引用本文： 马静, 宋毅, 费小凡. 鼻窍通颗粒中黄芪、黄芩的薄层鉴别研究. 华西医学, 2017, 32(9): 1409-1413. doi: 10.7507/1002-0179.201608028 复制
鼻窍通颗粒是四川大学华西医院验方基础上自制的中药口服制剂，主要由黄芪、黄芩、苍耳子和鱼腥草等 19 味中药组成，具有祛风除湿、通窍止痛的功效，用于鼻窦炎所引起的头昏痛、流脓涕等不适症状，临床上治疗效果突出，副作用小。根据复方中药制剂相关指导办法，质量标准的指标成分建立一般首选君药[1]。而本方原质量标准中仅有栀子和赤芍的薄层鉴别，质量可控性较差。黄芪为本方中的君药，具有益气固表、托毒排脓生肌的功效，主治体虚自汗、久泻、脱肛、子宫脱垂、慢性肾炎、体虚浮肿、慢性溃疡、疮口久不愈合等症[2]；黄芩为方中佐使药，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效，主治温热病、上呼吸道感染、肺热咳嗽、湿热黄胆、肺炎、痈肿疖疮等症[3]。为提高医院制剂的原质量标准，本研究在原标准基础上增加了黄芪和黄芩的薄层鉴别方法，并进行了系统方法学研究，以便更好地控制鼻窍通颗粒成品的质量，为保证其临床用药安全有效提供参考依据。黄芪中含有多种有效活性成分，其中黄芪甲苷等皂苷类成分具有抗炎镇痛、抗血栓形成、抗衰老、增强免疫等药理作用[4]；黄芩中含有黄酮类、多糖和萜类化合物等成分，黄芩素是其有效成分之一，具有多种药理作用，目前临床主要用于抗炎和抗菌的作用[5]。因此，本研究选择黄芩素与黄芪甲苷作为鉴别黄芩与黄芪的指标成分。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 仪器、试剂与药材
1.1.1 仪器 AS3120 型超声波处理器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；HWS24 型电热恒温水浴锅（上海一恒科技仪器有限公司）；ZF-90 型多功能暗箱式紫外透射仪（上海宝山顾村电光仪器厂）；XP205DR 十万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多集团）；IRD-7080 型鼓风干燥箱（上海智诚分析仪器制造有限公司）；LP2102 电子天平（常熟市鸿泰仪器仪表技术有限公司）；D101 大孔吸附树脂（成都市科龙化工试剂厂）。
实验用薄层板：① 取薄层层析硅胶 G（青岛海浪硅胶干燥剂有限公司）适量，按 1∶3 的比例加入含 0.3% 羧甲基纤维素钠的水溶液混匀，用自动薄层制板器制成 10 cm×20 cm、厚度为 0.4 mm 硅胶G 板，晾干后，于 105℃ 烘 1 h，置干燥器内存放。② 聚酰胺薄膜（江苏长丰化工有限公司）。
1.1.2 试剂与药材 乙酸乙酯（天津市富起化工有限公司）；甲醇（成都天华化工科技有限公司）；正丁醇、乙醇（广东光华科技股份有限公司）；盐酸、硫酸、三氯甲烷、甲酸、甲苯、氨水（天津市科密欧化学试剂有限公司）；碳酸钠、三氯化铁、无水硫酸钠、中性氧化铝、氢氧化钠（成都市科龙化工试剂厂）。
黄芪对照药材（购于中国药品生物制品检定所，批号：120974-200508）；黄芩对照药材（购于中国药品生物制品检定所，批号：120955-200406）；黄芪甲苷对照品（购于中国药品生物制品检定所，批号：110781-200613）；黄芩素对照品（购于中国药品生物制品检定所，批号：11595-200402）；鼻窍通颗粒批号：151012、151124、151205。
1.2 黄芪的鉴别
1.2.1 溶液的制备 ① 供试品溶液的制备：取鼻窍通颗粒 20 g，加水 40 mL 溶解，用水饱和正丁醇振摇提取 2 次，15 mL/次，合并正丁醇液，用 5% 碳酸钠溶液洗涤 2 次，15 mL/次，弃去水液，正丁醇液蒸干，加水 20 mL 溶解，加至 D101 大孔吸附树脂（柱高 10 cm，内径 1.2 cm），依次用 2 倍柱体积的水、40% 乙醇洗脱，弃去洗脱液，再以 3 倍柱体积的 70% 乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩至约 2 mL，作为供试品溶液。② 对照药材溶液的制备：取黄芪对照药材 2 g，同法制成对照药材溶液。③ 对照品溶液的制备：另取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每 1 mL 含 1 mg 黄芪甲苷的溶液，作为对照品溶液。
