引用本文： 曹贵华, 闫永吉, 陈戬, 张海燕, 王光, 李沛, 石鑫. Fibulin-5 基因沉默对人膀胱癌细胞 5637 增殖活力及迁移力的影响. 华西医学, 2018, 33(4): 417-422. doi: 10.7507/1002-0179.201701037 复制
膀胱癌以其较高的发病率和死亡率居于泌尿系统恶性肿瘤首位，其中，浸润性膀胱尿路上皮癌最易发生侵袭和转移，恶性程度较高，而膀胱癌一旦侵及周围组织或发生远处转移，患者生存率就会显著下降[1-3]。阻止膀胱癌侵袭和转移是早期防治膀胱癌的关键，目前，膀胱癌侵袭和转移的分子机制尚不完全清楚。
Fibulin-5 是细胞外基质蛋白 Fibulin 家族的一员，可以结合整合素，进而参与细胞内信号传导以影响细胞的增殖、迁移及黏附[4-5]。据报道，Fibulin-5 在肾脏、乳腺、卵巢、子宫内膜、结肠、肺、前列腺及膀胱等组织器官的恶性肿瘤中，尤其是在发生转移的恶性肿瘤中表达下调[6-10]，研究还表明，Fibulin-5 高表达具有抑制肺癌和乳腺癌细胞远处转移灶形成的作用[11-13]，提示 Fibulin-5 具有抑制肿瘤转移的作用。近年研究显示，Fibulin-5 在发育过程尤其是血管形成时表达活跃，但在大部分成体组织中表达显著下调。然而在血管损伤或是其他病理条件下，如恶性肿瘤，Fibulin-5 的表达会被重新激活而上调[14]。Lee 等[15]报道，Fibulin-5 可以诱导乳腺癌上皮细胞基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）表达并促进乳腺癌细胞上皮-间质转化，且还在鼻咽癌和胰腺胆管癌的形成过程中起促进作用[16-17]，另外，Fibulin-5 基因沉默可抑制胃癌细胞的增殖和侵袭能力[18]，这似乎又与前述 Fibulin-5 抑制肿瘤发生发展的作用存在矛盾，但研究表明，Fibulin-5 在肿瘤发生发展过程中可能存在时期特异性[6]和情境特异性[7]。Fibulin-5 在膀胱癌组织中表达下调，并且已有研究表明，过表达 Fibulin-5 可抑制膀胱癌细胞 5637 的生长和迁移[9]，但其具体机制尚不完全清楚。
本研究拟从另一角度入手，利用膀胱癌细胞 5637 建立 Fibulin-5 基因沉默的稳定细胞株，以观测其生长和迁移情况，并筛选和检测 Fibulin-5 沉默后受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）的表达情况，以期阐明 Fibulin-5 基因表达对膀胱癌细胞增殖与迁移的影响及其机制，为后期膀胱癌发生发展的机制研究和临床防治提供实验数据与理论支持。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 细胞、慢病毒、试剂盒及分组
人膀胱癌细胞 5637（上海细胞生物所）；Fibulin-5 RNA 干扰（RNA interference，RNAi）慢病毒（上海吉凯基因化学技术有限公司）；PathScan® RTK 信号通路抗体芯片试剂盒（美国细胞信号技术公司）。实验分为阴性对照病毒感染的细胞组（NC 组）和 Fibulin-5 RNAi 慢病毒［Fibulin-5 基因短发夹 RNA（short hairpin RNA，shRNA）病毒］感染的细胞组（F5 组）。
1.2 实验方法
1.2.1 Fibulin-5 RNAi 载体构建
人 Fibulin-5 基因，序列号 NM_006329，shRNA 靶序列：AGCAGACGTGCTACAATTT，载体为 hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin。采用重组体 DNA 技术制备包含 shRNA 靶序列的重组载体，在 293T 细胞中包装为慢病毒 hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-shRNA-puromycin。
1.2.2 Fibulin-5 基因沉默细胞株的建立及 Fibulin-5 mRNA 实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）检测
