引用本文： 林文韬, 刘晓雪, 刘勇, 陈俊杰, 岑瑛. HaCaT 条件培养基联合全反式维甲酸诱导人脂肪干细胞向表皮细胞分化的初步研究. 华西医学, 2018, 33(3): 325-331. doi: 10.7507/1002-0179.201611154 复制
皮肤是人体最大的器官，大面积深度烧伤、急性创伤等可能造成大面积皮肤缺损。组织工程皮肤是修复大面积皮肤缺损有效方法之一。种子细胞为组织工程皮肤重要组成要素。以往研究较多的是角质形成细胞及成纤维细胞[1]。随着干细胞研究的不断深入，自体干细胞或许能成为组织工程领域理想的种子细胞。
间充质干细胞为近年来研究的热点。脂肪来源间充质干细胞可以通过微创的方法从人体获得，可以是体内多余的脂肪组织，对供体损伤小，来源丰富，体外容易培养，等量组织中干细胞含量要远远高于骨髓间充质干细胞；脂肪干细胞具有良好的自我增殖和多系分化潜能，能够向脂肪细胞、成骨细胞、肝细胞、内皮细胞等组织细胞分化[2-4]。2005 年，Brzoska 等[5]研究发现，全反式维甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）可诱导脂肪干细胞分化为表皮细胞，表明脂肪干细胞有向表皮方向分化的能力。Long 等[6]用 ATRA 联合生长因子同样诱导脂肪干细胞向表皮细胞分化。我国学者也利用人永生化角质形成细胞 HaCaT 与干细胞共培养的方式，成功诱导干细胞向表皮细胞表型分化[7-9]。诱导后表皮细胞角蛋白的表达率不同文献报道差异较大，为 9%～80%[5, 7, 10]。本研究用 ATRA 及生长因子结合 HaCaT 细胞条件培养基作为诱导条件，探讨提高脂肪干细胞向表皮诱导分化的方法。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本
脂肪取自四川大学华西医院美容整形/烧伤外科腹部取皮手术后多余的皮下脂肪组织或水动力抽脂机腹部抽吸的多余脂肪组织，研究经医院伦理委员会审批通过，患者签署相关知情同意书。
1.2 主要试剂与仪器
1.2.1 主要试剂
Dulbecco Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12（DMEM/F12）培养基（美国 Gibco 公司），Ⅰ型胶原酶（美国 Gibco 公司），胎牛血清（美国 Gibco 公司），山羊血清（杭州四季青公司），磷酸盐缓冲液（北京中杉金桥公司），3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobutyl-1-methyxanthine，IBMX）（美国 Sigma 公司），地塞米松（美国 Sigma 公司），胰酶（美国 Sigma 公司），PerCP-eFluor® 710 标记抗人 CD34 抗体（美国 eBioscience 公司），异硫氰酸荧光素标记抗人 CD45 抗体（美国 BD biosciences 公司），PE-Cyanine7 标记抗人 CD73 抗体（美国 eBioscience 公司），（Thy-1）别藻蓝蛋白标记抗人 CD90 抗体（美国 BD biosciences 公司），藻红蛋白标记抗人 CD105 抗体（美国 eBioscience 公司），藻红蛋白标记鼠抗人细胞角蛋白（cytokeratin，CK）14、15、16、19 抗体（美国 BD Pharmingen 公司），ATRA（美国 Sigma 公司），表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）（美国 PeproTech 公司），角质细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）（美国 PeproTech 公司），异硫氰酸荧光素标记山羊抗兔免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）（北京中杉金桥公司），Alexa Fluor594 标记山羊抗鼠 IgG（美国 Life Technology 公司），Ⅳ型胶原（美国 Sigma 公司），CK14 抗体（美国 Proteintech 公司），HaCaT 细胞（美国 ATCC 公司）。
1.2.2 主要仪器
显微镜（日本 Nikon 公司），全自动荧光显微镜（德国 Zeiss 公司），倒置相差显微镜（日本 Olympus 公司），二氧化碳培养箱（日本 Sanyo 公司），电子天平（德国 Christ 公司），荧光酶标仪（德国 Leica 公司），流式细胞仪（美国 Beckman Coulter 公司）