1.2.2 展开系统选择 吸取“1.2.1”项下的 3 种溶液，点于同一硅胶 G 薄层板上，分别以条件 1 [乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（10∶1∶1∶1）][6]、条件 2 [氯仿-甲醇（10∶1）][7]、条件 3 [氯仿-甲醇-水（13∶7∶2）][8]的下层溶液为展开剂；将上述薄层板取出，晾干，喷以 10% 硫酸乙醇溶液，在 105℃ 加热至斑点显色清晰。
1.2.3 不同检视条件的考察 吸取“1.2.1”项下的 3 种溶液，在“1.2.2”项下选出的最佳展开系统下展开，取出，晾干，分别在不同紫外灯波长下（254、302、365 nm），或喷 10% 硫酸乙醇溶液加热至斑点显色后，日光下检视。
1.2.4 点样量的选择 吸取“1.2.1”项下的 3 种溶液，各 2、5、10、20 μL，点于同一硅胶 G 薄层板上，以“1.2.2”项下选出的最佳展开系统和“1.2.3”项下选出的最佳检视条件同法检视。
1.2.5 专属性的考察 阴性对照品溶液的制备：取除黄芪外的其他处方量药材制成阴性对照品溶液。吸取阴性对照品溶液 10 μL 和“1.2.1”项下的 3 种溶液，按照“1.2.2–1.2.4”项下选出的最佳条件同法检视。
1.2.6 不同温度、湿度的考察 本实验配置不同浓度的硫酸水溶液置展开缸的一侧，密闭 15 min 后，控制其相对湿度；并将装有薄层板的层析缸分别放置在 4～10℃ 冰箱中，20℃ 室温空调房中，35℃ 恒温干燥箱中进行不同温度的考察。取“1.2.1”项下的 3 种溶液，按照“1.2.2—1.2.4”项下选出的最佳条件进行点样，分别在下列条件展开：① 温度 10℃、湿度 45%；② 温度 10℃、湿度 65%；③ 温度 20℃、湿度 45%；④ 温度 20℃、湿度 65%；⑤ 温度 20℃、湿度 85%；⑥ 温度 35℃、湿度 65%；⑦ 温度 35℃、湿度 85%。分别以“1.2.3”项下选出的最佳检视条件同法检视。
1.2.7 不同薄层板的考察 吸取“1.2.1”项下的3 种溶液，取不同的薄层板：青岛海浪硅胶干燥剂有限公司生产的硅胶 G 薄层板、自制的硅胶 G 薄层板，分别按“1.2.2—1.2.4”项下选出的最佳方法检视。
1.3 黄芩的鉴别
1.3.1 溶液的制备 ① 供试品溶液的制备：取鼻窍通颗粒 20 g，加乙酸乙酯∶甲醇（3∶1）的混合溶液 100 mL，加热回流 30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇 2 mL 溶解，作为黄芩的供试品溶液。② 对照药材溶液的制备：取黄芩对照药材 1 g，同法制成对照药材溶液。③ 对照品溶液的制备：取黄芩素对照品适量，加甲醇制成每 1 mL 含 1 mg 黄芪素的溶液，作为对照品溶液。
1.3.2 展开系统选择 条件 1：分别吸取“1.3.1”项下 3 种溶液点于同一聚酰胺薄膜上，用甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）[9]、冰乙酸[10]为展开剂，取出晾干后直接置紫外灯（365 nm）下检视；条件 2：分别吸取“1.3.1”项下 3 种溶液点于同一硅胶 G 薄层板上，用乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）[11]的上层溶液为展开剂，取出晾干后喷以 2% 三氯化铁溶液为展开剂；条件 3：分别吸取“1.3.1”项下 3 种溶液点于同一硅胶 G 薄层板上，用甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（9∶3∶2∶2）为展开剂，取出晾干，在日光下放置 30 min 后直接观察。