将对数生长期的 5637 细胞胰酶消化，用完全培养基 RPMI-1640+10% 胎牛血清制成 5×104 个/mL 细胞悬液，2 mL/孔接种到 6 孔板中，培养到铺板率为 30% 时感染，感染复数为 10，感染 16 h 后更换为完全培养基，72 h 后观察感染细胞的荧光，同时添加 1 μg/mL 的 puromysin 进行筛选，48 h 后收集细胞标本，提取总 RNA，使用 Promega M-MLV 试剂盒获得互补 DNA，分别采用引物对 5’-CATTGCAGTGATATGGACGAGT-3’、5’-CGTGTGGTTCCTGTGCTCACAT-3’ 检测 Fibulin-5 mRNA 表达，采用引物对 5’-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3’、5’-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3’ 检测 ACTB mRNA 表达，并利用 SYBR premix ex taq 行（95℃-5 s，60℃-30 s）两步法 qPCR，且进行相对定量分析，相对定量 F=2–ΔΔCt（–ΔΔCt=NC 组 ΔCt 平均值–各样品 ΔCt 值，ΔCt=目的基因 Fibulin-5 Ct 值–内参基因 ACTB Ct 值）
1.2.3 3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐［3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］检测生长曲线的变化
将 NC 组 5637 细胞及 Fibulin-5 基因沉默后的 5637 细胞分别接于 96 孔板，2 000 个细胞/孔，每组设 5 个重复，分别于培养 1、2、3、4、5 d 行 MTT 检测，培养终止前 4 h 加入 20 μL 5 mg/mL 的 MTT 于孔中，4 h 后完全吸去培养液，加 100 μL 二甲基亚砜，振荡器振荡 5 min，酶标仪 490 nm 检测各个培养孔的吸光度值，绘制 NC 组 5637 细胞及 Fibulin-5 基因沉默后的 5637 细胞的生长曲线，并计算生长抑制率。
1.2.4 细胞划痕检测细胞迁移率的变化
将 NC 组 5637 细胞和 Fibulin-5 基因沉默后的 5637 细胞接种于 96 孔板，3×104 个细胞/孔，每组设 5 个重复，划痕时更换低浓度血清培养基（0.5% 胎牛血清），使用划痕仪向上轻推形成划痕。使用无血清培养基轻轻漂洗细胞 2 遍，加入低浓度血清培养基，在 37℃、5%二氧化碳培养箱培养，并分别于划痕处理后 0、4、8 h 拍照，测量划痕的宽度，计算各组细胞迁移率。
1.2.5 Pathscan RTK 检测
分别将 NC 组 5637 细胞和 Fibulin-5 基因沉默后的 5637 细胞提取总蛋白，每组设 3 个重复，按照 PathScan® RTK 信号通路抗体芯片试剂盒说明书操作检测各个目的蛋白的相对表达量。
1.3 统计学方法
实验数据应用 SPSS 13.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）荧光检测
感染后 72 h，F5 组和 NC 组细胞于荧光显微镜下观察 GFP 表达情况，荧光细胞阳性率均达 70% 以上（图 1），可进行后续筛选实验。
图1
慢病毒感染 72 h 后 5637 细胞的 GFP 荧光
转染后两组细胞的荧光细胞阳性率均达 70% 以上。a. NC 组（GFP×200）；b. F5 组（GFP×200）；c. NC 组（明视野×200）；d. F5 组（明视野×200）
2.2 qPCR 检测 Fibulin-5 mRNA 的表达
采用 qPCR 技术对两组细胞检测的结果显示，F5 组较 NC 组 5637 细胞 Fibulin-5 mRNA 表达水平显著下降（0.067±0.013 vs. 1.001±0.000），敲减效率达到 93.3%（图 2），Fibulin-5 基因 shRNA 沉默效果显著。
