粒群比例进行比较，以该样品的单色染色目的微粒群阳性比例为靶值，计算缺一色染色中目的微粒群阳性比例变化值，计算方法为：变化值（%）=（单色染色阳性比例-缺一色染色阳性比例）/单色染色阳性比例×100%。
1.3.4 标本检测
取正常人PPP标本10.0 μL，加入Annexin-V和10×结合缓冲液各1.0 μL，充分混匀后室温避光孵育10 min；按表 1方案加入各种特异性抗体各1.0 μL，充分混匀后室温避光孵育20 min；加入1×结合缓冲液130 μL，再加入10.0 μL定量荧光微球（浓度1 045个/μL），充分混匀后上流式细胞仪（BD FACSAria）检测，低速获取至少记录1.5×105个颗粒，用FACSDiva（BD）软件分析数据。在每次实验时，均有1管不加抗体，而加入PPP、Annexin-V和标准直径微球（平均直径分别为0.22、0.45、0.88和1.34 μm），用于直径范围设定微粒门区域。
1.3.5 检测及分析
完成单色染色和缺一色染色，确定补偿和电压后，按照1.3.4中的操作步骤做正常人标本检测。确定不同来源微粒的流式细胞术分析策略如下（图 1）：①用平均直径分别为0.22、0.45、0.88、1.34 μm的标准直径荧光微球设定前向检测区，确定微粒大小（直径0.1~1.0 μm）；②以FSA/Annexin-V设门来确定微粒群；③微粒群中，以CD41a/CD235a设门分别确定血小板及红细胞来源，CD14/CD66b设门分别确定单核细胞及粒细胞来源，CD20/CD3设门分别确定B淋巴细胞及T淋巴细胞来源，CD34/CD45设门确定内皮细胞来源；④按照以下计算公式，分别计算不同来源微粒的绝对数：微粒绝对数（个/μL）=定量荧光微球浓度×不同来源荧光抗体阳性颗粒检测值/血浆稀释倍数×定量荧光微球检测值。
图1
不同来源微粒流式分析策略 a.用标准直径微球设定前向检测区，确定微粒大小范围；图中右上角可见用于定量分析的直径为10.0 μm的标准数量微球b. FSA/Annexin-V设门来确定微粒群c.微粒群中，CD41a/CD235a设门分别确定血小板及红细胞来源微粒d. CD14/CD66b设门分别确定单核细胞及粒细胞来源微粒e. CD20/CD3设门分别确定B淋巴细胞及T淋巴细胞来源微粒f. CD34/D45设门确定内皮细胞来源微粒
1.4 方法学评价
1.4.1 重复试验
在相同的实验条件下按1.3.4中步骤重复测定同一PPP标本10次，再按1.3.5中策略进行分析，求出各种不同来源微粒的浓度均数及变异系数。
1.4.2 稀释试验
筛选出血小板和红细胞来源微粒浓度分别较高的2例糖尿病酮症酸中毒患者PPP标本，其中血小板来源微粒浓度较高的PPP用磷酸盐缓冲液连续对倍稀释8个梯度（1/1，1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，1/128），做血小板来源微粒稀释试验用；红细胞来源微粒浓度较高的PPP标本用磷酸盐缓冲液连续对倍稀释5个梯度（1/1，1/2，1/4，1/8，1/16），做红细胞来源微粒稀释试验用。按1.3.4中步骤上流式细胞仪检测，再按1.3.5中策略进行分析，以PPP稀释度为横坐标，分别以血小板和红细胞来源微粒浓度为纵坐标作图。
2 结果
2.1 单色染色
分别作了Annexin-V和8种抗体的单色染色，确定了检测电压并调节荧光补偿，各荧光检测通路间信号检测无影响，见图 2。
图2
CD41a-FITC单色染色实验 a~g.分别表示CD41a-FITC阳性微粒对PE、PE-Cy7、PE-CF594、PerCP-Cy5.5、APC-Cy7、BV421、BV510的荧光检测通路的信号无影响
2.2 缺一色染色
比较了3例正常成人的PPP标本分别用8种抗体单色染色及缺一色染色中的阳性微粒群比例变化（表 2），其中CD41a为（2.2±1.1）%，变化最小，变化较大的是CD3和CD14，分别为（12.1±2.7）%和（12.7±0.8）%，但这些变化均＜15%，表明方案中使用的各抗体的相互作用小。
表2
缺一色与单色染色中各抗体阳性微粒群比例变化的比较（n=3，x±s，%）
2.3 检测并分析标本
检测10例正常成人的PPP标本，分别计算出标本不同来源微粒的浓度均数及实际检测范围。见表 3。
表3
正常成人PPP标本不同来源微粒平均浓度及实际检测范围（n=10，个/μL）
2.4 方法学评价
2.4.1 重复试验
红细胞、血小板和粒细胞来源微粒的变异系数均＜10%；内皮细胞、单核细胞、B淋巴细胞及T淋巴细胞来源微粒的变异系数均＞10%，但均＜20%，体现了其具有较好的稳定性。见表 4。
表4
10次微粒浓度重复试验结果（n=10）
2.4.2 稀释试验
将PPP标本系列对倍稀释后，分别进行了血小板和红细胞来源微粒检测并作微粒浓度和稀释度的相关性分析，其直线相关系数分别为0.999 6和0.995 4，有良好的线性关系，见图 3、4。
图3
血小板来源微粒稀释试验
图4
红细胞来源微粒稀释试验
3 讨论
