引用本文： 梅亚君, 秦永平, 章丽, 南峰, 向瑾, 余勤, 梁茂植. 高效液相色谱-串联质谱法测定人血清中伏立诺他及其M2代谢物浓度. 华西医学, 2016, 31(2): 278-282. doi: 10.7507/1002-0179.20160075 复制
组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂可以允许蛋白质的重新表达，促进细胞凋亡和细胞分化而抑制细胞循环和细胞分裂[1-5]。因其具有广谱低毒和靶向性的特点成为近年来抗肿瘤药物研究领域中的热点之一[6-8]。伏立诺他（SHA）用于治疗加重、持续和复发或2种全身性用药治疗后无效的皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL），是德国Merck公司开发的世界上第一个抑制HDAC的新型抗肿瘤药物[9-11]，2006年10月被美国食品和药物管理局（FDA）批准上市。有研究显示，SHA可通过诱导细胞凋亡、分化和抑制细胞周期以及增加肿瘤抑制基因的表达来抑制胰腺癌细胞的增长[12]。此外，还发现SHA治疗慢性B细胞复发性淋巴瘤[13]、抑制HCT-116结肠癌细胞增殖和诱导组蛋白高度乙酰化从而治疗结肠癌[14]、治疗转移性头颈癌[15]。有关生物样品中SHA及其代谢物的测定方法国外文献报道较多而国内较少。杜晓琅等[16]采用高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS），对血清样品采用甲醇直接沉淀蛋白法，尿液直接稀释进样，测定了血清及尿液中SHA和M2代谢物的浓度。Du等[17]采用HPLC-MS/MS法实行在线萃取SHA及代谢物。Parise等[18]用HPLC-MS/MS法乙腈沉淀蛋白、梯度洗脱方法测定SHA及代谢物浓度。本文液-液萃取法建立了灵敏、准确的测定血清中SHA及其主要代谢物M2的HPLC-MS/MS分析方法，已用于其人体药物代谢动力学研究预实验。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 仪器
日本岛津公司SL-HTC系列高效液相色谱仪（HPLC，含系统控制器，全自动进样器）；美国ABI公司API 3000型LC-MS/MS液质联用系统（含 Analyst1.4色谱工作站）；德国Eppendorf公司 Centrifuge 5810R 型台式低温离心机。
1.2 试剂
SHA对照品（北京福瑞康正医药技术研究所，含量：＞99.5%，批号：20130318）；M2代谢物对照品（中国食品药品检定研究所，含量：98%，批号：100095-201205）；d5-SHA对照品（加拿大TRC公司，含量：98.6%，批号：6-PTR-92-2）；乙腈、甲醇、异丙醇为色谱纯；其余试剂为分析纯，其中乙醚在用前景重蒸馏后使用，实验用纯水由美国Millipore公司Milli-Q型超纯水器制备所得。
1.3 方法
1.3.1 色谱与质谱条件
采用Gemini C18（50 mm×3.0 mm，3 µm）分析柱，流动相为甲醇︰乙腈︰水︰1 mol/L氨水︰甲酸（25︰15︰60︰0.1︰0.05），流速0.23 mL/min，柱温为40 ℃。质谱检测采用电喷雾离子源，多反应离子监测模式检测，喷雾电压为5 000 V；干燥气流速7 L/min、温度为450℃，碰撞气为7 psi，雾化气为8 psi，气帘气为7 psi；离子去簇电压为20 V；环形聚焦电压为57 V；SHA、M2和内标d5-SHA 的监测离子对m/z分别为265.2/232.2、194.1/176.1和270.3/237.3，碰撞室射出电压分别为5、9和5 V，碰撞诱导解离电压分别为17、16和18 V，入口电压分别为7、5和7 V。
1.3.2 溶液配制
① SHA储备液配制。精密称取SHA对照品10.0 mg于50 mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，即得SHA储备液（200 μg/mL），置4℃冰箱保存。
