引用本文： 邓力珲, 张晓鑫, 陈炜炜, 石娜, 马芸, 姜坤, 杨晓楠, 夏庆. 血浆微 RNA-216 早期预警重症急性胰腺炎的临床价值. 华西医学, 2018, 33(5): 550-554. doi: 10.7507/1002-0179.201605050 复制
急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）目前尚无公认有效的特异性治疗[1-2]，一旦出现重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP），预后差[3-5]。尽早识别 SAP 以尽早采取积极的多学科综合干预是进一步降低病死率的关键。但从临床特征及时准确判断病情的轻重程度相当困难[6]，目前预测 AP 病情严重性的临床评分系统[7-9]、影像学评分[10-11]、单个生化指标[12-15]因其有效性不足、时效性欠佳或操作繁琐而未得到一致认可[4, 6]。开发简便、准确、可靠的生物标志物对及时筛选危重患者有重要意义。
微 RNA（microRNA，miRNA）是一类内源性非编码小 RNA[16]，参与了细胞的许多重要生物学过程[17]。miRNA 在细胞外体液中稳定表达[18-19]，血循环中异常表达的 miRNA 可能在疾病的临床诊断中有重要作用[20-22]。miRNA-216（miR-216）的表达具有胰腺组织特异性[23-26]，尤其在腺泡细胞中相对特异表达[27-28]。研究认为，血液中 miR-216 表达可作为 AP 的潜在标志物[27, 29-31]，但 miR-216 在判断胰腺损伤严重程度中的价值还不明确。本研究检测 AP 患者病程早期血浆 miR-216 的表达，探讨其早期预测 SAP 的价值。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象
纳入 2014 年 9 月—11 月四川大学华西医院中西医结合科收治的 AP 患者（临床研究注册号：ChiCTR-DOD-15005864）。
AP 的诊断标准为符合以下 3 项中的至少 2 项：① 急性、突发、持续、剧烈的上腹部疼痛、常向背部放射等 AP 特征性的腹痛；② 血清淀粉酶和（或）脂肪酶活性升高大于等于正常上限值的 3 倍；③ 腹部影像学提示 AP 特征性的改变。
纳入标准为同时符合以下 4 条者：① 年龄 18～70 岁；② 符合 AP 的诊断标准；③ 出现腹痛等典型症状起 48 h 之内收入我科；④ 患者知情同意，自愿参与研究，并签署知情同意书。
排除标准为符合以下任何 1 项者：① 妊娠或哺乳期妇女；② 有肿瘤病史的患者；③ 处于疾病晚期的患者；④ 既往发生过急性胰腺炎；⑤ 患者正在进行其他临床试验。
1.2 仪器与试剂
真空采血管购自美国 BD 公司。血浆 miRNA 提取试剂盒 mirVanaTM PARISTM Kit、血浆 miRNA 反转录试剂盒、实时定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒 Taqman microRNA Assays（has-microRNA-216a）购自美国 Applied Biosystems 公司。PCR 仪为 ABI 7500 型定量 PCR 仪（美国 Applied Biosystems 公司）。
1.3 检测方法
1.3.1 受试者血液标本采集和预处理
所有患者于入院 24 h 内使用乙二胺四乙酸抗凝采血管采集外周静脉血 4 mL，釆血后 2 h 内处理分离血浆：血标本 24℃ 600×g 离心 30 min，转移上层血浆至 15 mL 离心管，然后 24℃ 1 500×g 离心 10 min，转移血浆至冻存管中，–80℃ 冻存以备抽提 RNA。
1.3.2 血浆 miRNA 检测
取 400 μL 血浆标本，按照 mirVanaTM PARIS Kit 说明书提取血清样品 RNA（含 miRNA）。采用 TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit 进行反转录，反转录条件为：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min。取反转产物 2 μL 作为模板，用 TaqMan Universal Master Mix Ⅱ试剂盒进行实时荧光定量 PCR 检测，所有反应采用三复孔，反应条件为 50℃，2 min，95℃ 10 min，然后 95℃ 15 s，60℃ 1 min，40 个循环。每个标本各进行 3 次实时荧光定量 PCR，取扩增循环数（Ct 值）的平均值。