1.3 方法
1.3.1 脂肪干细胞的分离培养
取新鲜脂肪组织，低温 3 h 内转移至实验室超净工作台。用磷酸缓冲盐溶液冲洗脂肪组织 3 次。用眼科剪修去脂肪组织中混有的筋膜及血管组织，并修剪为直径约 5 mm 的脂肪粒。将该脂肪粒转移至安瓶中修剪为 1 mm3左右大小的碎片。分别取 10 mL 脂肪碎片及 10 mL 0.1% 的Ⅰ型胶原酶置入 50 mL 离心管，充分摇匀，并置于 37℃ 水浴锅振荡消化 40～60 min 至浆糊状。15 mL 磷酸缓冲盐溶液加入离心管中稀释消化液，摇匀，并置于离心机中 1 200 r/min，离心 1 min。吸出上层脂肪组织，保留下层液体组织，于离心机中 1 200 r/min，继续离心 5 min。吸净上清液，保留沉淀。用 5 mL 含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 重悬，200 目筛网过滤，过滤后液体接种于 25 cm2培养瓶。实验使用第 3～5 代内细胞。
1.3.2 脂肪干细胞的鉴定
鉴定细胞为生长状态良好的第 3 代脂肪干细胞。制成 3×105/50 μL 单细胞悬液，分别加入荧光标记的抗体 CD34、CD45、CD73、CD90、CD105，混匀，避光孵育，离心，重悬，流式细胞仪检测。
成脂诱导以 8 000/cm2的密度接种。成脂诱导培养基配制：10% 胎牛血清，DMEM/F12，0.5 mmol/L IBMX，1 μmol/L 地塞米松，10 μmol/L 胰岛素，200 μmol/L 吲哚美辛。诱导 2 周后。油红 O 染色。镜下观察脂滴的形成。
成骨诱导以 4 000/cm2的密度接种。成骨诱导培养基配制：10% 胎牛血清，DMEM/F12，0.1 μmol/L 地塞米松，50 μmol/L 抗坏血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸钠。诱导 4 周后。茜素红染色，镜下观察钙结节的形成。
1.3.3 表皮细胞诱导培养基的配制
① 表皮细胞诱导培养基 A 配制：DMEM/F12，2% 胎牛血清，5 μmol/L ATRA，20 ng/mL EGF，10 ng/mL KGF，0.1 μmol/L 地塞米松。② 表皮细胞诱导培养基 B 配制：取 60%～70% 融合状态下的 HaCaT 细胞，更换新鲜 DMEM/F12 培养基，孵箱中培养 48 h 后吸出培养基，0.22 μm 过滤器过滤除菌制备成 HaCaT 条件培养基备用。将 HaCaT 条件培养基与普通培养基按 1∶1 比例配制为含 50% HaCaT 上清液的培养基，并将培养基配制为含 2% 胎牛血清、5 μmol/L ATRA、20 ng/mL EGF、10 ng/mL KGF、0.1 μmol/L 地塞米松的表皮诱导培养基 B。
1.3.4 诱导脂肪干细胞向表皮细胞方向分化
Transwell 小室为插入式的培养皿[11]，不同孔径及不同膜处理的 Transwell 小室，常应用于共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多方面的研究。本实验用六孔板 Transwell 小室构建气液界面培养。取Ⅳ型胶原包被小室膜。脂肪干细胞以 6 000/cm2的密度接种于小室膜上。上室加入 1 mL 培养基，下室加入 2 mL 培养基。24 h 后吸净上室培养基，下室更换条件培养基达上室膜平面，构建气液界面诱导培养。见图 1。
实验分 3 组：诱导组 A 为表皮诱导培养基 A，诱导组 B 为表皮诱导培养基 B，未诱导组为 DMEM/F12 普通培养基。置于 37℃ 5% 二氧化碳孵箱中培养。每 3 天换液 1 次，连续诱导 12 d，共 6 例原代细胞。
图1
Transwell 小室构建气液界面培养皿
将 Transwell 小室放入六孔板中，小室内称上室，孔板内称下室。两室以 3 μm 孔径的聚碳酸酯膜相隔，上室聚碳酸酯膜面接种细胞，下室加入培养基至膜面，构成气液界面培养
1.3.5 流式细胞术检测诱导后细胞 CK14、15、16、19 广谱细胞角蛋白（pan cytokeratin，Pan-CK）的表达
取各组培养 12 d 后细胞，消化、离心、重悬，4% 多聚甲醛固定 10 min，聚氧乙烯辛基苯基醚 Triton-X 100 破膜 10 min，制成 3×105/50 μL 单细胞悬液，加入带荧光的 Pan-CK 抗体，室温避光孵育 30 min，流式细胞仪检测。
