引用本文： 李谋, 郑兴菊, 黄子星, 宋彬. 体素内不相干运动成像评价大鼠肝细胞癌的微血管生成. 华西医学, 2018, 33(4): 411-416. doi: 10.7507/1002-0179.201701065 复制
肝癌是全球第五大常见的恶性肿瘤，其中肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原发性肝癌中最主要的类型[1-2]。微血管密度（microvessel density，MVD）是运用特异性抗体标记肿瘤组织血管内皮细胞，在显微镜下计数单位面积中的微血管数目，是目前被认为最能反映肿瘤新生血管增生情况的直观方法[3]。HCC 的肿瘤血管生成在实体肿瘤的发生、发展以及转移各阶段均有重要作用，肿瘤内微血管越多，MVD 越高，其生物学行为越恶性。同时，微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）也能够反映 HCC 的恶性潜能，发生 MVI 的 HCC 转移可能性更大，是影响肿瘤转移的独立危险因素[4]。抗血管治疗已成为 HCC 治疗的重要策略之一[5-7]。因此术前评估 HCC 的 MVD 及 MVI 对其治疗方案的选取、预后评价等具有重要意义[8-10]。由于病理学检查为有创检查，一定程度上应用受限[11-12]，因此术前应用影像学方法无创评估肿瘤微血管生成具有重要意义。
弥散加权成像（diffusion weighted imaging，DWI）通过反映组织内水分子的布朗运动，间接反映组织的微观结构特点[13-15]。但由于 DWI 计算得出的表观弥散系数（apparent diffusion coefficient，ADC）值受到微循环毛细血管灌注的影响，因此 Le Bihan 等[16]提出体素内不相干运动成像（intravoxel incoherent motion diffusion weighted imaging，IVIM）理论，以消除病灶内血流灌注对弥散测量的影响。目前关于 IVIM 涉及 HCC MVD 及 MVI 的研究较少且结论不一[17]。本研究旨在通过判断 IVIM 参数预测 HCC MVD、MVI 的能力，评估目前已有的研究结果，并提供一种无创评估 HCC 微血管生成的方法。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物、材料与设备
100 只 6 周龄、体质量 100～150 g 的健康雄性清洁级 Wistar 大鼠，购自四川达硕动物中心。二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine，DEN），购自美国 Sigma 公司。MRI 扫描采用德国西门子公司生产的 Skyra 3.0 T 磁共振扫描仪。
1.2 建立大鼠 HCC 模型
采用随机数字表法将 100 只大鼠随机分为实验组（90 只）和空白组（10 只）。实验组大鼠自由饮用浓度为 0.1 mg/mL 的 DEN 溶液，而空白组大鼠仅给予蒸馏水，两组大鼠均自由食用饲料，喂养 12 周。所有操作遵守四川大学动物保护方针。
1.3 扫描及图像分析
用 2% 异氟烷对大鼠进行呼吸麻醉后，从膈顶扫描至肝下缘，扫描序列包括 T1 加权像（T1 weighted image，T1WI）、IVIM，以及轴位、冠状位和矢状位 T2 加权像（T2 weighted image，T2WI）。经预实验测试后，序列扫描参数如下：① T1WI：重复时间（repetition time，TR） 201 ms，回波时间（echo time，TE） 4.59 ms，视野 90 mm×100 mm，矩阵 225×250，层厚 1.5 mm，间隔 0.1 mm，带宽 300 Hz，扫描时间 253 s。