② M2代谢物储备液配制。精密称量M2对照品10.2 mg（相当于M2为10 mg）于50 mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，即得M2储备液（200 μg/mL），置4 ℃冰箱保存。
③ d5-SHA储备液（内标）及工作液配制。用十万分之一电子分析天平采用减重称量法精密称量d5-SHA对照品1.0 mg，置100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀即得d5-SHA储备液（10 μg/mL），置4℃冰箱保存。临用前用流动相稀释至400 μg/L使用。
④ SHA及M2标准曲线工作液配制。取1.0 mL SHA储备液（200 µg/mL）和2.0 mL M2储备液（200 µg/mL）于100 mL容量瓶，加入50%甲醇定容至刻度即得标准曲线最高管工作液（SHA 2 000 ng/mL，M2 4 000 ng/mL），以后各浓度管用50%甲醇依次稀释即得。
1.3.3 血清样品的预处理
取配制好的血清样品200 μL，加入50%甲醇100 μL、内标工作液（400 ng/mL）100 μL、0.5 mol/L盐酸溶液100 μL，混匀后加3.5 mL含3%异丙醇的重蒸乙醚涡旋混合5 min，4 ℃离心8 min（3 000 r/min），转上层液于尖底管中，置40 ℃水浴通空气流挥干。残渣用50 μL流动相复溶，进样10 μL。记录SHA、M2及内标色谱峰面积，以SHA、M2与内标的峰面积之比（y）带入相应的标准曲线上求算血清浓度。
1.3.4 方法专属性考察
分别取6个不同个体的空白血清各200 μL，加入100 μL 50%甲醇、100 μL流动相后按前述血清样品的预处理中的“加入0.5 mol/L盐酸溶液100 μL”起，同法操作，进样10 μL；进样对照品溶液10 μL；按前述血清样品的预处理方法处理空白血清加对照品溶液以及受试者血清样品，观察空白血清中的杂质是否干扰样品的测定。
1.3.5 线性关系及最低定量限考察
分别取空白血清200 μL 9份，依次加入SHA及M2标准系列工作液各100 μL，使SHA血浆浓度分别为1 000、500、250、100、50、25、10、2.5、1 μg/L，M2血浆浓度分别为2 000、1 000、500、200、100、50、20、5、2 μg/L，加入内标工作液100 μL，再加入50%甲醇 100 μL，按前述血清样品的预处理中的“加入0.5 mol/L盐酸溶液100 μL”起，同法操作，进样10 μL。记录药物及内标色谱峰面积，以二者峰面积之比（y）对SHA和M2代谢物血清浓度（x）进行加权（1/c2）（c指权重系数）线性回归。
1.3.6 精密度和方法回收率考察
取空白血清加SHA和M2工作液配制成低（2和4 ng/mL）、中（100和200 ng/mL）、高（800和1 600 ng/mL）3个浓度样品，于同日内连续测定5次，计算其方法回收率和批内相对标准偏差（RSD）。于1周内同法测定3批每批5次，计算其批间RSD。
1.3.7 萃取回收率及基质效应考察
取空白血清加SHA和M2工作液配制成低、中和高3个浓度样品，每种浓度3份，按前述血清样品预处理方法中的自“加入50%甲醇100 μL”起同法操作后进样。分别得到SHA和M2的峰面积A，同时分别取与血清样品高、中和低3个浓度相同量的SHA和M2标准工作液于尖底管挥干，流动相复溶，先直接进样得SHA和M2的峰面积B，再将溶液复溶加入预处理后的空白血清管，充分混合后进样得SHA和M2的峰面积C。将所得峰面积A与峰面积C比较，计算低、中和高浓度SHA和M2的预处理回收率，公式为：预处理回收率=A/C×100%；将所得峰面积C与峰面积B比较，计算SHA和M2的基质效应，公式为：基质效应=（C-B）/B×100%。
1.3.8 稳定性考察
取空白血清加SHA和M2工作液配制成低、中和高3个浓度样品，根据实际样品测定过程中可能涉及到的样品稳定性，分别对比考察样品在-35℃冰箱中放置0、42、62 d，室温放置0、2、6 h，反复冻融0、1、2、3次取样测定，萃取物在4℃冰箱放置0、12、24、36 h，样品处理后立即溶解进样，然后同一样品重复进样1次和2次，样品经处理后进样室（8℃）放置0、8、16 h后进样的稳定性。