1.3.3 不同检视条件的考察 吸取“1.3.1”项下的 3 种溶液，在“1.3.2”项下选出的最佳展开系统下展开，取出，晾干，分别在不同紫外灯波长（254 nm 和 365 nm）下；或喷以 2% 三氯化铁乙醇溶液，在日光下检视；或日光下放置 30 min 后直接观察。
1.3.4 点样量的选择 吸取“1.3.1”项下的 3 种溶液，各 2、5、10 和 20 μL，点于同一硅胶 G 薄层板上，以“1.3.2”项下选出的最佳展开系统和“1.3.3”项下选出的最佳检视条件同法检视。
1.3.5 专属性的考察 阴性对照品溶液的制备：取除黄芩外的其他处方量药材制成阴性对照品溶液。吸取阴性对照品溶液 10 μL 和“1.3.1”项下的 3 种溶液，按照“1.3.2—1.3.4”项下选出的最佳条件同法检视。
1.3.6 不同温度、湿度的考察 本实验配置不同浓度的硫酸水溶液置展开缸的一侧，密闭 15 min 后，控制其相对湿度；并将装有薄层板的层析缸分别放置在 4～10℃ 冰箱中，20℃ 室温空调房中，35℃ 恒温干燥箱中进行不同温度的考察。取“1.3.1”项下的 3 种溶液，按照“1.3.2—1.3.4”项下选出的最佳条件进行点样，分别在下列条件展开：① 温度 10℃、湿度 45%；② 温度 10℃、湿度 65%；③ 温度 20℃、湿度 45%；④ 温度 20℃、湿度 65%；⑤ 温度 20℃、湿度 85%；⑥ 温度 35℃、湿度 65%；⑦ 温度 35℃、湿度 85%。分别以“1.3.4”项下选出的最佳检视条件同法检视。
1.3.7 不同薄层板的考察 取“1.3.1”项下的 3 种溶液，取不同的薄层板：青岛海浪硅胶干燥剂有限公司生产的硅胶 G 薄层板；自制的硅胶 G 薄层板，分别按“1.3.2—1.3.4”项下选出的最佳方法检视。
2 结果
2.1 黄芪薄层条件考察结果
2.1.1 展开系统考察结果 在条件 1、2 的展开系统下，杂质干扰较多，斑点拖尾严重，阴性有干扰；在条件 3 的展开系统下，斑点分离度好，阴性无干扰，比移（retention factor, Rf） 值适中。综合上述因素，最终确定以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下层溶液为本品的最佳展开系统。
2.1.2 点样量的选择结果 根据斑点的清晰度和分离度确定本品最佳点样量为供试品溶液 20 μL 和对照品溶液 5 μL。
2.1.3 不同检视条件的考察结果 本品喷 10% 硫酸乙醇溶液，在 105℃ 加热至斑点显色清晰，故确定以此为最佳检视条件。
2.1.4 专属性的考察结果 阴性对照品色谱中，在与对照品色谱和对照药材色谱相应的位置上无斑点，该方法的专属性好。
2.1.5 不同温度、湿度的考察结果 在上述不同温度、湿度条件下，供试品色谱在与对照品色谱的相应位置上，均有相同颜色的斑点，且分离度良好，Rf 值有稍许变化，说明温度在 10～35℃ 范围内，湿度在 45%～85% 范围内，对本品的薄层鉴别影响小，重复性和稳定性好。
2.1.6 不同薄层板的考察结果 在不同薄层板条件下，特征主斑点的分离度达到要求，斑点清晰。
2.1.7 黄芪薄层条件最终结果 ① 展开系统：以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下层溶液为展开剂，取出，晾干。② 点样条件：吸取供试品溶液和对照药材溶液各 20 μL，对照品溶液 5 μL，分别点于同一硅胶 G 薄层板上。③ 检视条件：喷以 10% 硫酸乙醇溶液，在 105℃ 加热至斑点显色清晰。见图 1。
图1
黄芪的薄层色谱鉴别图
1～3：供试品；4：黄芪甲苷对照品；5：黄芪阴性对照品；6：黄芪对照药材
2.2 黄芩薄层条件考察结果