1.4 临床数据收集
收集患者的人口学特征、体质量指数（body mass index，BMI）、基础疾病情况、入院 24 h 内实验室资料、影像学资料、治疗情况、出院时情况。实验室资料包括：血常规、血生化、C 反应蛋白、降钙素原、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等。根据临床资料评估相关评分系统，包括：Ranson 评分系统、全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）评分、急性生理与慢性健康评分Ⅱ（Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Ⅱ，APACHE-Ⅱ）评分系统、Glasgow 评分、AP 严重程度床旁指数（Bedside Index for Severity in Acute Pancreatitis，BISAP）评分系统和修正的 Marshall 评分（Modified Marshall Score，MMS）等。
1.5 统计学方法
连续型定量资料使用均数±标准差（正态分布）或中位数（最小值，最大值）（非正态分布）表示；定性资料使用百分比表示。正态分布的多组定量资料采用单因素方差分析，方差齐时多组间两两比较采用 LSD 法，方差不齐时多组间两两比较采用 Tamhane’s T2 法；非正态分布的定量资料采用独立样本 Kruskal-Wallis 秩和检验，并用 Kruskal-Wallis 单因素 ANOVA（k 样本）进行两两比较；定性资料比较采用 Fisher 确切概率法。参照文献[32]，Ct 值用 SDS 2.1 实时定量软件进行分析。用 Medcalc 15.8 软件 DeLong et al.法对受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线的曲线下面积（area under curve，AUC）进行对比统计分析。其余数据统计分析均使用 SPSS 22.0 软件。检验水准双侧 α=0.05。
2 结果
2.1 临床资料
据纳入和排除标准，最后共纳入患者 25 例，其中轻症急性胰腺炎（mild acute pancreatitis，MAP）7 例，中度重症急性胰腺炎（moderately severe acute pancreatitis，MSAP）10 例，SAP 8 例。MAP、MSAP 和 SAP 患者的年龄、性别构成比、BMI 等基本资料差异无统计学意义（P>0.05）。SAP 患者与 MAP 相比，血尿素氮、肌酐、IL-6、SIRS 评分、MMS 评分、BISAP 评分、APACHE-Ⅱ评分、Glasgow 评分差异有统计学意义（P<0.05）；SAP 患者与 MSAP 相比，血尿素氮、肌酐、IL-6、MMS 评分、BISAP 评分、APACHE-Ⅱ评分差异有统计学意义（P<0.05）；MSAP 与 MAP 相比，MMS 评分和 BISAP 评分差异有统计学意义（P<0.05）。MAP、MSAP 和 SAP 3 组患者在胰腺坏死率、感染率和重症监护病房（intensive care unit，ICU）入住率方面的差异有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
表1
不同程度 AP 患者入院 24 h 内的临床特征
2.2 miR-216 检测结果
所有 AP 患者血浆标本中均检测到 miR-216，3 组间 miR-216 表达差异有统计学意义（F=5.823，P=0.009），SAP 患者血浆 miR-216 表达显著高于 MAP（P=0.011）和 MSAP 组（P=0.005）；MAP 和 MSAP 患者相比，miR-216 的表达差异无统计学意义（P=0.946）。3 组间内参 miR-16 差异无统计学意义（P>0.05）。见图 1、表 2。
表2
AP 患者血浆 miR-216 与内参 miR-16 的 Ct 值（
）
图1
各组患者血浆 miR-216 表达水平
*与 MAP 组比较，
2.3 血浆 miR-216 诊断 SAP 的价值
血浆 miR-216 诊断 SAP 的 AUC 为 0.792（P<0.05），高于 APACHE-Ⅱ评分和 BISAP 评分的 AUC，小于 IL-6、血尿素氮、肌酐、MMS 评分、Glasgow 评分的 AUC，miR-216 与这些指标的 AUC 效能差异无统计学意义（P>0.05）。见表 3。
表3
miR-216 与生化指标及评分系统预测 SAP 的 ROC 曲线分析
3 讨论