② T2WI：TR 3 000 ms，TE 62 ms，视野 90 mm×100 mm，矩阵 225×250，层厚 1.5 mm，间隔 0.1 mm，带宽 300 Hz，扫描时间 203 s。③ IVIM：TR 3 300 ms，TE 68 ms，视野 110 mm×100 mm，矩阵 157×143，层厚 1.5 mm，b 值 0、25、50、80、150、300、500、800，扫描时间 4 min 42 s。IVIM 测值：在图像上采用圆形感兴趣区对病灶测值。测量时尽量避免边缘噪声和部分容积效应的影响，同时避开病灶内出血、液化坏死区域。每个参数取 3 次测量的平均值。结合 T1、T2 平扫，在 ADC 图像上选择病灶的最大径平面，将感兴趣区置于病灶的实质部分，记为 ADCLes。将上述 HCC 病灶 ADC 图像的感兴趣区复制到相同层面的 IVIM 参数图（D、D*、f）上，分别记为 DLes、D*Les、fLes。由 2 名腹部影像诊断医师利用工作站（Version VB 35 A）独立分析、测量图像，意见不同则协商达成一致。
1.4 病理学检测
采用颈椎脱臼法处死大鼠，结合轴位、矢状位和冠状位 T2WI 选取目标病灶后用石蜡包埋，行苏木精-伊红（ematoxylin-eosin，HE）染色，并采用 Envision 法行 CD31 染色。由 2 名年资 5 年以上的病理医生分别对病灶的 HE 切片结果进行分析，若病灶为 HCC，进一步计数 MVD 及判断有无 MVI，意见不同则协商达成一致。
1.5 统计学方法
所有统计分析采用 SPSS 20.0 软件。计量资料采用均数±标准差表示，采用独立样本 t 检验比较 MVI（+）和 MVI（–）组 HCC 的 ADC 值、IVIM 相关参数值有无差异。采用 Spearman 相关性分析评估 IVIM 相关参数值与 MVD 有无相关性，r 为正值代表正相关，负值代表负相关；0≤|r|<0.25，无相关性或相关性弱；0.25≤|r|<0.5，相关性一般；0.5≤|r|<0.75，相关性良好；|r|≥0.75，相关性非常好[18]。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 大鼠肝癌模型
喂养 12 周期间，实验组死亡 26 只，解剖后发现死因可能为肺炎、肝硬化导致的并发症、肿瘤破裂出血等。空白组 10 只均存活。对剩余 64 只实验组大鼠进行 MRI 扫描，因过度麻醉死亡 3 只，因 IVIM 图像病灶区域出现信号缺失排除 4 只，最终对 57 只实验组大鼠进行病理取材。
2.2 病理结果及统计结果
共纳入 50 个 HCC 病灶，包含 MVI（+）组 27 个，MVI（–）组 23 个。50 个 HCC 病灶 MVD 为（18.2±11.4）个/视野，ADC、D 及 D*分别为（0.85±0.14）、（0.75±0.14）、（28.5±7.39）× 10–3 mm2/s，f 值为（16.0±7.54）%，各 IVIM 参数与 MVD 的相关系数见表 1，散点图见图 1。HCC 的 ADC 值、D 值与 MVD 呈负相关（r=–0.406，P=0.003；r=–0.468，P=0.001）；D*值、f 值与 MVD 无统计学相关性（P=0.172、0.074）；MVI（+）组和 MVI（–）组的 IVIM 相关参数、ADC 差异均无统计学意义（P=0.393、0.395、0.221、0.550），见表 2 及图 2、3。
表1
MVD 与 ADC、IVIM 相关参数的相关性分析
图1
ADC、D、D*及 f 与 MVD 相关性分析的散点图
表2
MVI（+）与 MVI（–）组 IVIM 相关参数值、ADC 值
图2
一例病灶内无 MVI 的大鼠 HCC 病灶 MRI 及病理图像
a. T1 图像，病灶呈稍长 T1 信号；b. T2 图像，病灶呈长 T2 信号；c. DWI 呈高信号；d. ADC 图像呈稍低信号；c、d 示病灶弥散稍受限；e～g. 分别为其 D、D*、