2.2.1 展开系统考察结果 在展开系统条件 1 下，供试品在与对照品和对照药材相应位置，暗色斑点不明显，且拖尾严重；在条件 2、3 下，通过观察主斑点的 Rf 值、分离度、拖尾情况，确定以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-甲醇（9∶3∶2∶2）为本品的最佳展开系统。
2.2.2 点样量的选择结果 根据斑点的清晰度和分离度确定本品最佳点样量为供试品溶液 20 μL，对照品和对照药材溶液各 5 μL。
2.2.3 不同检视条件的考察结果 本品特征斑点在日光下放置 30 min 后直接观察时，斑点最明显，故确定以此为最佳检视条件。
2.2.4 专属性的考察结果 阴性对照品色谱中，在与对照品色谱和对照药材色谱相应的位置上无斑点，该方法的专属性好。
2.2.5 不同温度、湿度的考察结果 在上述不同温度、湿度条件下，供试品色谱在与对照品和对照药材色谱的相应位置上，均有相同颜色的斑点，且分离度良好，Rf 值有稍许变化，说明温度在 10～35℃ 范围内，湿度在 45%～85% 范围内，对本品的薄层鉴别影响小，重复性和稳定性好。
2.2.6 不同薄层板的考察结果 在不同薄层板条件下，特征主斑点的分离度达到要求，斑点清晰。
2.2.7 黄芩薄层条件最终结果 ① 展开系统：以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-甲醇（9∶3∶2∶2）为展开剂，取出，晾干。② 点样条件：吸取供试品溶液 20 μL，对照品溶液和对照药材溶液各 5 μL，分别点于同一硅胶 G 薄层板上。③ 检视条件：日光下放置 30 min 后直接观察，供试品在与对照品和对照药材相应位置有相同颜色的斑点。见图 2。
图2
黄芩的薄层色谱鉴别图
1～3：供试品；4：黄芩素对照品；5：黄芩对照药材；6：黄芩阴性对照品
3 讨论
本实验对本品中黄芪和黄芩药材进行鉴别时，还探索了其他条件：参照中国药典 2015 年版一部黄芪[12]项下方法，将鼻窍通颗粒用乙醇加热回流提取，滤液蒸干加 0.3% 氢氧化钠溶解，用稀盐酸调节 pH 值至 5～6，采用乙酸乙酯萃取 2 次，蒸干后残渣加甲醇 2 mL溶 解，作为供试品溶液；以氯仿∶甲醇（3∶1）为展开剂，但在此条件下杂质干扰较多，斑点拖尾严重，阴性有干扰，故未采用该方法制备黄芪的供试品溶液。另外参照文献[13]将鼻窍通颗粒的甲醇提取液蒸干后通过中性氧化铝进行纯化，先用 40% 甲醇 150 mL 洗脱，洗脱液蒸干后，用水饱和正丁醇萃取，把萃取液作为供试品溶液，以氯仿-甲醇-甲酸（9∶0.5∶0.5）为展开剂，但是该供试品在与对照药材相应位置斑点杂质干扰较大，分离度不好，故也未采用该方法制备黄芪的供试品溶液。参照文献[14]方法对黄芩制样，先用乙醚除脂溶性成分，水液加酸调 pH 值后用乙酸乙酯萃取，萃取液作为供试品液，但在该条件下黄芩拖尾严重，阴性有干扰，故未采用该方法制备黄芩的供试品溶液。上述条件的影响是由于鼻窍通颗粒由 19 味中药组成，成分复杂，提取液中溶出成分多，待测成分与其他杂质成分均被提取出来，导致薄层鉴别干扰严重，分离效果差，故在选择提取制备工艺时，需要根据待测成分的性质进行选择。
在进行黄芪和黄芩的耐用性试验考察时，温度和湿度的变化对 Rf 值会有影响，但在此条件变化的情况下，其特征主斑点分离度和清晰度良好；另外，本次实验还采用了市售薄层板和自制薄层版分别进行考察，黄芪和黄芩的主斑点在这 2 种薄层板上的分离度和重现性均能达到相关要求，说明本次实验方案有效、可行。
我们还尝试过鉴别该处方中其他几味药材，但由于方中部分药材含有挥发性成分，还有部分药材的鉴别成分遇热不稳定，在颗粒制备的煎煮工艺中，挥发性成分损失，有效成分被破坏，在薄层色谱中难以鉴别出其特征斑点，故鉴别意义不大[15-17]；还有部分药材通过薄层鉴别筛选后，也存在专属性不强、斑点不明显的现象，故未纳入标准正文中。
综上所述，医疗机构制剂遵循安全、实用、规范和质量可控的原则，建立有代表性的、简便快速、专属性和灵敏度高的方法，才能有效地控制医疗机构制剂的质量，保证临床疗效。本研究对鼻窍通颗粒中黄芪和黄芩进行了薄层鉴别方法学验证考察，结果显示图谱中的特征斑点清晰，分离度好，阴性对照无干扰，操作简便，表明该方法的重现性好、专属性高，可作为鼻窍通颗粒质量控制的检测指标。