在 AP 患者发病早期（尤其在发病后的 24 h 内）预判 SAP 仍是临床工作的难点和挑战。有文献报道患者血清和血浆的 miRNA 可以用于预测 AP 严重程度[33-37]，但 miR-216 在判断胰腺损伤及其严重程度中的价值还不明确。本研究依据 2012 年亚特兰大 AP 分级分类标准[3]纳入 MAP、MSAP 和 SAP 患者，以探索血浆 miR-216 评估 SAP 的临床价值。
动物实验在啮齿类动物血循环中检测到了 miR-216，由于 miR-216 基因序列在人与啮齿类动物之间的保守性[31]，因此理论上我们可以研究人血循环中的 miR-216。本研究的预实验在健康志愿者中未检测到 miR-216 表达，但是 3 组 AP 患者血浆中均检测到 miR-216，其表达水平在 MAP 与 MSAP 组间差异无统计学意义，SAP 患者血浆 miR-216 表达显著高于 MAP 和 MSAP，结果与 Blenkiron 等[32]的研究结果一致。
本研究探讨了血浆 miR-216 诊断 SAP 的效能，分析显示，血浆 miR-216 的 AUC 为 0.792，有统计学意义（P<0.05），提示miR-216 与 SAP 有密切的相关性。进一步将血浆 miR-216 诊断 SAP 的效能与临床常用指标和评分系统的预测效能进行比较，发现 miR-216 与这些指标比较预测 SAP 的效能差异无统计学意义（P>0.05），但是miR-216 的 AUC 高于 APACHE-Ⅱ评分和 BISAP 评分的 AUC，值得进一步研究。目前预测 AP 病情严重性的临床评分系统（APACHE-Ⅱ评分、BISAP 评分和 Glasgow 评分）和单个生化指标（血细胞比容、血尿素氮、钙离子、C 反应蛋白、降钙素原、IL-6 等），这些指标有一定的运用价值，但并不绝对准确。本研究纳入 25 例 AP 患者的临床资料结果显示，仅有 MMS 评分在 3 组的两两比较中差异均有统计学意义，SAP 患者的血尿素氮、肌酐、APACHE-Ⅱ评分分别高于与 MAP、MSAP 患者，然而上述指标在 MAP 与 MSAP 患者之间差异均无统计学意义。究其原因，可能样本量较小不能反映各组指标之间的差异，同时 2012 年修订版亚特兰大 AP 分类分级标准提出后也少有研究对这些指标进行重新验证[38]。
综上所述，本次小样本临床研究显示，血浆 miR-216 预测 SAP 的效能不优于目前临床上常用的评价指标体系，其价值需大样本的临床试验进一步研究。
急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）目前尚无公认有效的特异性治疗[1-2]，一旦出现重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP），预后差[3-5]。尽早识别 SAP 以尽早采取积极的多学科综合干预是进一步降低病死率的关键。但从临床特征及时准确判断病情的轻重程度相当困难[6]，目前预测 AP 病情严重性的临床评分系统[7-9]、影像学评分[10-11]、单个生化指标[12-15]因其有效性不足、时效性欠佳或操作繁琐而未得到一致认可[4, 6]。开发简便、准确、可靠的生物标志物对及时筛选危重患者有重要意义。
微 RNA（microRNA，miRNA）是一类内源性非编码小 RNA[16]，参与了细胞的许多重要生物学过程[17]。miRNA 在细胞外体液中稳定表达[18-19]，血循环中异常表达的 miRNA 可能在疾病的临床诊断中有重要作用[20-22]。miRNA-216（miR-216）的表达具有胰腺组织特异性[23-26]，尤其在腺泡细胞中相对特异表达[27-28]。研究认为，血液中 miR-216 表达可作为 AP 的潜在标志物[27, 29-31]，但 miR-216 在判断胰腺损伤严重程度中的价值还不明确。本研究检测 AP 患者病程早期血浆 miR-216 的表达，探讨其早期预测 SAP 的价值。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象
纳入 2014 年 9 月—11 月四川大学华西医院中西医结合科收治的 AP 患者（临床研究注册号：ChiCTR-DOD-15005864）。
AP 的诊断标准为符合以下 3 项中的至少 2 项：① 急性、突发、持续、剧烈的上腹部疼痛、常向背部放射等 AP 特征性的腹痛；② 血清淀粉酶和（或）脂肪酶活性升高大于等于正常上限值的 3 倍；③ 腹部影像学提示 AP 特征性的改变。
纳入标准为同时符合以下 4 条者：① 年龄 18～70 岁；② 符合 AP 的诊断标准；③ 出现腹痛等典型症状起 48 h 之内收入我科；④ 患者知情同意，自愿参与研究，并签署知情同意书。