1.4 方法应用
将本法用于2例CTCL患者餐后单次口服SHA 200 mg的药物代谢动力学预试验，绘制其SHA和M2代谢物的血药浓度-时间曲线（药时曲线）。
2 结果
2.1 方法专属性
SHA、M2和内标的保留时间分别为4.31、3.22、4.23 min。测定了6个不同个体的空白血清，血清中杂质均不干扰SHA、M2和d5-SHA的测定。空白血清、对照品、空白血清加对照品及样品的色谱图见图 1～4。
图1
空白血清色谱图 1a. SHA 1b. M2 1c. 内标 图 2对照品色谱图 2a. SHA 2b. M2 2c. 内标 图 3空白血清+对照品色谱图 3a. SHA 3b. M2 3c. 内标 图 4受试者血清样本色谱图 4a. SHA 4b. M2 4c. 内标
2.2 线性关系及最低定量限
SHA和M2的血清标准曲线回归方程分别为y=0.005 06x+0.000 11（r=0.999 7）和y=0.006 33x+0.011 6（r=0.997 8）。结果显示，SHA和M2分别在1～1 000 μg/L和2～2 000 μg/L范围标准曲线线性良好。最低定量限分别为1和2 ng/mL，其准确度及精密度均符合相关规定。
2.3 精密度和方法回收率
SHA及M2低、中、高浓度的方法回收率均合格，批内RSD及批间RSD均＜15%，符合要求。见表1。
2.4 萃取回收率及基质效应
SHA和M2低、中、高浓度的预处理回收率分别为56.77%～73.96%、72.51%～79.75%。SHA和M2的基质效应分别为-7.08%～-1.95%和-8.72%～-0.33%。
2.5 血清样品稳定性
血清样品在冰箱冷冻保存63 d，反复冻融3次，在室温放置6 h后测定与未保存、未冻融和未放置样品测定结果无明显差异，处理后的样品在进样室（8℃）放置16 h进样、萃取物在冰箱（4℃）中放置36 h，重复进样测定2次与0时刻值比较变化率 均＜15%，稳定性符合要求。
2.6 方法应用
2例患者SHA和M2代谢物的药时曲线见图 5、6。可见二者的药时曲线差异较大，原因可能是受试者为CTCL患者，自身的个体差异较大所致。
图5
1号受试者给药后SHA及M2代谢物药时曲线图
图6
2号受试者给药后SHA和M2的药时曲线图
3 讨论
3.1 流动相的选择
本次试验分别考察了甲醇和乙腈的流动相，结果显示甲醇为流动相时，药物及其代谢物响应值显著高于乙腈为流动相，但在单独使用甲醇有机相时，M2代谢物出峰前有一明显的杂质峰且不能完全分开，加入少量乙腈，M2代谢物出峰处没有杂质峰的干扰，经考察不同甲醇、乙腈比例发现25%甲醇-15%乙腈作为有机相比例，基质效应合格且优于单用甲醇或乙腈作为有机相的流动相。试验中还发现若流动相中不加甲酸，M2代谢物在10 min中内未出峰。考察加入不同量甲酸情况，选择加入0.05%甲酸效果较好。同时在流动相中加入少量氨水可以改善峰形及响应，最终确定本研究所用流动相。
3.2 预处理条件的选择
文献多采用直接沉淀蛋白进样，杜晓琅等[16]和Parise等[18]报道分别采用甲醇和乙腈直接沉淀蛋白法，该法稀释了样品不利于提高检测灵敏度，同时水溶性不挥发成分多不利于色谱柱、质谱离子源的保护，且基质效应难以达标。从SHA及M2代谢物的结构可以看出两个成分的极性差不大，均呈弱酸性，因此可以在一定酸性环境下采用有机溶剂将药物及其代谢物进行萃取浓集。经考察血样加入不同浓度的盐酸，用不同的有机溶剂萃取，发现加入0.5 mol/L盐酸，用含3%异丙醇重蒸乙醚萃取的SHA及M2代谢物萃取回收率均达到较为满意的效果。
3.3 同位素标记的药物作内标
本试验用同位素标记的药物d5-SHA作内标，由于其理化性质和SHA几乎完全一致，能较好地消除预处理和质谱检测器响应引起的误差，使SHA测定的精密度良好，优于文献采用的其他结构类似的药物做内标[4]。反之，由于内标和代谢物之间理化性质存在差异，精密度略差于SHA。