鼻窍通颗粒是四川大学华西医院验方基础上自制的中药口服制剂，主要由黄芪、黄芩、苍耳子和鱼腥草等 19 味中药组成，具有祛风除湿、通窍止痛的功效，用于鼻窦炎所引起的头昏痛、流脓涕等不适症状，临床上治疗效果突出，副作用小。根据复方中药制剂相关指导办法，质量标准的指标成分建立一般首选君药[1]。而本方原质量标准中仅有栀子和赤芍的薄层鉴别，质量可控性较差。黄芪为本方中的君药，具有益气固表、托毒排脓生肌的功效，主治体虚自汗、久泻、脱肛、子宫脱垂、慢性肾炎、体虚浮肿、慢性溃疡、疮口久不愈合等症[2]；黄芩为方中佐使药，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效，主治温热病、上呼吸道感染、肺热咳嗽、湿热黄胆、肺炎、痈肿疖疮等症[3]。为提高医院制剂的原质量标准，本研究在原标准基础上增加了黄芪和黄芩的薄层鉴别方法，并进行了系统方法学研究，以便更好地控制鼻窍通颗粒成品的质量，为保证其临床用药安全有效提供参考依据。黄芪中含有多种有效活性成分，其中黄芪甲苷等皂苷类成分具有抗炎镇痛、抗血栓形成、抗衰老、增强免疫等药理作用[4]；黄芩中含有黄酮类、多糖和萜类化合物等成分，黄芩素是其有效成分之一，具有多种药理作用，目前临床主要用于抗炎和抗菌的作用[5]。因此，本研究选择黄芩素与黄芪甲苷作为鉴别黄芩与黄芪的指标成分。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 仪器、试剂与药材
1.1.1 仪器 AS3120 型超声波处理器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；HWS24 型电热恒温水浴锅（上海一恒科技仪器有限公司）；ZF-90 型多功能暗箱式紫外透射仪（上海宝山顾村电光仪器厂）；XP205DR 十万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多集团）；IRD-7080 型鼓风干燥箱（上海智诚分析仪器制造有限公司）；LP2102 电子天平（常熟市鸿泰仪器仪表技术有限公司）；D101 大孔吸附树脂（成都市科龙化工试剂厂）。
实验用薄层板：① 取薄层层析硅胶 G（青岛海浪硅胶干燥剂有限公司）适量，按 1∶3 的比例加入含 0.3% 羧甲基纤维素钠的水溶液混匀，用自动薄层制板器制成 10 cm×20 cm、厚度为 0.4 mm 硅胶G 板，晾干后，于 105℃ 烘 1 h，置干燥器内存放。② 聚酰胺薄膜（江苏长丰化工有限公司）。
1.1.2 试剂与药材 乙酸乙酯（天津市富起化工有限公司）；甲醇（成都天华化工科技有限公司）；正丁醇、乙醇（广东光华科技股份有限公司）；盐酸、硫酸、三氯甲烷、甲酸、甲苯、氨水（天津市科密欧化学试剂有限公司）；碳酸钠、三氯化铁、无水硫酸钠、中性氧化铝、氢氧化钠（成都市科龙化工试剂厂）。
黄芪对照药材（购于中国药品生物制品检定所，批号：120974-200508）；黄芩对照药材（购于中国药品生物制品检定所，批号：120955-200406）；黄芪甲苷对照品（购于中国药品生物制品检定所，批号：110781-200613）；黄芩素对照品（购于中国药品生物制品检定所，批号：11595-200402）；鼻窍通颗粒批号：151012、151124、151205。
1.2 黄芪的鉴别
1.2.1 溶液的制备 ① 供试品溶液的制备：取鼻窍通颗粒 20 g，加水 40 mL 溶解，用水饱和正丁醇振摇提取 2 次，15 mL/次，合并正丁醇液，用 5% 碳酸钠溶液洗涤 2 次，15 mL/次，弃去水液，正丁醇液蒸干，加水 20 mL 溶解，加至 D101 大孔吸附树脂（柱高 10 cm，内径 1.2 cm），依次用 2 倍柱体积的水、40% 乙醇洗脱，弃去洗脱液，再以 3 倍柱体积的 70% 乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩至约 2 mL，作为供试品溶液。② 对照药材溶液的制备：取黄芪对照药材 2 g，同法制成对照药材溶液。③ 对照品溶液的制备：另取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每 1 mL 含 1 mg 黄芪甲苷的溶液，作为对照品溶液。
