引用本文： 杨汐静, 陈晓婷, 于思淼, 刘伟. Red 重组介导大肠杆菌外膜蛋白 A 缺失突变菌株的构建及生物学特性初步研究. 华西医学, 2017, 32(12): 1895-1899. doi: 10.7507/1002-0179.201701144 复制
许多微生物都可以作为表面展示多肽或蛋白的宿主，包括革兰阳性（Gram-positive，G+）菌、革兰阴性菌和酵母菌[1]。但由于 G+菌细胞壁是由一层厚而致密的肽聚糖和磷壁酸组成[2]，导致转化效率低等缺点，而大肠杆菌以其高产量和便于基因工程操作成为主要的蛋白质表面展示菌株。尽管有许多的载体蛋白都被研究人员开发用来展示其他的异源蛋白，但多数载体蛋白的应用因承载蛋白的大小而受到了较大的限制[3]。相比较而言，外膜蛋白（outer membrane protein，Omp）展示系统能展示相对分子质量较大且结构复杂的目的蛋白，从而成为生物技术研究的热点[4]。大肠杆菌Omp是一类高度保守的、由 325 个氨基酸所组成的蛋白，该蛋白主要由 N 端和 C 端两个结构域组成，能以 β-折叠组成桶状样结构，跨越外膜，此类蛋白主要包括 OmpA、麦芽糖孔蛋白、铁色素外膜受体蛋白、OmpC 和 OmpX[5-8]。
大肠杆菌的 OmpA 因其自身具备的 β-折叠桶状跨膜结构，常被人用于在大肠杆菌表面展示外源片段。外源抗原在大肠杆菌外表面进行表达，利于此种优势可制备成有效的活载体疫苗。大肠杆菌外膜展示系统中，因表达量问题，常在 OmpA 前嵌入脂蛋白（lipoprotein，Lpp）构建 Lpp-OmpA 表达系统[9]。本实验室前期构建了表达质粒 pet28a-lpp-ompa-trap 成功转入大肠杆菌内，同时成功地在大肠杆菌基因组直接用 Red 同源重组的方式在 OmpA 跨膜区域插入外源基因 gapc1，但这两类外源片段的展示均面临一个问题就是外源基因表达量不够，活载体疫苗的保护率不高[10-12]。分析认为在做外源片段展示的时候是直接构建好 Lpp-OmpA- 连接目的片段，直接进入宿主菌，不论是重组质粒转化还是基因组外源片段电击转入均未去掉宿主菌原来的 OmpA，为进一步探究 OmpA 的保留是否与表达量有关，本研究利用 Red 同源重组的方法对大肠杆菌进行 OmpA 敲除，构建大肠杆菌 OmpA 缺失株，为后续研究奠定一定的基础。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒
大肠杆菌由黑龙江八一农垦大学预防兽医学系实验室提供。质粒 pKD46、pKD3、由扬州大学朱国强教授惠赠。
1.1.2 试剂
限制性内切酶 DpnⅠ；pfu DNA 聚合酶购自美国 New England BioLabs 公司；DreamTagTM Green PCR Master Mix（2×）购自立陶宛 MBI 公司；氨苄青霉素、氯霉素购自德国 Sigma 公司；细菌培养用胰蛋白胨和酵母提取物购自英国 Oxoid 公司；E.Z.N.ATM Plasmid Mini Kit 和 E.Z.N.ATM Gei Extraction Kit 购自美国 Omega bio-tek 公司；核酸标准品（DL2000 Plus DNA Marker）购自日本 Takara 公司；蛋白质标准品（SM0671 Protein Marker）购自美国 Thermo 公司；二氨基联苯胺（3，3-diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒购自中山金桥公司；羊抗鼠免疫球蛋白G 二抗购自英国 Abcam 公司；其他试剂为国产分析纯。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成
根据已发表的大肠杆菌OmpA（GenBank Accessed Number AC-00091.1）基因序列和 pKD3 质粒序列，应用 DNA Star 软件设计，其中 P1-C1和 P2-C2 分别由 2 部分组成，5’端加下划线的序列与 OmpA 基因两翼序列同源，3’端未加下划线的序列与质粒 pKD3 上cm 基因两侧序列互补。在大肠杆菌 OmpA 基因同源重组区域外侧和 cat 基因上设计鉴定引物 P3、P4、P5、P6。引物由上海生工生物有限公司合成，如表 1 和图 1。
表1
实验中所使用的引物
图1
引物示意图
1.2.2 基因敲除 cat 的制备和纯化