本研究建立的方法预处理简便、灵敏准确，适用于SHA及M2代谢物血药浓度的测定及药物代谢动力学研究。2例受试者餐后单次口服SHA 200 mg后SHA及M2代谢物的药物代谢动力学参数和文献结果[1, 4]相比基本一致。
组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂可以允许蛋白质的重新表达，促进细胞凋亡和细胞分化而抑制细胞循环和细胞分裂[1-5]。因其具有广谱低毒和靶向性的特点成为近年来抗肿瘤药物研究领域中的热点之一[6-8]。伏立诺他（SHA）用于治疗加重、持续和复发或2种全身性用药治疗后无效的皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL），是德国Merck公司开发的世界上第一个抑制HDAC的新型抗肿瘤药物[9-11]，2006年10月被美国食品和药物管理局（FDA）批准上市。有研究显示，SHA可通过诱导细胞凋亡、分化和抑制细胞周期以及增加肿瘤抑制基因的表达来抑制胰腺癌细胞的增长[12]。此外，还发现SHA治疗慢性B细胞复发性淋巴瘤[13]、抑制HCT-116结肠癌细胞增殖和诱导组蛋白高度乙酰化从而治疗结肠癌[14]、治疗转移性头颈癌[15]。有关生物样品中SHA及其代谢物的测定方法国外文献报道较多而国内较少。杜晓琅等[16]采用高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS），对血清样品采用甲醇直接沉淀蛋白法，尿液直接稀释进样，测定了血清及尿液中SHA和M2代谢物的浓度。Du等[17]采用HPLC-MS/MS法实行在线萃取SHA及代谢物。Parise等[18]用HPLC-MS/MS法乙腈沉淀蛋白、梯度洗脱方法测定SHA及代谢物浓度。本文液-液萃取法建立了灵敏、准确的测定血清中SHA及其主要代谢物M2的HPLC-MS/MS分析方法，已用于其人体药物代谢动力学研究预实验。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 仪器
日本岛津公司SL-HTC系列高效液相色谱仪（HPLC，含系统控制器，全自动进样器）；美国ABI公司API 3000型LC-MS/MS液质联用系统（含 Analyst1.4色谱工作站）；德国Eppendorf公司 Centrifuge 5810R 型台式低温离心机。
1.2 试剂
SHA对照品（北京福瑞康正医药技术研究所，含量：＞99.5%，批号：20130318）；M2代谢物对照品（中国食品药品检定研究所，含量：98%，批号：100095-201205）；d5-SHA对照品（加拿大TRC公司，含量：98.6%，批号：6-PTR-92-2）；乙腈、甲醇、异丙醇为色谱纯；其余试剂为分析纯，其中乙醚在用前景重蒸馏后使用，实验用纯水由美国Millipore公司Milli-Q型超纯水器制备所得。
1.3 方法
1.3.1 色谱与质谱条件
采用Gemini C18（50 mm×3.0 mm，3 µm）分析柱，流动相为甲醇︰乙腈︰水︰1 mol/L氨水︰甲酸（25︰15︰60︰0.1︰0.05），流速0.23 mL/min，柱温为40 ℃。质谱检测采用电喷雾离子源，多反应离子监测模式检测，喷雾电压为5 000 V；干燥气流速7 L/min、温度为450℃，碰撞气为7 psi，雾化气为8 psi，气帘气为7 psi；离子去簇电压为20 V；环形聚焦电压为57 V；SHA、M2和内标d5-SHA 的监测离子对m/z分别为265.2/232.2、194.1/176.1和270.3/237.3，碰撞室射出电压分别为5、9和5 V，碰撞诱导解离电压分别为17、16和18 V，入口电压分别为7、5和7 V。
1.3.2 溶液配制
① SHA储备液配制。精密称取SHA对照品10.0 mg于50 mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，即得SHA储备液（200 μg/mL），置4℃冰箱保存。
② M2代谢物储备液配制。精密称量M2对照品10.2 mg（相当于M2为10 mg）于50 mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，即得M2储备液（200 μg/mL），置4 ℃冰箱保存。