1.2.2 展开系统选择 吸取“1.2.1”项下的 3 种溶液，点于同一硅胶 G 薄层板上，分别以条件 1 [乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（10∶1∶1∶1）][6]、条件 2 [氯仿-甲醇（10∶1）][7]、条件 3 [氯仿-甲醇-水（13∶7∶2）][8]的下层溶液为展开剂；将上述薄层板取出，晾干，喷以 10% 硫酸乙醇溶液，在 105℃ 加热至斑点显色清晰。
1.2.3 不同检视条件的考察 吸取“1.2.1”项下的 3 种溶液，在“1.2.2”项下选出的最佳展开系统下展开，取出，晾干，分别在不同紫外灯波长下（254、302、365 nm），或喷 10% 硫酸乙醇溶液加热至斑点显色后，日光下检视。
1.2.4 点样量的选择 吸取“1.2.1”项下的 3 种溶液，各 2、5、10、20 μL，点于同一硅胶 G 薄层板上，以“1.2.2”项下选出的最佳展开系统和“1.2.3”项下选出的最佳检视条件同法检视。
1.2.5 专属性的考察 阴性对照品溶液的制备：取除黄芪外的其他处方量药材制成阴性对照品溶液。吸取阴性对照品溶液 10 μL 和“1.2.1”项下的 3 种溶液，按照“1.2.2–1.2.4”项下选出的最佳条件同法检视。
1.2.6 不同温度、湿度的考察 本实验配置不同浓度的硫酸水溶液置展开缸的一侧，密闭 15 min 后，控制其相对湿度；并将装有薄层板的层析缸分别放置在 4～10℃ 冰箱中，20℃ 室温空调房中，35℃ 恒温干燥箱中进行不同温度的考察。取“1.2.1”项下的 3 种溶液，按照“1.2.2—1.2.4”项下选出的最佳条件进行点样，分别在下列条件展开：① 温度 10℃、湿度 45%；② 温度 10℃、湿度 65%；③ 温度 20℃、湿度 45%；④ 温度 20℃、湿度 65%；⑤ 温度 20℃、湿度 85%；⑥ 温度 35℃、湿度 65%；⑦ 温度 35℃、湿度 85%。分别以“1.2.3”项下选出的最佳检视条件同法检视。
1.2.7 不同薄层板的考察 吸取“1.2.1”项下的3 种溶液，取不同的薄层板：青岛海浪硅胶干燥剂有限公司生产的硅胶 G 薄层板、自制的硅胶 G 薄层板，分别按“1.2.2—1.2.4”项下选出的最佳方法检视。
1.3 黄芩的鉴别
1.3.1 溶液的制备 ① 供试品溶液的制备：取鼻窍通颗粒 20 g，加乙酸乙酯∶甲醇（3∶1）的混合溶液 100 mL，加热回流 30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇 2 mL 溶解，作为黄芩的供试品溶液。② 对照药材溶液的制备：取黄芩对照药材 1 g，同法制成对照药材溶液。③ 对照品溶液的制备：取黄芩素对照品适量，加甲醇制成每 1 mL 含 1 mg 黄芪素的溶液，作为对照品溶液。
1.3.2 展开系统选择 条件 1：分别吸取“1.3.1”项下 3 种溶液点于同一聚酰胺薄膜上，用甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）[9]、冰乙酸[10]为展开剂，取出晾干后直接置紫外灯（365 nm）下检视；条件 2：分别吸取“1.3.1”项下 3 种溶液点于同一硅胶 G 薄层板上，用乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）[11]的上层溶液为展开剂，取出晾干后喷以 2% 三氯化铁溶液为展开剂；条件 3：分别吸取“1.3.1”项下 3 种溶液点于同一硅胶 G 薄层板上，用甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（9∶3∶2∶2）为展开剂，取出晾干，在日光下放置 30 min 后直接观察。