图3
一例病灶内有 MVI 的大鼠 HCC 病灶 MRI 及病理图像
a. T1 图像，病灶呈稍长 T1 信号；b. T2 图像，病灶呈稍长 T2 信号；c. DWI 呈高信号；d. ADC 图像呈低信号；c、d 示病灶弥散明显受限；e～g. 分别为其 D、D*、
3 讨论
本研究发现 ADC 及 IVIM 参数 D 与 HCC MVD 具有相关性，但 MVI（+）组和 MVI（–）组的 IVIM 相关参数、ADC 差异无统计学意义（P>0.05），表明 ADC、D 一定程度上可用于无创评估 HCC 的 MVD，但评估 MVI 的能力受限。
DWI 通过梯度回波技术来反映组织内水分子的布朗运动，进而间接反映感兴趣区组织内微观结构的特点，但在活体组织内，不仅有水分子的扩散，还有微循环毛细血管灌注的影响。因此 Le Bihan 等[16]在 20 世纪 80 年代提出 IVIM 理论，即 Sb/S0=（1–f）×exp（–bD）+f×exp［（–b（D+D*）］，其中，S 代表感兴趣区内信号强度；D 代表感兴趣区内纯水分子扩散，为真性扩散系数；D*代表感兴趣区内微循环灌注，为假性扩散系数；f为灌注分数，代表感兴趣区内微循环灌注效应占总体扩散效应的容积率。IVIM 能够将灌注导致的弥散与真实弥散分离，更准确地评估弥散及灌注。
HCC 在血管生成因子的刺激下，已存在的微血管内皮细胞重新进入细胞增殖周期，形成新生毛细血管，与 HCC 的生成、生长及预后有密切关系[19]。研究表明，MVD 是一个独立而重要的预后因素，高 MVD 提示肿瘤易发生转移，预后不良[20]。本研究发现，HCC 的 ADC 值、D 值与 MVD 有一定的负相关关系。肿瘤的病理分级越高，肿瘤组织内水分子扩散受限越严重[18]，同时肿瘤病理分级越高，肿瘤内微血管越多，亦会加大对肿瘤组织内水分子扩散运动的抑制作用，二者共同作用的结果最终导致反映纯水分子扩散的 D 值与 MVD 具有一定的负相关性，而包含肿瘤组织内纯水分子扩散和微循环血流灌注两方面信息的 ADC 值，亦与 MVD 呈现出一定的负相关关系。
Lee 等[21]将人结直肠癌细胞种植于裸鼠腹侧皮下，建立肿瘤模型后进行 IVIM 成像，结果示：D*值和 f 值分别与 MVD 具有良好的正相关关系（r=0.782，P<0.001；r=0.749，P<0.001），能够反映肿瘤的灌注信息。本研究中，D*值、f 值与 MVD 无相关性，与上述报道不一致，推测原因为 D*值和f 值的可重复性差，D 值和 ADC 值的可重复性较好[22-23]，与扫描时的呼吸方式、病灶位置等因素有关。
仅有少数研究应用 DWI 的 ADC 值来预测 HCC 的 MVI[24-25]。这些研究认为 ADC 可预测 HCC 的 MVI：当 ADC 值<1.227×10–3 mm2/s（b=0、500 s/mm2）时，可作为小 HCC（肿瘤直径≤2 cm）MVI 的预测因子。ADC 值<1.11×10–3 mm2/s 有利于术前预测 HCC 的 MVI。对于本研究，应用单变量分析 MVI（+）组和 MVI（–）组的 ADC 值、IVIM 相关参数值，差异均无统计学意义（P>0.05），目前尚需更多、更大样本含量的研究进一步验证。
本研究存在一些不足。第一，不能完全确保病理取材标本与 MRI 图像参数测量层面相一致。研究中我们采用了以下方法使二者尽量保持一致：结合 T1、T2 轴位、冠状位、矢状位图像，对参数测量层面准确定位；扫描体位和取材体位保持一致，均取仰卧位，取材时，找到 MRI 参数测量平面。但所取标本厚度与 MRI 扫描层厚有一定差距，难免导致病理标本与参数测量层面之间存在一定的误差。第二，本研究的样本量相对较小，主要是受到建模周期较长的限制。第三，IVIM-DWI 的扫描参数，目前并无统一标准，因此本研究在进行预实验后，选取了相比之下能获得最佳图像质量的参数进行扫描，与别的研究所选扫描参数有差异，是造成与之结果不一致的原因之一。