图2
慢病毒感染后 5637 细胞 Fibulin-5 mRNA 的表达水平变化
*与 NC 组相比，F5 组 5637 细胞 Fibulin-5 mRNA 相对表达量差异有统计学意义（
2.3 MTT 检测 5637 细胞的增殖活性
利用 MTT 法连续 5 d 检测 NC 组和 F5 组的 5637 细胞活性，统计结果表明，与 NC 组相比，F5 组 5637 细胞在各个时间点增殖活力都有降低，其中在第 3、4、5 天显著下降，增殖速度减缓明显。见图 3、表 1。
表1
慢病毒感染后 5637 细胞相对吸光度值（
）
图3
慢病毒感染后 5637 细胞增殖活性的变化
*与 NC 组相比，F5 组 5637 细胞相对吸光度值差异有统计学意义（
2.4 细胞划痕检测 5637 细胞的迁移率
细胞划痕检测显示，F5 组 5637 细胞在 4、8 h 的相对迁移率分别为 0.14±0.06、0.26±0.04，显著低于 NC 组细胞 4、8 h 的相对迁移率（0.47±0.05、1.00±0.00），与 NC 组比较，F5 组 5637 细胞迁移速度明显减缓（图 4）。
图4
慢病毒感染后 5637 细胞相对迁移率变化
*与 NC 组相比，F5 组 5637 细胞相对迁移率差异有统计学意义（
2.5 Pathscan RTK 检测
Fibulin-5 基因沉默后，检测 5637 细胞 RTK 信号通路相关蛋白的表达变化，数据结果见图 5、表 2。相较于 NC 组，F5 组 5637 细胞间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）、Axl、p44/42 丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK)［胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2］、Src 蛋白水平显著升高，表达上调百分比分别为 26.63%、35.05%、34.76%、16.25%。
表2
Pathscan 检测 ALK、Axl、p44/42 MAPK （ERK1/2）、Src 蛋白的灰度值
图5
Pathscan 检测 ALK、Axl、p44/42 MAPK（ERK1/2）、Src 蛋白的灰度值
*与 NC 组相比，F5 组 5637 细胞蛋白灰度值差异有统计学意义（
3 讨论
Fibulin-5 是一种定位于细胞外基质的分泌性糖蛋白，为包括血管平滑肌细胞、成纤维细胞及内皮细胞等多种细胞所分泌，并在弹性纤维形成过程中发挥重要的作用。近年来研究表明，Fibulin-5 对肿瘤发生发展有重要作用，其作用机制研究也逐渐成为研究的热点。Fibulin-5 可通过 RGD 依赖的整合素信号来抑制 ERK 活性，从而导致 MMP-7 转录抑制，而后者在肺癌浸润过程中至关重要[11]；Fibulin-5 亦可通过抑制 MMP-9 的产生来降低成纤维细胞的侵袭能力以抑制远处转移灶的形成[12, 19]；Fibulin-5 可消除 ERK 对 GSK3β 的激活作用，来阻止 MMP-7 和 c-Myc 的表达，从而阻断了 Wnt/β-catenin 信号通路，后者在肿瘤发生发展及远处转移过程中起到关键作用[13, 20]。上述研究业已阐述了 Fibulin-5 抑制肿瘤生长和转移的作用机制。然而，Fibulin-5 还存在促进肿瘤生长及运动能力的作用。据报道，在特定环境下，Fibulin-5 可作为转化生因子-β 的靶基因来激活 ERK1/2 和 p38 MAPK 以控制细胞的生长和运动[7]，并可作为分子变阻器来调节细胞基质相互作用以降低活性氧的产生，从而促进胰腺胆管癌的发生发展[17]；另外，Fibulin-5 在胃癌组织中表达上调，其基因沉默可降低胃癌细胞株 MGC-803 的增殖和侵袭能力[18, 21]。由此可见，Fibulin-5 在肿瘤发生发展和转移过程中的功能可能存在组织和环境特异性，以致其作用存在差异甚至截然相反。膀胱癌细胞 5637 的 Fibulin-5 过表达细胞株细胞的增殖和迁移能力明显降低[9]，但其机制尚不清楚。