1.3.6 免疫荧光染色法检测诱导后细胞 CK14 的表达
取各组培养 12 d 的细胞，胰酶乙二胺四乙酸消化后，以 2×104/cm2的密度接种于包被有Ⅳ型胶原的细胞爬片上，相应培养基继续培养 2 d。取出爬片，按照免疫荧光染色的步骤：4% 多聚甲醛室温 15 min 固定，Triton X-100 室温 20 min 破膜，羊血清 20 min 封闭爬片，1∶50 的浓度稀释鼠抗人 CK14 单克隆抗体，4℃ 过夜。1∶250 稀释 Alexa Fluor59 标记山羊抗鼠 IgG，避光 37℃ 1 h，4，6-联脒-2-苯基吲哚液染色，室温避光 5 min。荧光显微镜观察，每例细胞诱导 3 次，每次随机选取 4 个视野，Image-pro plus 软件计算每视野呈蓝色荧光细胞核的数量，人工点数红色荧光细胞的数量。计算每视野下红色荧光阳性细胞占总细胞的平均比例。
1.4 统计学方法
采用 SPSS 19.0 软件进行统计学数据分析。数据以均数±标准差表示，两组比较采用 t 检验进行统计学分析，三组比较采用 Kruskal-Wallis 秩和检验，若三组差异有统计学意义，采用 Nemenyi 检验进行两两比较。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 脂肪干细胞的分离培养与鉴定
新分离的脂肪干细胞镜下可见呈圆球形，透亮，并混有较多小圆形红细胞。48 h 后镜下可见贴壁细胞增多，细胞呈短梭形。第 7 天左右细胞达到 90% 融合。传代培养至第 10 代，细胞形态基本保持不变。第 3 代细胞如图 2a 所示：成纤维细胞形态样生长，长梭形，旋涡状。脂肪干细胞成脂诱导培养基培养后，油红 O 染色，可见细胞内大量大小不一的红棕色脂滴形成（图 2b）。成骨诱导培养基培养后，茜素红染色，可见深棕色钙结节形成（图 2c）。
流式细胞术检测细胞表面标志物，CD34、CD45 为造血干细胞及内皮细胞来源特征抗原，CD73、CD90、CD105 是间充质干细胞来源特征抗原，见表 1。本实验原代培养的细胞符合间充质干细胞的表面特征性抗原的表达，内皮细胞及造血细胞污染小。
图2
原代培养脂肪干细胞及成脂成骨诱导分化
a. 原代培养第 3 代细胞（×40），可见成纤维细胞形态样生长，长梭形，旋涡状；b. 成脂诱导分化后油红 O 染色（×100），可见细胞内大量大小不一红棕色脂滴形成；c. 成骨诱导分化后茜素红染色（×100），可见深棕色不均质钙结节形成
表1
脂肪干细胞表面标志物表达率（n=6，%，
）
2.2 成表皮细胞诱导后镜下观察
Transwell 小室膜光学显微镜下为非透明膜。诱导 12 d 后制备细胞爬片并继续诱导培养 3 d，镜下所见如图 3 所示。
图3
脂肪干细胞成表皮诱导后镜下观察
诱导组可见细胞形态小，形态由长梭形变为短梭形，部分细胞为圆形或类圆形，近似铺路石样改变；诱导组两组细胞形态无明显差异；未诱导组可见细胞仍保持条梭形，部分细胞开始出现老化的现象
2.3 流式细胞术检测细胞表面标志物 Pan-CK 的表达
共 6 例原代培养脂肪干细胞完成了诱导，诱导组均有不同程度表皮细胞标记 Pan-CK 的表达。其中 1 例细胞流式检测结果如图 4。流式细胞结果显示诱导组 B Pan-CK 表达率［（22.0±3.5）%］大于诱导组 A［（11.9±2.7）%］，两组均大于未诱导组 C［（1.1±0.3）%］。三组两两比较，差异有统计学意义（P<0.01）。含 HaCaT 细胞条件培养基的诱导组 B 角蛋白 Pan-CK 表达率更高。
图4
成表皮诱导后流式细胞仪检测 Pan-CK 的表达直方图
纵坐标为细胞数，横坐标为荧光值；a. 诱导组 A，Pan-CK 表达率为 14.0%；b. 诱导组 B，Pan-CK 表达率为 20.7%；c. 未诱导组，Pan-CK 表达率为 0.8%
2.4 免疫荧光染色法检测诱导后细胞 CK14 的表达
荧光显微镜下见脂肪干细胞成表皮诱导后，诱导组 A 及 B部分细胞具有标记 CK14 的红色荧光表达（图 5a、5b），未诱导组细胞 CK14 荧光染色为阴性（图 5c）。诱导组 B CK14 荧光染色呈阳性细胞占总细胞比例［（19.5±7.0）%］高于诱导组 A［（10.8± 5.7）%］，差异有统计学意义（P<0.01）。
图5
脂肪干细胞成表皮细胞诱导后 CK14 荧光染色