肝癌是全球第五大常见的恶性肿瘤，其中肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原发性肝癌中最主要的类型[1-2]。微血管密度（microvessel density，MVD）是运用特异性抗体标记肿瘤组织血管内皮细胞，在显微镜下计数单位面积中的微血管数目，是目前被认为最能反映肿瘤新生血管增生情况的直观方法[3]。HCC 的肿瘤血管生成在实体肿瘤的发生、发展以及转移各阶段均有重要作用，肿瘤内微血管越多，MVD 越高，其生物学行为越恶性。同时，微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）也能够反映 HCC 的恶性潜能，发生 MVI 的 HCC 转移可能性更大，是影响肿瘤转移的独立危险因素[4]。抗血管治疗已成为 HCC 治疗的重要策略之一[5-7]。因此术前评估 HCC 的 MVD 及 MVI 对其治疗方案的选取、预后评价等具有重要意义[8-10]。由于病理学检查为有创检查，一定程度上应用受限[11-12]，因此术前应用影像学方法无创评估肿瘤微血管生成具有重要意义。
弥散加权成像（diffusion weighted imaging，DWI）通过反映组织内水分子的布朗运动，间接反映组织的微观结构特点[13-15]。但由于 DWI 计算得出的表观弥散系数（apparent diffusion coefficient，ADC）值受到微循环毛细血管灌注的影响，因此 Le Bihan 等[16]提出体素内不相干运动成像（intravoxel incoherent motion diffusion weighted imaging，IVIM）理论，以消除病灶内血流灌注对弥散测量的影响。目前关于 IVIM 涉及 HCC MVD 及 MVI 的研究较少且结论不一[17]。本研究旨在通过判断 IVIM 参数预测 HCC MVD、MVI 的能力，评估目前已有的研究结果，并提供一种无创评估 HCC 微血管生成的方法。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物、材料与设备
100 只 6 周龄、体质量 100～150 g 的健康雄性清洁级 Wistar 大鼠，购自四川达硕动物中心。二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine，DEN），购自美国 Sigma 公司。MRI 扫描采用德国西门子公司生产的 Skyra 3.0 T 磁共振扫描仪。
1.2 建立大鼠 HCC 模型
采用随机数字表法将 100 只大鼠随机分为实验组（90 只）和空白组（10 只）。实验组大鼠自由饮用浓度为 0.1 mg/mL 的 DEN 溶液，而空白组大鼠仅给予蒸馏水，两组大鼠均自由食用饲料，喂养 12 周。所有操作遵守四川大学动物保护方针。
1.3 扫描及图像分析
用 2% 异氟烷对大鼠进行呼吸麻醉后，从膈顶扫描至肝下缘，扫描序列包括 T1 加权像（T1 weighted image，T1WI）、IVIM，以及轴位、冠状位和矢状位 T2 加权像（T2 weighted image，T2WI）。经预实验测试后，序列扫描参数如下：① T1WI：重复时间（repetition time，TR） 201 ms，回波时间（echo time，TE） 4.59 ms，视野 90 mm×100 mm，矩阵 225×250，层厚 1.5 mm，间隔 0.1 mm，带宽 300 Hz，扫描时间 253 s。② T2WI：TR 3 000 ms，TE 62 ms，视野 90 mm×100 mm，矩阵 225×250，层厚 1.5 mm，间隔 0.1 mm，带宽 300 Hz，扫描时间 203 s。