③ d5-SHA储备液（内标）及工作液配制。用十万分之一电子分析天平采用减重称量法精密称量d5-SHA对照品1.0 mg，置100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀即得d5-SHA储备液（10 μg/mL），置4℃冰箱保存。临用前用流动相稀释至400 μg/L使用。
④ SHA及M2标准曲线工作液配制。取1.0 mL SHA储备液（200 µg/mL）和2.0 mL M2储备液（200 µg/mL）于100 mL容量瓶，加入50%甲醇定容至刻度即得标准曲线最高管工作液（SHA 2 000 ng/mL，M2 4 000 ng/mL），以后各浓度管用50%甲醇依次稀释即得。
1.3.3 血清样品的预处理
取配制好的血清样品200 μL，加入50%甲醇100 μL、内标工作液（400 ng/mL）100 μL、0.5 mol/L盐酸溶液100 μL，混匀后加3.5 mL含3%异丙醇的重蒸乙醚涡旋混合5 min，4 ℃离心8 min（3 000 r/min），转上层液于尖底管中，置40 ℃水浴通空气流挥干。残渣用50 μL流动相复溶，进样10 μL。记录SHA、M2及内标色谱峰面积，以SHA、M2与内标的峰面积之比（y）带入相应的标准曲线上求算血清浓度。
1.3.4 方法专属性考察
分别取6个不同个体的空白血清各200 μL，加入100 μL 50%甲醇、100 μL流动相后按前述血清样品的预处理中的“加入0.5 mol/L盐酸溶液100 μL”起，同法操作，进样10 μL；进样对照品溶液10 μL；按前述血清样品的预处理方法处理空白血清加对照品溶液以及受试者血清样品，观察空白血清中的杂质是否干扰样品的测定。
1.3.5 线性关系及最低定量限考察
分别取空白血清200 μL 9份，依次加入SHA及M2标准系列工作液各100 μL，使SHA血浆浓度分别为1 000、500、250、100、50、25、10、2.5、1 μg/L，M2血浆浓度分别为2 000、1 000、500、200、100、50、20、5、2 μg/L，加入内标工作液100 μL，再加入50%甲醇 100 μL，按前述血清样品的预处理中的“加入0.5 mol/L盐酸溶液100 μL”起，同法操作，进样10 μL。记录药物及内标色谱峰面积，以二者峰面积之比（y）对SHA和M2代谢物血清浓度（x）进行加权（1/c2）（c指权重系数）线性回归。
1.3.6 精密度和方法回收率考察
取空白血清加SHA和M2工作液配制成低（2和4 ng/mL）、中（100和200 ng/mL）、高（800和1 600 ng/mL）3个浓度样品，于同日内连续测定5次，计算其方法回收率和批内相对标准偏差（RSD）。于1周内同法测定3批每批5次，计算其批间RSD。
1.3.7 萃取回收率及基质效应考察
取空白血清加SHA和M2工作液配制成低、中和高3个浓度样品，每种浓度3份，按前述血清样品预处理方法中的自“加入50%甲醇100 μL”起同法操作后进样。分别得到SHA和M2的峰面积A，同时分别取与血清样品高、中和低3个浓度相同量的SHA和M2标准工作液于尖底管挥干，流动相复溶，先直接进样得SHA和M2的峰面积B，再将溶液复溶加入预处理后的空白血清管，充分混合后进样得SHA和M2的峰面积C。将所得峰面积A与峰面积C比较，计算低、中和高浓度SHA和M2的预处理回收率，公式为：预处理回收率=A/C×100%；将所得峰面积C与峰面积B比较，计算SHA和M2的基质效应，公式为：基质效应=（C-B）/B×100%。
1.3.8 稳定性考察
取空白血清加SHA和M2工作液配制成低、中和高3个浓度样品，根据实际样品测定过程中可能涉及到的样品稳定性，分别对比考察样品在-35℃冰箱中放置0、42、62 d，室温放置0、2、6 h，反复冻融0、1、2、3次取样测定，萃取物在4℃冰箱放置0、12、24、36 h，样品处理后立即溶解进样，然后同一样品重复进样1次和2次，样品经处理后进样室（8℃）放置0、8、16 h后进样的稳定性。
1.4 方法应用