1.3.3 不同检视条件的考察 吸取“1.3.1”项下的 3 种溶液，在“1.3.2”项下选出的最佳展开系统下展开，取出，晾干，分别在不同紫外灯波长（254 nm 和 365 nm）下；或喷以 2% 三氯化铁乙醇溶液，在日光下检视；或日光下放置 30 min 后直接观察。
1.3.4 点样量的选择 吸取“1.3.1”项下的 3 种溶液，各 2、5、10 和 20 μL，点于同一硅胶 G 薄层板上，以“1.3.2”项下选出的最佳展开系统和“1.3.3”项下选出的最佳检视条件同法检视。
1.3.5 专属性的考察 阴性对照品溶液的制备：取除黄芩外的其他处方量药材制成阴性对照品溶液。吸取阴性对照品溶液 10 μL 和“1.3.1”项下的 3 种溶液，按照“1.3.2—1.3.4”项下选出的最佳条件同法检视。
1.3.6 不同温度、湿度的考察 本实验配置不同浓度的硫酸水溶液置展开缸的一侧，密闭 15 min 后，控制其相对湿度；并将装有薄层板的层析缸分别放置在 4～10℃ 冰箱中，20℃ 室温空调房中，35℃ 恒温干燥箱中进行不同温度的考察。取“1.3.1”项下的 3 种溶液，按照“1.3.2—1.3.4”项下选出的最佳条件进行点样，分别在下列条件展开：① 温度 10℃、湿度 45%；② 温度 10℃、湿度 65%；③ 温度 20℃、湿度 45%；④ 温度 20℃、湿度 65%；⑤ 温度 20℃、湿度 85%；⑥ 温度 35℃、湿度 65%；⑦ 温度 35℃、湿度 85%。分别以“1.3.4”项下选出的最佳检视条件同法检视。
1.3.7 不同薄层板的考察 取“1.3.1”项下的 3 种溶液，取不同的薄层板：青岛海浪硅胶干燥剂有限公司生产的硅胶 G 薄层板；自制的硅胶 G 薄层板，分别按“1.3.2—1.3.4”项下选出的最佳方法检视。
2 结果
2.1 黄芪薄层条件考察结果
2.1.1 展开系统考察结果 在条件 1、2 的展开系统下，杂质干扰较多，斑点拖尾严重，阴性有干扰；在条件 3 的展开系统下，斑点分离度好，阴性无干扰，比移（retention factor, Rf） 值适中。综合上述因素，最终确定以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下层溶液为本品的最佳展开系统。
2.1.2 点样量的选择结果 根据斑点的清晰度和分离度确定本品最佳点样量为供试品溶液 20 μL 和对照品溶液 5 μL。
2.1.3 不同检视条件的考察结果 本品喷 10% 硫酸乙醇溶液，在 105℃ 加热至斑点显色清晰，故确定以此为最佳检视条件。
2.1.4 专属性的考察结果 阴性对照品色谱中，在与对照品色谱和对照药材色谱相应的位置上无斑点，该方法的专属性好。
2.1.5 不同温度、湿度的考察结果 在上述不同温度、湿度条件下，供试品色谱在与对照品色谱的相应位置上，均有相同颜色的斑点，且分离度良好，Rf 值有稍许变化，说明温度在 10～35℃ 范围内，湿度在 45%～85% 范围内，对本品的薄层鉴别影响小，重复性和稳定性好。
2.1.6 不同薄层板的考察结果 在不同薄层板条件下，特征主斑点的分离度达到要求，斑点清晰。
2.1.7 黄芪薄层条件最终结果 ① 展开系统：以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下层溶液为展开剂，取出，晾干。② 点样条件：吸取供试品溶液和对照药材溶液各 20 μL，对照品溶液 5 μL，分别点于同一硅胶 G 薄层板上。③ 检视条件：喷以 10% 硫酸乙醇溶液，在 105℃ 加热至斑点显色清晰。见图 1。
图1
黄芪的薄层色谱鉴别图
1～3：供试品；4：黄芪甲苷对照品；5：黄芪阴性对照品；6：黄芪对照药材
2.2 黄芩薄层条件考察结果
2.2.1 展开系统考察结果 在展开系统条件 1 下，供试品在与对照品和对照药材相应位置，暗色斑点不明显，且拖尾严重；在条件 2、3 下，通过观察主斑点的 Rf 值、分离度、拖尾情况，确定以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-甲醇（9∶3∶2∶2）为本品的最佳展开系统。