③ IVIM：TR 3 300 ms，TE 68 ms，视野 110 mm×100 mm，矩阵 157×143，层厚 1.5 mm，b 值 0、25、50、80、150、300、500、800，扫描时间 4 min 42 s。IVIM 测值：在图像上采用圆形感兴趣区对病灶测值。测量时尽量避免边缘噪声和部分容积效应的影响，同时避开病灶内出血、液化坏死区域。每个参数取 3 次测量的平均值。结合 T1、T2 平扫，在 ADC 图像上选择病灶的最大径平面，将感兴趣区置于病灶的实质部分，记为 ADCLes。将上述 HCC 病灶 ADC 图像的感兴趣区复制到相同层面的 IVIM 参数图（D、D*、f）上，分别记为 DLes、D*Les、fLes。由 2 名腹部影像诊断医师利用工作站（Version VB 35 A）独立分析、测量图像，意见不同则协商达成一致。
1.4 病理学检测
采用颈椎脱臼法处死大鼠，结合轴位、矢状位和冠状位 T2WI 选取目标病灶后用石蜡包埋，行苏木精-伊红（ematoxylin-eosin，HE）染色，并采用 Envision 法行 CD31 染色。由 2 名年资 5 年以上的病理医生分别对病灶的 HE 切片结果进行分析，若病灶为 HCC，进一步计数 MVD 及判断有无 MVI，意见不同则协商达成一致。
1.5 统计学方法
所有统计分析采用 SPSS 20.0 软件。计量资料采用均数±标准差表示，采用独立样本 t 检验比较 MVI（+）和 MVI（–）组 HCC 的 ADC 值、IVIM 相关参数值有无差异。采用 Spearman 相关性分析评估 IVIM 相关参数值与 MVD 有无相关性，r 为正值代表正相关，负值代表负相关；0≤|r|<0.25，无相关性或相关性弱；0.25≤|r|<0.5，相关性一般；0.5≤|r|<0.75，相关性良好；|r|≥0.75，相关性非常好[18]。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 大鼠肝癌模型
喂养 12 周期间，实验组死亡 26 只，解剖后发现死因可能为肺炎、肝硬化导致的并发症、肿瘤破裂出血等。空白组 10 只均存活。对剩余 64 只实验组大鼠进行 MRI 扫描，因过度麻醉死亡 3 只，因 IVIM 图像病灶区域出现信号缺失排除 4 只，最终对 57 只实验组大鼠进行病理取材。
2.2 病理结果及统计结果
共纳入 50 个 HCC 病灶，包含 MVI（+）组 27 个，MVI（–）组 23 个。50 个 HCC 病灶 MVD 为（18.2±11.4）个/视野，ADC、D 及 D*分别为（0.85±0.14）、（0.75±0.14）、（28.5±7.39）× 10–3 mm2/s，f 值为（16.0±7.54）%，各 IVIM 参数与 MVD 的相关系数见表 1，散点图见图 1。HCC 的 ADC 值、D 值与 MVD 呈负相关（r=–0.406，P=0.003；r=–0.468，P=0.001）；D*值、f 值与 MVD 无统计学相关性（P=0.172、0.074）；MVI（+）组和 MVI（–）组的 IVIM 相关参数、ADC 差异均无统计学意义（P=0.393、0.395、0.221、0.550），见表 2 及图 2、3。
表1
MVD 与 ADC、IVIM 相关参数的相关性分析
图1
ADC、D、D*及 f 与 MVD 相关性分析的散点图
表2
MVI（+）与 MVI（–）组 IVIM 相关参数值、ADC 值
图2
一例病灶内无 MVI 的大鼠 HCC 病灶 MRI 及病理图像
a. T1 图像，病灶呈稍长 T1 信号；b. T2 图像，病灶呈长 T2 信号；c. DWI 呈高信号；d. ADC 图像呈稍低信号；c、d 示病灶弥散稍受限；e～g. 分别为其 D、D*、
图3
一例病灶内有 MVI 的大鼠 HCC 病灶 MRI 及病理图像