蓝色为细胞核，红色为 CK14 的表达；a. 诱导组 A；b. 诱导组 B；c. 未诱导组
3 讨论
组织工程学技术的出现为人类组织与器官的修复重建带来了新的希望。种子细胞为组织工程的三大要素之一。干细胞作为组织工程种子细胞的应用最具有前景。成体干细胞是成体不同组织的一群特殊的细胞，具有不同的分化能力，包括多能干细胞、寡能干细胞、定向干细胞等。间充质干细胞是其中的一大类，可以来源于骨髓、脐带血、羊水、骨骼肌、脂肪组织等[12]。国际细胞治疗学会制定了间充质干细胞最基本的标准：① 贴壁；② 多向分化的能力；③ 表达一些特殊的表面标志物：CD73，CD90，CD105；④ 不表达血管内皮来源及造血系统来源的表面标志物：CD11b 或 CD14，CD19 或 CD79，CD34，CD45 和人类白细胞抗原[13]。脂肪干细胞是来源于脂肪组织的间充质干细胞，与骨髓间充质干细胞相似，可以分化为中胚层细胞如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞等，其他胚层细胞如血管内皮细胞、神经纤维细胞、肌纤维细胞、肝细胞等[14-15]。由于取材的差异、分离培养方法的不尽相同以及培养传代时间的长短等，CD34、CD106、CD146 表面标志物的表达在不同研究中存在一些差异[16-19]。本实验从脂肪组织中分离培养的贴壁细胞在诱导培养基中实现了成脂和成骨的分化，表明了我们所获细胞具有一定的多向分化能力。流式细胞术检测结果显示干细胞特征性表面标志物 CD73、CD90、CD105 表达率高，血管内皮来源及造血系统来源细胞特征性表面标志物 CD34、CD45 表达率低，与国际细胞治疗学会制定的间充质干细胞的最基本标准相符。
2005 年，Brzoska 等[5]研究发现，ATRA 可诱导脂肪干细胞分化为表皮细胞，表明了脂肪干细胞具有跨胚层的成表皮分化的能力。在之后的研究中，也有学者利用 ATRA 联合 EGF、KGF 等多种生长因子来提高脂肪干细胞的成表皮分化能力。Li 等[11]利用含 2.5 μmol/L ATRA、20 ng/mL EGF、10 ng/mL KGF、10 ng/mL HGF 的培养基行气液界面诱导培养脂肪干细胞，CK 蛋白表达率相比未添加 KGF、HGF 组更高。类维甲酸通过与维甲酸核受体和维甲酸 X 核受体相结合在细胞的分化、增殖、凋亡中发挥着重要作用[20]。ATRA 是维生素 A 的活性代谢产物，能促进多种细胞的分化成熟[21]，在诱导干细胞向表皮细胞分化过程中发挥着重要作用。
气液界面诱导模型让细胞与空气直接接触可能具有促进干细胞上皮分化并形成复层结构的作用[22]，在 Long 等[6]的研究中，气液界面的培养是干细胞上皮分化的一个必需条件。气液界面培养结合 ATRA 及多种生长因子，模拟表皮细胞的自分泌旁分泌的生长微环境，诱导干细胞向表皮细胞方向分化[5-6, 12]。在本实验中，诱导组 A 通过 ATRA 及多种生长因子结合气液界面培养实现了脂肪干细胞诱导向表皮细胞方向的分化，镜下可见细胞形态由长梭形变为短梭形，部分细胞为圆形或类圆形，近似铺路石样改变，免疫荧光法及流式细胞术检测显示细胞表达了 CK 类蛋白 Pan-CK 及 CK14。CK 类蛋白是上皮细胞特征性的蛋白，作为细胞骨架蛋白，在维持上皮细胞，尤其是角质形成细胞的机械稳定性、完整性方面发挥着重要作用。CK 蛋白家族成员较多，不同类型上皮组织表达 CK 蛋白类型也有差异。CK14 作为表皮基底层细胞的主要结构蛋白，主要表达于表皮未分化的基底细胞层，在基底层以上表达逐渐降低[23]。
由人腹部表皮衍化而成的 HaCaT 细胞株具有与正常人角质形成细胞相似的分化特征。HaCaT 可以分泌多种生长因子、细胞因子、趋化因子等[24-25]。HaCat 可能通过这些因子作用于干细胞，促进干细胞向表皮细胞表型的分化[7-9]。本实验中，诱导组 B 为采用 50% HaCaT 的条件培养基联合 ATRA 及多种生长因子共同作用下实现了脂肪干细胞向表皮细胞表型的分化，CK 蛋白表达率高于不含 HaCaT 条件培养基的诱导组 A。HaCaT 分泌的某些成分改变了培养基中的微环境，促进了脂肪干细胞向表皮细胞的分化，提高了 ATRA 及生长因子诱导脂肪干细胞向表皮细胞分化的能力。
综上所述，添加 HaCaT 条件培养基提高了全反式维甲酸及 KGF、EGF 等生长因子对脂肪干细胞向表皮细胞诱导分化的作用，其中的具体分子机制还需要我们进一步探索研究。体外诱导脂肪干细胞向表皮细胞分化，为脂肪干细胞作为种子细胞构建组织工程皮肤提供了一个发展方向，为解决临床上常见的大面积烧伤、严重创伤患者皮源紧缺等问题提供了一个新的探索途径。