排除标准为符合以下任何 1 项者：① 妊娠或哺乳期妇女；② 有肿瘤病史的患者；③ 处于疾病晚期的患者；④ 既往发生过急性胰腺炎；⑤ 患者正在进行其他临床试验。
1.2 仪器与试剂
真空采血管购自美国 BD 公司。血浆 miRNA 提取试剂盒 mirVanaTM PARISTM Kit、血浆 miRNA 反转录试剂盒、实时定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒 Taqman microRNA Assays（has-microRNA-216a）购自美国 Applied Biosystems 公司。PCR 仪为 ABI 7500 型定量 PCR 仪（美国 Applied Biosystems 公司）。
1.3 检测方法
1.3.1 受试者血液标本采集和预处理
所有患者于入院 24 h 内使用乙二胺四乙酸抗凝采血管采集外周静脉血 4 mL，釆血后 2 h 内处理分离血浆：血标本 24℃ 600×g 离心 30 min，转移上层血浆至 15 mL 离心管，然后 24℃ 1 500×g 离心 10 min，转移血浆至冻存管中，–80℃ 冻存以备抽提 RNA。
1.3.2 血浆 miRNA 检测
取 400 μL 血浆标本，按照 mirVanaTM PARIS Kit 说明书提取血清样品 RNA（含 miRNA）。采用 TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit 进行反转录，反转录条件为：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min。取反转产物 2 μL 作为模板，用 TaqMan Universal Master Mix Ⅱ试剂盒进行实时荧光定量 PCR 检测，所有反应采用三复孔，反应条件为 50℃，2 min，95℃ 10 min，然后 95℃ 15 s，60℃ 1 min，40 个循环。每个标本各进行 3 次实时荧光定量 PCR，取扩增循环数（Ct 值）的平均值。
1.4 临床数据收集
收集患者的人口学特征、体质量指数（body mass index，BMI）、基础疾病情况、入院 24 h 内实验室资料、影像学资料、治疗情况、出院时情况。实验室资料包括：血常规、血生化、C 反应蛋白、降钙素原、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等。根据临床资料评估相关评分系统，包括：Ranson 评分系统、全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）评分、急性生理与慢性健康评分Ⅱ（Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Ⅱ，APACHE-Ⅱ）评分系统、Glasgow 评分、AP 严重程度床旁指数（Bedside Index for Severity in Acute Pancreatitis，BISAP）评分系统和修正的 Marshall 评分（Modified Marshall Score，MMS）等。
1.5 统计学方法
连续型定量资料使用均数±标准差（正态分布）或中位数（最小值，最大值）（非正态分布）表示；定性资料使用百分比表示。正态分布的多组定量资料采用单因素方差分析，方差齐时多组间两两比较采用 LSD 法，方差不齐时多组间两两比较采用 Tamhane’s T2 法；非正态分布的定量资料采用独立样本 Kruskal-Wallis 秩和检验，并用 Kruskal-Wallis 单因素 ANOVA（k 样本）进行两两比较；定性资料比较采用 Fisher 确切概率法。参照文献[32]，Ct 值用 SDS 2.1 实时定量软件进行分析。用 Medcalc 15.8 软件 DeLong et al.法对受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线的曲线下面积（area under curve，AUC）进行对比统计分析。其余数据统计分析均使用 SPSS 22.0 软件。检验水准双侧 α=0.05。
2 结果
2.1 临床资料