a. T1 图像，病灶呈稍长 T1 信号；b. T2 图像，病灶呈稍长 T2 信号；c. DWI 呈高信号；d. ADC 图像呈低信号；c、d 示病灶弥散明显受限；e～g. 分别为其 D、D*、
3 讨论
本研究发现 ADC 及 IVIM 参数 D 与 HCC MVD 具有相关性，但 MVI（+）组和 MVI（–）组的 IVIM 相关参数、ADC 差异无统计学意义（P>0.05），表明 ADC、D 一定程度上可用于无创评估 HCC 的 MVD，但评估 MVI 的能力受限。
DWI 通过梯度回波技术来反映组织内水分子的布朗运动，进而间接反映感兴趣区组织内微观结构的特点，但在活体组织内，不仅有水分子的扩散，还有微循环毛细血管灌注的影响。因此 Le Bihan 等[16]在 20 世纪 80 年代提出 IVIM 理论，即 Sb/S0=（1–f）×exp（–bD）+f×exp［（–b（D+D*）］，其中，S 代表感兴趣区内信号强度；D 代表感兴趣区内纯水分子扩散，为真性扩散系数；D*代表感兴趣区内微循环灌注，为假性扩散系数；f为灌注分数，代表感兴趣区内微循环灌注效应占总体扩散效应的容积率。IVIM 能够将灌注导致的弥散与真实弥散分离，更准确地评估弥散及灌注。
HCC 在血管生成因子的刺激下，已存在的微血管内皮细胞重新进入细胞增殖周期，形成新生毛细血管，与 HCC 的生成、生长及预后有密切关系[19]。研究表明，MVD 是一个独立而重要的预后因素，高 MVD 提示肿瘤易发生转移，预后不良[20]。本研究发现，HCC 的 ADC 值、D 值与 MVD 有一定的负相关关系。肿瘤的病理分级越高，肿瘤组织内水分子扩散受限越严重[18]，同时肿瘤病理分级越高，肿瘤内微血管越多，亦会加大对肿瘤组织内水分子扩散运动的抑制作用，二者共同作用的结果最终导致反映纯水分子扩散的 D 值与 MVD 具有一定的负相关性，而包含肿瘤组织内纯水分子扩散和微循环血流灌注两方面信息的 ADC 值，亦与 MVD 呈现出一定的负相关关系。
Lee 等[21]将人结直肠癌细胞种植于裸鼠腹侧皮下，建立肿瘤模型后进行 IVIM 成像，结果示：D*值和 f 值分别与 MVD 具有良好的正相关关系（r=0.782，P<0.001；r=0.749，P<0.001），能够反映肿瘤的灌注信息。本研究中，D*值、f 值与 MVD 无相关性，与上述报道不一致，推测原因为 D*值和f 值的可重复性差，D 值和 ADC 值的可重复性较好[22-23]，与扫描时的呼吸方式、病灶位置等因素有关。
仅有少数研究应用 DWI 的 ADC 值来预测 HCC 的 MVI[24-25]。这些研究认为 ADC 可预测 HCC 的 MVI：当 ADC 值<1.227×10–3 mm2/s（b=0、500 s/mm2）时，可作为小 HCC（肿瘤直径≤2 cm）MVI 的预测因子。ADC 值<1.11×10–3 mm2/s 有利于术前预测 HCC 的 MVI。对于本研究，应用单变量分析 MVI（+）组和 MVI（–）组的 ADC 值、IVIM 相关参数值，差异均无统计学意义（P>0.05），目前尚需更多、更大样本含量的研究进一步验证。
本研究存在一些不足。第一，不能完全确保病理取材标本与 MRI 图像参数测量层面相一致。研究中我们采用了以下方法使二者尽量保持一致：结合 T1、T2 轴位、冠状位、矢状位图像，对参数测量层面准确定位；扫描体位和取材体位保持一致，均取仰卧位，取材时，找到 MRI 参数测量平面。但所取标本厚度与 MRI 扫描层厚有一定差距，难免导致病理标本与参数测量层面之间存在一定的误差。第二，本研究的样本量相对较小，主要是受到建模周期较长的限制。第三，IVIM-DWI 的扫描参数，目前并无统一标准，因此本研究在进行预实验后，选取了相比之下能获得最佳图像质量的参数进行扫描，与别的研究所选扫描参数有差异，是造成与之结果不一致的原因之一。