皮肤是人体最大的器官，大面积深度烧伤、急性创伤等可能造成大面积皮肤缺损。组织工程皮肤是修复大面积皮肤缺损有效方法之一。种子细胞为组织工程皮肤重要组成要素。以往研究较多的是角质形成细胞及成纤维细胞[1]。随着干细胞研究的不断深入，自体干细胞或许能成为组织工程领域理想的种子细胞。
间充质干细胞为近年来研究的热点。脂肪来源间充质干细胞可以通过微创的方法从人体获得，可以是体内多余的脂肪组织，对供体损伤小，来源丰富，体外容易培养，等量组织中干细胞含量要远远高于骨髓间充质干细胞；脂肪干细胞具有良好的自我增殖和多系分化潜能，能够向脂肪细胞、成骨细胞、肝细胞、内皮细胞等组织细胞分化[2-4]。2005 年，Brzoska 等[5]研究发现，全反式维甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）可诱导脂肪干细胞分化为表皮细胞，表明脂肪干细胞有向表皮方向分化的能力。Long 等[6]用 ATRA 联合生长因子同样诱导脂肪干细胞向表皮细胞分化。我国学者也利用人永生化角质形成细胞 HaCaT 与干细胞共培养的方式，成功诱导干细胞向表皮细胞表型分化[7-9]。诱导后表皮细胞角蛋白的表达率不同文献报道差异较大，为 9%～80%[5, 7, 10]。本研究用 ATRA 及生长因子结合 HaCaT 细胞条件培养基作为诱导条件，探讨提高脂肪干细胞向表皮诱导分化的方法。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本
脂肪取自四川大学华西医院美容整形/烧伤外科腹部取皮手术后多余的皮下脂肪组织或水动力抽脂机腹部抽吸的多余脂肪组织，研究经医院伦理委员会审批通过，患者签署相关知情同意书。
1.2 主要试剂与仪器
1.2.1 主要试剂
Dulbecco Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12（DMEM/F12）培养基（美国 Gibco 公司），Ⅰ型胶原酶（美国 Gibco 公司），胎牛血清（美国 Gibco 公司），山羊血清（杭州四季青公司），磷酸盐缓冲液（北京中杉金桥公司），3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobutyl-1-methyxanthine，IBMX）（美国 Sigma 公司），地塞米松（美国 Sigma 公司），胰酶（美国 Sigma 公司），PerCP-eFluor® 710 标记抗人 CD34 抗体（美国 eBioscience 公司），异硫氰酸荧光素标记抗人 CD45 抗体（美国 BD biosciences 公司），PE-Cyanine7 标记抗人 CD73 抗体（美国 eBioscience 公司），（Thy-1）别藻蓝蛋白标记抗人 CD90 抗体（美国 BD biosciences 公司），藻红蛋白标记抗人 CD105 抗体（美国 eBioscience 公司），藻红蛋白标记鼠抗人细胞角蛋白（cytokeratin，CK）14、15、16、19 抗体（美国 BD Pharmingen 公司），ATRA（美国 Sigma 公司），表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）（美国 PeproTech 公司），角质细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）（美国 PeproTech 公司），异硫氰酸荧光素标记山羊抗兔免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）（北京中杉金桥公司），Alexa Fluor594 标记山羊抗鼠 IgG（美国 Life Technology 公司），Ⅳ型胶原（美国 Sigma 公司），CK14 抗体（美国 Proteintech 公司），HaCaT 细胞（美国 ATCC 公司）。
1.2.2 主要仪器
显微镜（日本 Nikon 公司），全自动荧光显微镜（德国 Zeiss 公司），倒置相差显微镜（日本 Olympus 公司），二氧化碳培养箱（日本 Sanyo 公司），电子天平（德国 Christ 公司），荧光酶标仪（德国 Leica 公司），流式细胞仪（美国 Beckman Coulter 公司）