本研究利用 Fibulin-5 RNAi 慢病毒感染膀胱癌细胞 5637 建立了 Fibulin-5 基因沉默细胞株，并对其增殖活性和迁移能力进行了探究，结果显示，Fibulin-5 基因沉默后，5637 细胞的增殖活性和迁移能力较 NC 组显著降低，提示 Fibulin-5 基因的沉默对膀胱癌细胞的增殖活性有抑制作用，这与 Hu 等[9]的研究结果似乎存在一些矛盾。为探究了这一现象的原因，我们还对 Fibulin-5 基因沉默细胞株 RTK 信号通路中 39 种主要的蛋白进行了 PathScan 检测，结果显示，ALK、Axl、p44/42 MAPK（ERK1/2）、Src 蛋白水平显著高于 NC 组细胞，表达上调百分比分别为 26.63%、35.05%、34.76%、16.25%。众所周知，这些蛋白与细胞的增殖、黏附、迁移密切相关，且相互之间联系紧密，它们的表达上调意涵细胞生长和转移能力的增强。Fibulin-5 基因的沉默，使 ERK 及与其激活密切相关的 ALK、Axl、Src 蛋白表达均有所上调，提示 Fibulin-5 可能具有抑制 ERK 及其通路蛋白的作用，这与以往研究倒也相一致[13, 20]，但此时细胞增殖活力和转移能力本应该提高，然而本研究结果表明，Fibulin-5 基因的沉默使膀胱癌细胞 5637 增殖活力和迁移力较 NC 组均有所降低。我们猜测，Fibulin-5 与弹性纤维形成密切相关，其基因的沉默势必会影响弹性纤维的组装及正常功能的发挥，继而使细胞骨架及形态处于非正常状态，生理结构及功能的改变使细胞活力、黏附及迁移能力均受到不同程度的影响，而细胞处在这种状态下，即使 ERK 得到激活可能也很难提高细胞的增殖和迁移能力。
本研究仅初步探讨了 Fibulin-5 基因沉默对膀胱癌细胞株 5637 的影响，由于实验样本数量和研究范围有限，致使研究还存在很多问题尚未解决，如 Fibulin-5 的存在是否使 ERK 处于被抑制状态而沉默后表达激活、Fibulin-5 沉默后细胞活力的下降是否因为生理状态的改变、Fibulin-5 过表达时 ERK 等 RTK 表达水平及活力处于何种状态等，因此，Fibulin-5 在膀胱癌组织细胞中的作用及其机制研究还有待进一步的探究和阐明。
膀胱癌以其较高的发病率和死亡率居于泌尿系统恶性肿瘤首位，其中，浸润性膀胱尿路上皮癌最易发生侵袭和转移，恶性程度较高，而膀胱癌一旦侵及周围组织或发生远处转移，患者生存率就会显著下降[1-3]。阻止膀胱癌侵袭和转移是早期防治膀胱癌的关键，目前，膀胱癌侵袭和转移的分子机制尚不完全清楚。
Fibulin-5 是细胞外基质蛋白 Fibulin 家族的一员，可以结合整合素，进而参与细胞内信号传导以影响细胞的增殖、迁移及黏附[4-5]。据报道，Fibulin-5 在肾脏、乳腺、卵巢、子宫内膜、结肠、肺、前列腺及膀胱等组织器官的恶性肿瘤中，尤其是在发生转移的恶性肿瘤中表达下调[6-10]，研究还表明，Fibulin-5 高表达具有抑制肺癌和乳腺癌细胞远处转移灶形成的作用[11-13]，提示 Fibulin-5 具有抑制肿瘤转移的作用。近年研究显示，Fibulin-5 在发育过程尤其是血管形成时表达活跃，但在大部分成体组织中表达显著下调。然而在血管损伤或是其他病理条件下，如恶性肿瘤，Fibulin-5 的表达会被重新激活而上调[14]。Lee 等[15]报道，Fibulin-5 可以诱导乳腺癌上皮细胞基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）表达并促进乳腺癌细胞上皮-间质转化，且还在鼻咽癌和胰腺胆管癌的形成过程中起促进作用[16-17]，另外，Fibulin-5 基因沉默可抑制胃癌细胞的增殖和侵袭能力[18]，这似乎又与前述 Fibulin-5 抑制肿瘤发生发展的作用存在矛盾，但研究表明，Fibulin-5 在肿瘤发生发展过程中可能存在时期特异性[6]和情境特异性[7]。Fibulin-5 在膀胱癌组织中表达下调，并且已有研究表明，过表达 Fibulin-5 可抑制膀胱癌细胞 5637 的生长和迁移[9]，但其具体机制尚不完全清楚。