微粒是哺乳动物细胞在不同因素作用下，细胞膜内层带有负电荷的磷脂酰丝氨酸翻转暴露于膜外层，细胞膜向外伸展变形，以出芽的方式形成小泡或伪足脱落进入微循环中形成微粒[1]。微粒的直径为0.1~1.0 μm，其检测方法较多，不同实验室的方法也不尽相同，如电子显微镜、ELISA、蛋白质印迹法和流式细胞术等[2, 5-6]。与流式细胞术相比，电子显微镜能准确检测微粒大小及形态，但操作繁琐，且不能确定微粒的来源和进行定量分析[2]；ELISA能确定微粒的来源和进行定量分析，但却不能将微粒与标本中混入的细胞、凋亡小体和其他细胞外小囊泡进行区分[7]；蛋白质免疫法为半定量分析，灵敏度低，适合于微粒含量高的标本[6]。随着流式细胞术及单克隆抗体技术的发展，流式细胞术在对微粒的定性及定量研究等方面展现出明显优势，其检测方便快速，能识别微粒来源，已成为研究微粒的首选方法[7-8]。近年来，基于能同时检测6种及以上不同荧光的多色流式分析技术逐渐运用到临床领域，并显示了其强大的分析功能和适宜性[9-10]。在微粒的检测分析中，高通量的多色流式分析技术与常规流式分析技术（6色以下）相比有明显优势：其不仅能提高识别微粒的准确性，而且处理的管数减少，节约了样本及抗体用量、上样检测及处理样本时间，能更有效地计数大量微粒，并便于实验标准化。目前微粒的流式检测方法并未标准化，不同的实验室采用不同的抗体组合来分析特定疾病中的微粒，然而多数的抗体组合都包含相似的骨干抗体，因而可总结出标准化的微粒流式检测方案[8]。
目前检测微粒使用的血浆标本有3种：富血小板血浆、PPP和无血小板血浆。本实验采用抗凝血2 500×g离心2次后取上清液，得到PPP后于-80℃冰箱冻存。该方法操作简便快捷，便于标本储存，是多数实验室常用的方法[11]。多色流式细胞术检测微粒是基于微粒大小及表面含有的亲本细胞抗原，通过识别表面抗原的荧光抗体对各种微粒进行鉴别[8]。由于同一种细胞表面可表达多种特异性抗原，且亲本细胞及其来源的微粒细胞表面抗原分布存在差异，因此不同的实验室之间选用的荧光抗体也有差别[7-8, 11-12]。本实验采用的检测微粒选用8种抗体：CD235a（红细胞）、CD41a（血小板）、CD14（单核细胞）、CD66b（粒细胞）、CD20（B淋巴细胞）、CD3（T淋巴细胞）、CD45和CD34（内皮细胞），这些抗体对应的抗原稳定性好，均在亲本细胞及其微粒表面特异性强表达或无表达[7-8, 13]。采用的大部分抗体与其他实验室一致[8]，不同的是针对内皮细胞的抗体，在不同实验室基于不同实验目的存在较大差异，如CD31、CD51、CD105、CD144、CD146等[5, 7-8, 12]，但这几种抗原在其他细胞表面也存在不同程度的异质性表达[8, 13-14]，不能完全反映内皮来源微粒；而CD45-和CD34+能更好地鉴别内皮细胞及其来源微粒[14]，故本实验选用CD45- CD34+作为内皮来源微粒的标记。本实验采用在一个样品管同时测定血小板、红细胞、内皮细胞、单核细胞、粒细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞来源的微粒。先用标准直径微球设定前向检测区，确定微粒大小（直径0.1~1.0 μm），再用Annexin-V阳性确定微粒，针对不同细胞表面抗原的特异性荧光抗体确定微粒来源。由于要检测9种荧光，使荧光之间的相互干扰较强，荧光补偿的调节复杂，需要对方案中的抗体进行单色染色来确定荧光补偿；同时使用抗体数量增加，抗体间相互作用的机会也伴随增加，利用缺一色染色来确定抗体间的相互作用，比较实验中缺一色时各阳性微粒群的比例和平均荧光强度的变化，观察抗体间的是否作用及强度[15-16]。结果显示3例正常成人的PPP标本缺一色染色中阳性微粒群比例变化均＜15%，表明方案中使用的各抗体的相互作用小且具有较强的稳定性。
另外，在稀释试验中，血小板及红细胞来源微粒实测最小浓度分别为17、13个/μL；同时，检测都呈现了良好的直线相关性。在重复试验中，红细胞、血小板、粒细胞来源微粒的变异系数均＜10%，内皮细胞、单核细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞来源微粒的变异系数均＞10%但＜20%，也体现了较好的稳定性；其中内皮细胞、单核细胞、B淋巴细胞和T淋巴来源微粒变异系数＞10%，主要是因为它们在PPP中绝对含量低，也受到常规流式细胞仪光学系统设计的限制所致。目前有高速荧光检测和颗粒照相技术的有效组合的影像流式细胞术，可根据拍摄颗粒的像素来确定微粒的大小，克服常规流式光电系统检测限制的不足，提高实验稳定性，但该仪器2007年开始商业提供，且设备昂贵，目前很少有临床实验室采用[8, 17]。用建立的九色方案检测了10例正常人的PPP标本，均检测到了血小板、红细胞、内皮细胞、单核细胞、粒细胞、B淋巴细胞及T淋巴细胞来源微粒，其中血小板来源微粒浓度为60.6~288.9个/μL，平均132.6个/μL。Yuana等[11]采用同样的离心方法得到PPP，用CD41作为血小板来源微粒的标记，测得的正常人血小板来源微粒平均浓度为63~291个/μL，平均141个/μL，本实验与其结果具有一致性。
综上所述，我们成功建立了九色流式细胞术定量检测人血浆中不同来源微粒的实验方案，该方法简单实用，适合临床推广应用。