据纳入和排除标准，最后共纳入患者 25 例，其中轻症急性胰腺炎（mild acute pancreatitis，MAP）7 例，中度重症急性胰腺炎（moderately severe acute pancreatitis，MSAP）10 例，SAP 8 例。MAP、MSAP 和 SAP 患者的年龄、性别构成比、BMI 等基本资料差异无统计学意义（P>0.05）。SAP 患者与 MAP 相比，血尿素氮、肌酐、IL-6、SIRS 评分、MMS 评分、BISAP 评分、APACHE-Ⅱ评分、Glasgow 评分差异有统计学意义（P<0.05）；SAP 患者与 MSAP 相比，血尿素氮、肌酐、IL-6、MMS 评分、BISAP 评分、APACHE-Ⅱ评分差异有统计学意义（P<0.05）；MSAP 与 MAP 相比，MMS 评分和 BISAP 评分差异有统计学意义（P<0.05）。MAP、MSAP 和 SAP 3 组患者在胰腺坏死率、感染率和重症监护病房（intensive care unit，ICU）入住率方面的差异有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
表1
不同程度 AP 患者入院 24 h 内的临床特征
2.2 miR-216 检测结果
所有 AP 患者血浆标本中均检测到 miR-216，3 组间 miR-216 表达差异有统计学意义（F=5.823，P=0.009），SAP 患者血浆 miR-216 表达显著高于 MAP（P=0.011）和 MSAP 组（P=0.005）；MAP 和 MSAP 患者相比，miR-216 的表达差异无统计学意义（P=0.946）。3 组间内参 miR-16 差异无统计学意义（P>0.05）。见图 1、表 2。
表2
AP 患者血浆 miR-216 与内参 miR-16 的 Ct 值（
）
图1
各组患者血浆 miR-216 表达水平
*与 MAP 组比较，
2.3 血浆 miR-216 诊断 SAP 的价值
血浆 miR-216 诊断 SAP 的 AUC 为 0.792（P<0.05），高于 APACHE-Ⅱ评分和 BISAP 评分的 AUC，小于 IL-6、血尿素氮、肌酐、MMS 评分、Glasgow 评分的 AUC，miR-216 与这些指标的 AUC 效能差异无统计学意义（P>0.05）。见表 3。
表3
miR-216 与生化指标及评分系统预测 SAP 的 ROC 曲线分析
3 讨论
在 AP 患者发病早期（尤其在发病后的 24 h 内）预判 SAP 仍是临床工作的难点和挑战。有文献报道患者血清和血浆的 miRNA 可以用于预测 AP 严重程度[33-37]，但 miR-216 在判断胰腺损伤及其严重程度中的价值还不明确。本研究依据 2012 年亚特兰大 AP 分级分类标准[3]纳入 MAP、MSAP 和 SAP 患者，以探索血浆 miR-216 评估 SAP 的临床价值。
动物实验在啮齿类动物血循环中检测到了 miR-216，由于 miR-216 基因序列在人与啮齿类动物之间的保守性[31]，因此理论上我们可以研究人血循环中的 miR-216。本研究的预实验在健康志愿者中未检测到 miR-216 表达，但是 3 组 AP 患者血浆中均检测到 miR-216，其表达水平在 MAP 与 MSAP 组间差异无统计学意义，SAP 患者血浆 miR-216 表达显著高于 MAP 和 MSAP，结果与 Blenkiron 等[32]的研究结果一致。
本研究探讨了血浆 miR-216 诊断 SAP 的效能，分析显示，血浆 miR-216 的 AUC 为 0.792，有统计学意义（P<0.05），提示miR-216 与 SAP 有密切的相关性。进一步将血浆 miR-216 诊断 SAP 的效能与临床常用指标和评分系统的预测效能进行比较，发现 miR-216 与这些指标比较预测 SAP 的效能差异无统计学意义（P>0.05），但是miR-216 的 AUC 高于 APACHE-Ⅱ评分和 BISAP 评分的 AUC，值得进一步研究。目前预测 AP 病情严重性的临床评分系统（APACHE-Ⅱ评分、BISAP 评分和 Glasgow 评分）和单个生化指标（血细胞比容、血尿素氮、钙离子、C 反应蛋白、降钙素原、IL-6 等），这些指标有一定的运用价值，但并不绝对准确。本研究纳入 25 例 AP 患者的临床资料结果显示，仅有 MMS 评分在 3 组的两两比较中差异均有统计学意义，SAP 患者的血尿素氮、肌酐、APACHE-Ⅱ评分分别高于与 MAP、MSAP 患者，然而上述指标在 MAP 与 MSAP 患者之间差异均无统计学意义。究其原因，可能样本量较小不能反映各组指标之间的差异，同时 2012 年修订版亚特兰大 AP 分类分级标准提出后也少有研究对这些指标进行重新验证[38]。
综上所述，本次小样本临床研究显示，血浆 miR-216 预测 SAP 的效能不优于目前临床上常用的评价指标体系，其价值需大样本的临床试验进一步研究。