将本法用于2例CTCL患者餐后单次口服SHA 200 mg的药物代谢动力学预试验，绘制其SHA和M2代谢物的血药浓度-时间曲线（药时曲线）。
2 结果
2.1 方法专属性
SHA、M2和内标的保留时间分别为4.31、3.22、4.23 min。测定了6个不同个体的空白血清，血清中杂质均不干扰SHA、M2和d5-SHA的测定。空白血清、对照品、空白血清加对照品及样品的色谱图见图 1～4。
图1
空白血清色谱图 1a. SHA 1b. M2 1c. 内标 图 2对照品色谱图 2a. SHA 2b. M2 2c. 内标 图 3空白血清+对照品色谱图 3a. SHA 3b. M2 3c. 内标 图 4受试者血清样本色谱图 4a. SHA 4b. M2 4c. 内标
2.2 线性关系及最低定量限
SHA和M2的血清标准曲线回归方程分别为y=0.005 06x+0.000 11（r=0.999 7）和y=0.006 33x+0.011 6（r=0.997 8）。结果显示，SHA和M2分别在1～1 000 μg/L和2～2 000 μg/L范围标准曲线线性良好。最低定量限分别为1和2 ng/mL，其准确度及精密度均符合相关规定。
2.3 精密度和方法回收率
SHA及M2低、中、高浓度的方法回收率均合格，批内RSD及批间RSD均＜15%，符合要求。见表1。
2.4 萃取回收率及基质效应
SHA和M2低、中、高浓度的预处理回收率分别为56.77%～73.96%、72.51%～79.75%。SHA和M2的基质效应分别为-7.08%～-1.95%和-8.72%～-0.33%。
2.5 血清样品稳定性
血清样品在冰箱冷冻保存63 d，反复冻融3次，在室温放置6 h后测定与未保存、未冻融和未放置样品测定结果无明显差异，处理后的样品在进样室（8℃）放置16 h进样、萃取物在冰箱（4℃）中放置36 h，重复进样测定2次与0时刻值比较变化率 均＜15%，稳定性符合要求。
2.6 方法应用
2例患者SHA和M2代谢物的药时曲线见图 5、6。可见二者的药时曲线差异较大，原因可能是受试者为CTCL患者，自身的个体差异较大所致。
图5
1号受试者给药后SHA及M2代谢物药时曲线图
图6
2号受试者给药后SHA和M2的药时曲线图
3 讨论
3.1 流动相的选择
本次试验分别考察了甲醇和乙腈的流动相，结果显示甲醇为流动相时，药物及其代谢物响应值显著高于乙腈为流动相，但在单独使用甲醇有机相时，M2代谢物出峰前有一明显的杂质峰且不能完全分开，加入少量乙腈，M2代谢物出峰处没有杂质峰的干扰，经考察不同甲醇、乙腈比例发现25%甲醇-15%乙腈作为有机相比例，基质效应合格且优于单用甲醇或乙腈作为有机相的流动相。试验中还发现若流动相中不加甲酸，M2代谢物在10 min中内未出峰。考察加入不同量甲酸情况，选择加入0.05%甲酸效果较好。同时在流动相中加入少量氨水可以改善峰形及响应，最终确定本研究所用流动相。
3.2 预处理条件的选择
文献多采用直接沉淀蛋白进样，杜晓琅等[16]和Parise等[18]报道分别采用甲醇和乙腈直接沉淀蛋白法，该法稀释了样品不利于提高检测灵敏度，同时水溶性不挥发成分多不利于色谱柱、质谱离子源的保护，且基质效应难以达标。从SHA及M2代谢物的结构可以看出两个成分的极性差不大，均呈弱酸性，因此可以在一定酸性环境下采用有机溶剂将药物及其代谢物进行萃取浓集。经考察血样加入不同浓度的盐酸，用不同的有机溶剂萃取，发现加入0.5 mol/L盐酸，用含3%异丙醇重蒸乙醚萃取的SHA及M2代谢物萃取回收率均达到较为满意的效果。
3.3 同位素标记的药物作内标
本试验用同位素标记的药物d5-SHA作内标，由于其理化性质和SHA几乎完全一致，能较好地消除预处理和质谱检测器响应引起的误差，使SHA测定的精密度良好，优于文献采用的其他结构类似的药物做内标[4]。反之，由于内标和代谢物之间理化性质存在差异，精密度略差于SHA。
本研究建立的方法预处理简便、灵敏准确，适用于SHA及M2代谢物血药浓度的测定及药物代谢动力学研究。2例受试者餐后单次口服SHA 200 mg后SHA及M2代谢物的药物代谢动力学参数和文献结果[1, 4]相比基本一致。