本研究拟从另一角度入手，利用膀胱癌细胞 5637 建立 Fibulin-5 基因沉默的稳定细胞株，以观测其生长和迁移情况，并筛选和检测 Fibulin-5 沉默后受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）的表达情况，以期阐明 Fibulin-5 基因表达对膀胱癌细胞增殖与迁移的影响及其机制，为后期膀胱癌发生发展的机制研究和临床防治提供实验数据与理论支持。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 细胞、慢病毒、试剂盒及分组
人膀胱癌细胞 5637（上海细胞生物所）；Fibulin-5 RNA 干扰（RNA interference，RNAi）慢病毒（上海吉凯基因化学技术有限公司）；PathScan® RTK 信号通路抗体芯片试剂盒（美国细胞信号技术公司）。实验分为阴性对照病毒感染的细胞组（NC 组）和 Fibulin-5 RNAi 慢病毒［Fibulin-5 基因短发夹 RNA（short hairpin RNA，shRNA）病毒］感染的细胞组（F5 组）。
1.2 实验方法
1.2.1 Fibulin-5 RNAi 载体构建
人 Fibulin-5 基因，序列号 NM_006329，shRNA 靶序列：AGCAGACGTGCTACAATTT，载体为 hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin。采用重组体 DNA 技术制备包含 shRNA 靶序列的重组载体，在 293T 细胞中包装为慢病毒 hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-shRNA-puromycin。
1.2.2 Fibulin-5 基因沉默细胞株的建立及 Fibulin-5 mRNA 实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）检测
将对数生长期的 5637 细胞胰酶消化，用完全培养基 RPMI-1640+10% 胎牛血清制成 5×104 个/mL 细胞悬液，2 mL/孔接种到 6 孔板中，培养到铺板率为 30% 时感染，感染复数为 10，感染 16 h 后更换为完全培养基，72 h 后观察感染细胞的荧光，同时添加 1 μg/mL 的 puromysin 进行筛选，48 h 后收集细胞标本，提取总 RNA，使用 Promega M-MLV 试剂盒获得互补 DNA，分别采用引物对 5’-CATTGCAGTGATATGGACGAGT-3’、5’-CGTGTGGTTCCTGTGCTCACAT-3’ 检测 Fibulin-5 mRNA 表达，采用引物对 5’-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3’、5’-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3’ 检测 ACTB mRNA 表达，并利用 SYBR premix ex taq 行（95℃-5 s，60℃-30 s）两步法 qPCR，且进行相对定量分析，相对定量 F=2–ΔΔCt（–ΔΔCt=NC 组 ΔCt 平均值–各样品 ΔCt 值，ΔCt=目的基因 Fibulin-5 Ct 值–内参基因 ACTB Ct 值）
1.2.3 3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐［3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］检测生长曲线的变化
将 NC 组 5637 细胞及 Fibulin-5 基因沉默后的 5637 细胞分别接于 96 孔板，2 000 个细胞/孔，每组设 5 个重复，分别于培养 1、2、3、4、5 d 行 MTT 检测，培养终止前 4 h 加入 20 μL 5 mg/mL 的 MTT 于孔中，4 h 后完全吸去培养液，加 100 μL 二甲基亚砜，振荡器振荡 5 min，酶标仪 490 nm 检测各个培养孔的吸光度值，绘制 NC 组 5637 细胞及 Fibulin-5 基因沉默后的 5637 细胞的生长曲线，并计算生长抑制率。