1.3 方法
1.3.1 脂肪干细胞的分离培养
取新鲜脂肪组织，低温 3 h 内转移至实验室超净工作台。用磷酸缓冲盐溶液冲洗脂肪组织 3 次。用眼科剪修去脂肪组织中混有的筋膜及血管组织，并修剪为直径约 5 mm 的脂肪粒。将该脂肪粒转移至安瓶中修剪为 1 mm3左右大小的碎片。分别取 10 mL 脂肪碎片及 10 mL 0.1% 的Ⅰ型胶原酶置入 50 mL 离心管，充分摇匀，并置于 37℃ 水浴锅振荡消化 40～60 min 至浆糊状。15 mL 磷酸缓冲盐溶液加入离心管中稀释消化液，摇匀，并置于离心机中 1 200 r/min，离心 1 min。吸出上层脂肪组织，保留下层液体组织，于离心机中 1 200 r/min，继续离心 5 min。吸净上清液，保留沉淀。用 5 mL 含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 重悬，200 目筛网过滤，过滤后液体接种于 25 cm2培养瓶。实验使用第 3～5 代内细胞。
1.3.2 脂肪干细胞的鉴定
鉴定细胞为生长状态良好的第 3 代脂肪干细胞。制成 3×105/50 μL 单细胞悬液，分别加入荧光标记的抗体 CD34、CD45、CD73、CD90、CD105，混匀，避光孵育，离心，重悬，流式细胞仪检测。
成脂诱导以 8 000/cm2的密度接种。成脂诱导培养基配制：10% 胎牛血清，DMEM/F12，0.5 mmol/L IBMX，1 μmol/L 地塞米松，10 μmol/L 胰岛素，200 μmol/L 吲哚美辛。诱导 2 周后。油红 O 染色。镜下观察脂滴的形成。
成骨诱导以 4 000/cm2的密度接种。成骨诱导培养基配制：10% 胎牛血清，DMEM/F12，0.1 μmol/L 地塞米松，50 μmol/L 抗坏血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸钠。诱导 4 周后。茜素红染色，镜下观察钙结节的形成。
1.3.3 表皮细胞诱导培养基的配制
① 表皮细胞诱导培养基 A 配制：DMEM/F12，2% 胎牛血清，5 μmol/L ATRA，20 ng/mL EGF，10 ng/mL KGF，0.1 μmol/L 地塞米松。② 表皮细胞诱导培养基 B 配制：取 60%～70% 融合状态下的 HaCaT 细胞，更换新鲜 DMEM/F12 培养基，孵箱中培养 48 h 后吸出培养基，0.22 μm 过滤器过滤除菌制备成 HaCaT 条件培养基备用。将 HaCaT 条件培养基与普通培养基按 1∶1 比例配制为含 50% HaCaT 上清液的培养基，并将培养基配制为含 2% 胎牛血清、5 μmol/L ATRA、20 ng/mL EGF、10 ng/mL KGF、0.1 μmol/L 地塞米松的表皮诱导培养基 B。
1.3.4 诱导脂肪干细胞向表皮细胞方向分化
Transwell 小室为插入式的培养皿[11]，不同孔径及不同膜处理的 Transwell 小室，常应用于共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多方面的研究。本实验用六孔板 Transwell 小室构建气液界面培养。取Ⅳ型胶原包被小室膜。脂肪干细胞以 6 000/cm2的密度接种于小室膜上。上室加入 1 mL 培养基，下室加入 2 mL 培养基。24 h 后吸净上室培养基，下室更换条件培养基达上室膜平面，构建气液界面诱导培养。见图 1。
实验分 3 组：诱导组 A 为表皮诱导培养基 A，诱导组 B 为表皮诱导培养基 B，未诱导组为 DMEM/F12 普通培养基。置于 37℃ 5% 二氧化碳孵箱中培养。每 3 天换液 1 次，连续诱导 12 d，共 6 例原代细胞。
图1
Transwell 小室构建气液界面培养皿
将 Transwell 小室放入六孔板中，小室内称上室，孔板内称下室。两室以 3 μm 孔径的聚碳酸酯膜相隔，上室聚碳酸酯膜面接种细胞，下室加入培养基至膜面，构成气液界面培养
1.3.5 流式细胞术检测诱导后细胞 CK14、15、16、19 广谱细胞角蛋白（pan cytokeratin，Pan-CK）的表达
取各组培养 12 d 后细胞，消化、离心、重悬，4% 多聚甲醛固定 10 min，聚氧乙烯辛基苯基醚 Triton-X 100 破膜 10 min，制成 3×105/50 μL 单细胞悬液，加入带荧光的 Pan-CK 抗体，室温避光孵育 30 min，流式细胞仪检测。