2.2.2 点样量的选择结果 根据斑点的清晰度和分离度确定本品最佳点样量为供试品溶液 20 μL，对照品和对照药材溶液各 5 μL。
2.2.3 不同检视条件的考察结果 本品特征斑点在日光下放置 30 min 后直接观察时，斑点最明显，故确定以此为最佳检视条件。
2.2.4 专属性的考察结果 阴性对照品色谱中，在与对照品色谱和对照药材色谱相应的位置上无斑点，该方法的专属性好。
2.2.5 不同温度、湿度的考察结果 在上述不同温度、湿度条件下，供试品色谱在与对照品和对照药材色谱的相应位置上，均有相同颜色的斑点，且分离度良好，Rf 值有稍许变化，说明温度在 10～35℃ 范围内，湿度在 45%～85% 范围内，对本品的薄层鉴别影响小，重复性和稳定性好。
2.2.6 不同薄层板的考察结果 在不同薄层板条件下，特征主斑点的分离度达到要求，斑点清晰。
2.2.7 黄芩薄层条件最终结果 ① 展开系统：以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-甲醇（9∶3∶2∶2）为展开剂，取出，晾干。② 点样条件：吸取供试品溶液 20 μL，对照品溶液和对照药材溶液各 5 μL，分别点于同一硅胶 G 薄层板上。③ 检视条件：日光下放置 30 min 后直接观察，供试品在与对照品和对照药材相应位置有相同颜色的斑点。见图 2。
图2
黄芩的薄层色谱鉴别图
1～3：供试品；4：黄芩素对照品；5：黄芩对照药材；6：黄芩阴性对照品
3 讨论
本实验对本品中黄芪和黄芩药材进行鉴别时，还探索了其他条件：参照中国药典 2015 年版一部黄芪[12]项下方法，将鼻窍通颗粒用乙醇加热回流提取，滤液蒸干加 0.3% 氢氧化钠溶解，用稀盐酸调节 pH 值至 5～6，采用乙酸乙酯萃取 2 次，蒸干后残渣加甲醇 2 mL溶 解，作为供试品溶液；以氯仿∶甲醇（3∶1）为展开剂，但在此条件下杂质干扰较多，斑点拖尾严重，阴性有干扰，故未采用该方法制备黄芪的供试品溶液。另外参照文献[13]将鼻窍通颗粒的甲醇提取液蒸干后通过中性氧化铝进行纯化，先用 40% 甲醇 150 mL 洗脱，洗脱液蒸干后，用水饱和正丁醇萃取，把萃取液作为供试品溶液，以氯仿-甲醇-甲酸（9∶0.5∶0.5）为展开剂，但是该供试品在与对照药材相应位置斑点杂质干扰较大，分离度不好，故也未采用该方法制备黄芪的供试品溶液。参照文献[14]方法对黄芩制样，先用乙醚除脂溶性成分，水液加酸调 pH 值后用乙酸乙酯萃取，萃取液作为供试品液，但在该条件下黄芩拖尾严重，阴性有干扰，故未采用该方法制备黄芩的供试品溶液。上述条件的影响是由于鼻窍通颗粒由 19 味中药组成，成分复杂，提取液中溶出成分多，待测成分与其他杂质成分均被提取出来，导致薄层鉴别干扰严重，分离效果差，故在选择提取制备工艺时，需要根据待测成分的性质进行选择。
在进行黄芪和黄芩的耐用性试验考察时，温度和湿度的变化对 Rf 值会有影响，但在此条件变化的情况下，其特征主斑点分离度和清晰度良好；另外，本次实验还采用了市售薄层板和自制薄层版分别进行考察，黄芪和黄芩的主斑点在这 2 种薄层板上的分离度和重现性均能达到相关要求，说明本次实验方案有效、可行。
我们还尝试过鉴别该处方中其他几味药材，但由于方中部分药材含有挥发性成分，还有部分药材的鉴别成分遇热不稳定，在颗粒制备的煎煮工艺中，挥发性成分损失，有效成分被破坏，在薄层色谱中难以鉴别出其特征斑点，故鉴别意义不大[15-17]；还有部分药材通过薄层鉴别筛选后，也存在专属性不强、斑点不明显的现象，故未纳入标准正文中。
综上所述，医疗机构制剂遵循安全、实用、规范和质量可控的原则，建立有代表性的、简便快速、专属性和灵敏度高的方法，才能有效地控制医疗机构制剂的质量，保证临床疗效。本研究对鼻窍通颗粒中黄芪和黄芩进行了薄层鉴别方法学验证考察，结果显示图谱中的特征斑点清晰，分离度好，阴性对照无干扰，操作简便，表明该方法的重现性好、专属性高，可作为鼻窍通颗粒质量控制的检测指标。