1.2.4 细胞划痕检测细胞迁移率的变化
将 NC 组 5637 细胞和 Fibulin-5 基因沉默后的 5637 细胞接种于 96 孔板，3×104 个细胞/孔，每组设 5 个重复，划痕时更换低浓度血清培养基（0.5% 胎牛血清），使用划痕仪向上轻推形成划痕。使用无血清培养基轻轻漂洗细胞 2 遍，加入低浓度血清培养基，在 37℃、5%二氧化碳培养箱培养，并分别于划痕处理后 0、4、8 h 拍照，测量划痕的宽度，计算各组细胞迁移率。
1.2.5 Pathscan RTK 检测
分别将 NC 组 5637 细胞和 Fibulin-5 基因沉默后的 5637 细胞提取总蛋白，每组设 3 个重复，按照 PathScan® RTK 信号通路抗体芯片试剂盒说明书操作检测各个目的蛋白的相对表达量。
1.3 统计学方法
实验数据应用 SPSS 13.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）荧光检测
感染后 72 h，F5 组和 NC 组细胞于荧光显微镜下观察 GFP 表达情况，荧光细胞阳性率均达 70% 以上（图 1），可进行后续筛选实验。
图1
慢病毒感染 72 h 后 5637 细胞的 GFP 荧光
转染后两组细胞的荧光细胞阳性率均达 70% 以上。a. NC 组（GFP×200）；b. F5 组（GFP×200）；c. NC 组（明视野×200）；d. F5 组（明视野×200）
2.2 qPCR 检测 Fibulin-5 mRNA 的表达
采用 qPCR 技术对两组细胞检测的结果显示，F5 组较 NC 组 5637 细胞 Fibulin-5 mRNA 表达水平显著下降（0.067±0.013 vs. 1.001±0.000），敲减效率达到 93.3%（图 2），Fibulin-5 基因 shRNA 沉默效果显著。
图2
慢病毒感染后 5637 细胞 Fibulin-5 mRNA 的表达水平变化
*与 NC 组相比，F5 组 5637 细胞 Fibulin-5 mRNA 相对表达量差异有统计学意义（
2.3 MTT 检测 5637 细胞的增殖活性
利用 MTT 法连续 5 d 检测 NC 组和 F5 组的 5637 细胞活性，统计结果表明，与 NC 组相比，F5 组 5637 细胞在各个时间点增殖活力都有降低，其中在第 3、4、5 天显著下降，增殖速度减缓明显。见图 3、表 1。
表1
慢病毒感染后 5637 细胞相对吸光度值（
）
图3
慢病毒感染后 5637 细胞增殖活性的变化
*与 NC 组相比，F5 组 5637 细胞相对吸光度值差异有统计学意义（
2.4 细胞划痕检测 5637 细胞的迁移率
细胞划痕检测显示，F5 组 5637 细胞在 4、8 h 的相对迁移率分别为 0.14±0.06、0.26±0.04，显著低于 NC 组细胞 4、8 h 的相对迁移率（0.47±0.05、1.00±0.00），与 NC 组比较，F5 组 5637 细胞迁移速度明显减缓（图 4）。
图4
慢病毒感染后 5637 细胞相对迁移率变化
*与 NC 组相比，F5 组 5637 细胞相对迁移率差异有统计学意义（
2.5 Pathscan RTK 检测
Fibulin-5 基因沉默后，检测 5637 细胞 RTK 信号通路相关蛋白的表达变化，数据结果见图 5、表 2。相较于 NC 组，F5 组 5637 细胞间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）、Axl、p44/42 丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK)［胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2］、Src 蛋白水平显著升高，表达上调百分比分别为 26.63%、35.05%、34.76%、16.25%。
表2
Pathscan 检测 ALK、Axl、p44/42 MAPK （ERK1/2）、Src 蛋白的灰度值
图5