1.3.6 免疫荧光染色法检测诱导后细胞 CK14 的表达
取各组培养 12 d 的细胞，胰酶乙二胺四乙酸消化后，以 2×104/cm2的密度接种于包被有Ⅳ型胶原的细胞爬片上，相应培养基继续培养 2 d。取出爬片，按照免疫荧光染色的步骤：4% 多聚甲醛室温 15 min 固定，Triton X-100 室温 20 min 破膜，羊血清 20 min 封闭爬片，1∶50 的浓度稀释鼠抗人 CK14 单克隆抗体，4℃ 过夜。1∶250 稀释 Alexa Fluor59 标记山羊抗鼠 IgG，避光 37℃ 1 h，4，6-联脒-2-苯基吲哚液染色，室温避光 5 min。荧光显微镜观察，每例细胞诱导 3 次，每次随机选取 4 个视野，Image-pro plus 软件计算每视野呈蓝色荧光细胞核的数量，人工点数红色荧光细胞的数量。计算每视野下红色荧光阳性细胞占总细胞的平均比例。
1.4 统计学方法
采用 SPSS 19.0 软件进行统计学数据分析。数据以均数±标准差表示，两组比较采用 t 检验进行统计学分析，三组比较采用 Kruskal-Wallis 秩和检验，若三组差异有统计学意义，采用 Nemenyi 检验进行两两比较。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 脂肪干细胞的分离培养与鉴定
新分离的脂肪干细胞镜下可见呈圆球形，透亮，并混有较多小圆形红细胞。48 h 后镜下可见贴壁细胞增多，细胞呈短梭形。第 7 天左右细胞达到 90% 融合。传代培养至第 10 代，细胞形态基本保持不变。第 3 代细胞如图 2a 所示：成纤维细胞形态样生长，长梭形，旋涡状。脂肪干细胞成脂诱导培养基培养后，油红 O 染色，可见细胞内大量大小不一的红棕色脂滴形成（图 2b）。成骨诱导培养基培养后，茜素红染色，可见深棕色钙结节形成（图 2c）。
流式细胞术检测细胞表面标志物，CD34、CD45 为造血干细胞及内皮细胞来源特征抗原，CD73、CD90、CD105 是间充质干细胞来源特征抗原，见表 1。本实验原代培养的细胞符合间充质干细胞的表面特征性抗原的表达，内皮细胞及造血细胞污染小。
图2
原代培养脂肪干细胞及成脂成骨诱导分化
a. 原代培养第 3 代细胞（×40），可见成纤维细胞形态样生长，长梭形，旋涡状；b. 成脂诱导分化后油红 O 染色（×100），可见细胞内大量大小不一红棕色脂滴形成；c. 成骨诱导分化后茜素红染色（×100），可见深棕色不均质钙结节形成
表1
脂肪干细胞表面标志物表达率（n=6，%，
）
2.2 成表皮细胞诱导后镜下观察
Transwell 小室膜光学显微镜下为非透明膜。诱导 12 d 后制备细胞爬片并继续诱导培养 3 d，镜下所见如图 3 所示。
图3
脂肪干细胞成表皮诱导后镜下观察
诱导组可见细胞形态小，形态由长梭形变为短梭形，部分细胞为圆形或类圆形，近似铺路石样改变；诱导组两组细胞形态无明显差异；未诱导组可见细胞仍保持条梭形，部分细胞开始出现老化的现象
2.3 流式细胞术检测细胞表面标志物 Pan-CK 的表达
共 6 例原代培养脂肪干细胞完成了诱导，诱导组均有不同程度表皮细胞标记 Pan-CK 的表达。其中 1 例细胞流式检测结果如图 4。流式细胞结果显示诱导组 B Pan-CK 表达率［（22.0±3.5）%］大于诱导组 A［（11.9±2.7）%］，两组均大于未诱导组 C［（1.1±0.3）%］。三组两两比较，差异有统计学意义（P<0.01）。含 HaCaT 细胞条件培养基的诱导组 B 角蛋白 Pan-CK 表达率更高。
图4
成表皮诱导后流式细胞仪检测 Pan-CK 的表达直方图
纵坐标为细胞数，横坐标为荧光值；a. 诱导组 A，Pan-CK 表达率为 14.0%；b. 诱导组 B，Pan-CK 表达率为 20.7%；c. 未诱导组，Pan-CK 表达率为 0.8%
2.4 免疫荧光染色法检测诱导后细胞 CK14 的表达
荧光显微镜下见脂肪干细胞成表皮诱导后，诱导组 A 及 B部分细胞具有标记 CK14 的红色荧光表达（图 5a、5b），未诱导组细胞 CK14 荧光染色为阴性（图 5c）。诱导组 B CK14 荧光染色呈阳性细胞占总细胞比例［（19.5±7.0）%］高于诱导组 A［（10.8± 5.7）%］，差异有统计学意义（P<0.01）。
图5
脂肪干细胞成表皮细胞诱导后 CK14 荧光染色
蓝色为细胞核，红色为 CK14 的表达；a. 诱导组 A；b. 诱导组 B；c. 未诱导组
3 讨论
组织工程学技术的出现为人类组织与器官的修复重建带来了新的希望。种子细胞为组织工程的三大要素之一。干细胞作为组织工程种子细胞的应用最具有前景。成体干细胞是成体不同组织的一群特殊的细胞，具有不同的分化能力，包括多能干细胞、寡能干细胞、定向干细胞等。间充质干细胞是其中的一大类，可以来源于骨髓、脐带血、羊水、骨骼肌、脂肪组织等[12]。国际细胞治疗学会制定了间充质干细胞最基本的标准：① 贴壁；② 多向分化的能力；③ 表达一些特殊的表面标志物：CD73，CD90，CD105；④ 不表达血管内皮来源及造血系统来源的表面标志物：CD11b 或 CD14，CD19 或 CD79，CD34，CD45 和人类白细胞抗原[13]。脂肪干细胞是来源于脂肪组织的间充质干细胞，与骨髓间充质干细胞相似，可以分化为中胚层细胞如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞等，其他胚层细胞如血管内皮细胞、神经纤维细胞、肌纤维细胞、肝细胞等[14-15]。由于取材的差异、分离培养方法的不尽相同以及培养传代时间的长短等，CD34、CD106、CD146 表面标志物的表达在不同研究中存在一些差异[16-19]。本实验从脂肪组织中分离培养的贴壁细胞在诱导培养基中实现了成脂和成骨的分化，表明了我们所获细胞具有一定的多向分化能力。流式细胞术检测结果显示干细胞特征性表面标志物 CD73、CD90、CD105 表达率高，血管内皮来源及造血系统来源细胞特征性表面标志物 CD34、CD45 表达率低，与国际细胞治疗学会制定的间充质干细胞的最基本标准相符。
2005 年，Brzoska 等[5]研究发现，ATRA 可诱导脂肪干细胞分化为表皮细胞，表明了脂肪干细胞具有跨胚层的成表皮分化的能力。在之后的研究中，也有学者利用 ATRA 联合 EGF、KGF 等多种生长因子来提高脂肪干细胞的成表皮分化能力。Li 等[11]利用含 2.5 μmol/L ATRA、20 ng/mL EGF、10 ng/mL KGF、10 ng/mL HGF 的培养基行气液界面诱导培养脂肪干细胞，CK 蛋白表达率相比未添加 KGF、HGF 组更高。类维甲酸通过与维甲酸核受体和维甲酸 X 核受体相结合在细胞的分化、增殖、凋亡中发挥着重要作用[20]。ATRA 是维生素 A 的活性代谢产物，能促进多种细胞的分化成熟[21]，在诱导干细胞向表皮细胞分化过程中发挥着重要作用。
气液界面诱导模型让细胞与空气直接接触可能具有促进干细胞上皮分化并形成复层结构的作用[22]，在 Long 等[6]的研究中，气液界面的培养是干细胞上皮分化的一个必需条件。气液界面培养结合 ATRA 及多种生长因子，模拟表皮细胞的自分泌旁分泌的生长微环境，诱导干细胞向表皮细胞方向分化[5-6, 12]。在本实验中，诱导组 A 通过 ATRA 及多种生长因子结合气液界面培养实现了脂肪干细胞诱导向表皮细胞方向的分化，镜下可见细胞形态由长梭形变为短梭形，部分细胞为圆形或类圆形，近似铺路石样改变，免疫荧光法及流式细胞术检测显示细胞表达了 CK 类蛋白 Pan-CK 及 CK14。CK 类蛋白是上皮细胞特征性的蛋白，作为细胞骨架蛋白，在维持上皮细胞，尤其是角质形成细胞的机械稳定性、完整性方面发挥着重要作用。CK 蛋白家族成员较多，不同类型上皮组织表达 CK 蛋白类型也有差异。CK14 作为表皮基底层细胞的主要结构蛋白，主要表达于表皮未分化的基底细胞层，在基底层以上表达逐渐降低[23]。
由人腹部表皮衍化而成的 HaCaT 细胞株具有与正常人角质形成细胞相似的分化特征。HaCaT 可以分泌多种生长因子、细胞因子、趋化因子等[24-25]。HaCat 可能通过这些因子作用于干细胞，促进干细胞向表皮细胞表型的分化[7-9]。本实验中，诱导组 B 为采用 50% HaCaT 的条件培养基联合 ATRA 及多种生长因子共同作用下实现了脂肪干细胞向表皮细胞表型的分化，CK 蛋白表达率高于不含 HaCaT 条件培养基的诱导组 A。HaCaT 分泌的某些成分改变了培养基中的微环境，促进了脂肪干细胞向表皮细胞的分化，提高了 ATRA 及生长因子诱导脂肪干细胞向表皮细胞分化的能力。
综上所述，添加 HaCaT 条件培养基提高了全反式维甲酸及 KGF、EGF 等生长因子对脂肪干细胞向表皮细胞诱导分化的作用，其中的具体分子机制还需要我们进一步探索研究。体外诱导脂肪干细胞向表皮细胞分化，为脂肪干细胞作为种子细胞构建组织工程皮肤提供了一个发展方向，为解决临床上常见的大面积烧伤、严重创伤患者皮源紧缺等问题提供了一个新的探索途径。