Pathscan 检测 ALK、Axl、p44/42 MAPK（ERK1/2）、Src 蛋白的灰度值
*与 NC 组相比，F5 组 5637 细胞蛋白灰度值差异有统计学意义（
3 讨论
Fibulin-5 是一种定位于细胞外基质的分泌性糖蛋白，为包括血管平滑肌细胞、成纤维细胞及内皮细胞等多种细胞所分泌，并在弹性纤维形成过程中发挥重要的作用。近年来研究表明，Fibulin-5 对肿瘤发生发展有重要作用，其作用机制研究也逐渐成为研究的热点。Fibulin-5 可通过 RGD 依赖的整合素信号来抑制 ERK 活性，从而导致 MMP-7 转录抑制，而后者在肺癌浸润过程中至关重要[11]；Fibulin-5 亦可通过抑制 MMP-9 的产生来降低成纤维细胞的侵袭能力以抑制远处转移灶的形成[12, 19]；Fibulin-5 可消除 ERK 对 GSK3β 的激活作用，来阻止 MMP-7 和 c-Myc 的表达，从而阻断了 Wnt/β-catenin 信号通路，后者在肿瘤发生发展及远处转移过程中起到关键作用[13, 20]。上述研究业已阐述了 Fibulin-5 抑制肿瘤生长和转移的作用机制。然而，Fibulin-5 还存在促进肿瘤生长及运动能力的作用。据报道，在特定环境下，Fibulin-5 可作为转化生因子-β 的靶基因来激活 ERK1/2 和 p38 MAPK 以控制细胞的生长和运动[7]，并可作为分子变阻器来调节细胞基质相互作用以降低活性氧的产生，从而促进胰腺胆管癌的发生发展[17]；另外，Fibulin-5 在胃癌组织中表达上调，其基因沉默可降低胃癌细胞株 MGC-803 的增殖和侵袭能力[18, 21]。由此可见，Fibulin-5 在肿瘤发生发展和转移过程中的功能可能存在组织和环境特异性，以致其作用存在差异甚至截然相反。膀胱癌细胞 5637 的 Fibulin-5 过表达细胞株细胞的增殖和迁移能力明显降低[9]，但其机制尚不清楚。
本研究利用 Fibulin-5 RNAi 慢病毒感染膀胱癌细胞 5637 建立了 Fibulin-5 基因沉默细胞株，并对其增殖活性和迁移能力进行了探究，结果显示，Fibulin-5 基因沉默后，5637 细胞的增殖活性和迁移能力较 NC 组显著降低，提示 Fibulin-5 基因的沉默对膀胱癌细胞的增殖活性有抑制作用，这与 Hu 等[9]的研究结果似乎存在一些矛盾。为探究了这一现象的原因，我们还对 Fibulin-5 基因沉默细胞株 RTK 信号通路中 39 种主要的蛋白进行了 PathScan 检测，结果显示，ALK、Axl、p44/42 MAPK（ERK1/2）、Src 蛋白水平显著高于 NC 组细胞，表达上调百分比分别为 26.63%、35.05%、34.76%、16.25%。众所周知，这些蛋白与细胞的增殖、黏附、迁移密切相关，且相互之间联系紧密，它们的表达上调意涵细胞生长和转移能力的增强。Fibulin-5 基因的沉默，使 ERK 及与其激活密切相关的 ALK、Axl、Src 蛋白表达均有所上调，提示 Fibulin-5 可能具有抑制 ERK 及其通路蛋白的作用，这与以往研究倒也相一致[13, 20]，但此时细胞增殖活力和转移能力本应该提高，然而本研究结果表明，Fibulin-5 基因的沉默使膀胱癌细胞 5637 增殖活力和迁移力较 NC 组均有所降低。我们猜测，Fibulin-5 与弹性纤维形成密切相关，其基因的沉默势必会影响弹性纤维的组装及正常功能的发挥，继而使细胞骨架及形态处于非正常状态，生理结构及功能的改变使细胞活力、黏附及迁移能力均受到不同程度的影响，而细胞处在这种状态下，即使 ERK 得到激活可能也很难提高细胞的增殖和迁移能力。
本研究仅初步探讨了 Fibulin-5 基因沉默对膀胱癌细胞株 5637 的影响，由于实验样本数量和研究范围有限，致使研究还存在很多问题尚未解决，如 Fibulin-5 的存在是否使 ERK 处于被抑制状态而沉默后表达激活、Fibulin-5 沉默后细胞活力的下降是否因为生理状态的改变、Fibulin-5 过表达时 ERK 等 RTK 表达水平及活力处于何种状态等，因此，Fibulin-5 在膀胱癌组织细胞中的作用及其机制研究还有待进一步的探究和阐明。