以质粒 pKD3 为模板，P1-C1、P2-C2 为引物，进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。扩增产物用 DpnⅠ进行酶切，以切除模板减少模板质粒对实验的影响。酶切后的产物经琼脂糖凝胶电泳检测、DNA 回收试剂盒纯化和 DNA 浓度测定。回收产物于 4℃ 保存备用。
1.2.3 表达 Red 重组酶菌株的诱导和同源重组
用氯化钙法将 pKD46 质粒转化到野生型大肠杆菌中，用含有 100 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基筛选单个菌落并鉴定后， 经30℃ 震荡培养至 600 nm 波长的吸光度（A600）值为 0.4～0.6 时加 30 mmol/L L-阿拉伯糖诱导，Exo、Bet、Gam 蛋白充分表达后，制备含有 10% 甘油的电转感受态细胞。在 MicroPulser 电转化仪（美国 Bio-Rad 公司）上，电压 1.8 kV，脉冲 25 Μf，电阻 200 Ω 的参数下，将上述纯化融合 PCR 产物电击转化到感受态细胞，在含氯霉素和氨苄青霉素的 LB 平板上筛选单克隆菌株。
1.2.4 重组菌株的 PCR 鉴定
将在氯霉素和氨苄青霉素的 LB 平板生长的菌株转接入含相应抗性的液体 LB 中培养，后用鉴定引物 P3、P4、P5、P6 对菌株进行菌液 PCR 鉴定。鉴定体系为 Dream Tag TM Green PCR Master Mix（2×）10 μL、上下游引物各 0.5 μL、模板为单菌落，加双蒸水至 20 μL，反应条件：94℃ 预变性 10 min 后，94℃ 变性 30 s，52℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 2 min，30 个循环，最后 72℃ 延伸 5 min。鉴定对的菌株送去上海生工测序。
1.2.5 蛋白质印记法检测 OmpA 蛋白缺失
将 PCR 鉴定成功并测序正确的菌株进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）及蛋白质印迹法分析。将细菌培养至 A600 为 0.6 时，收集菌液，12 000 r/min 离心 1 min，用无菌磷酸盐缓冲液清洗 3 次后制备成电泳样品，配制 12% 的 SDS-PAGE 凝胶进行电泳，然后采用湿转法进行转膜。转印结束，将硝酸纤维素膜取出后用双蒸水漂洗 1 次，用磷酸盐吐温缓冲液（0.1%PBS-Tween20，PBST）漂洗 3 次，将硝酸纤维素膜置于 5% 脱脂乳中封闭 2h；PBST 漂洗 3 次，加入抗 OmpA 的血清，室温摇床温育 1h；PBST 漂洗 3 次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠免疫球蛋白 G，室温摇床温育 1h；PBST 漂洗 3 次，双蒸水漂洗 1 次，采用 DAB 显色试剂盒显色，见显色，立即放入双蒸水中终止反应，观察结果，照相。
1.2.6 缺失株生长曲线的测定
将野生菌种和重组缺失菌株接入 LB 中培养至 A600 为 0.6 时作为培养的母液，按照 1∶100 转接入 LB 中再培养，且分别于培养的 0、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22 h 取出 2 mL 菌液测定 A600 值，每个时间点重复测定 3 次。
1.3 观察指标
观察 PCR 扩增片段核算电泳结果，重组细菌全菌体 PCR 检测电泳结果，重组细菌蛋白质印迹法检测结果，细菌生长 0、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22h 细菌 A600 值。
2 结果
2.1 基因打靶片段构建结果
以质粒 pKD3 为模板，用引物 P1 和 P2 进行 PCR 扩增 H1-cm-H2 knock-out cat，扩增产物 经1% 琼脂糖凝胶电泳，可见特异性 DNA 条带，与预期值 1 104 bp 大小相符，见图 2。
图2
Hl-cm-H2 扩增产物电泳结果
泳道 1：H1-cm-H2 打靶片段扩增产物，大小为 1 104 bp（白色条带）；泳道 M：8 000 bp Marker
2.2 基因缺失株的鉴定
经过抗生素初步筛选，得到 40 个克隆，利用 2 对鉴定引物 P3-P5、P4-P5 进行菌落 PCR 扩增鉴定，结果得到 6 个阳性克隆，命名为 E.coli△ OmpA1、E.coli△OmpA2、E.coli△OmpA3、E.coli△OmpA4、E.coli△OmpA5、E.coli△OmpA6，结果详见图 3。其中 1、3、5、7、9、11、13、15 为 P 和 P5 鉴定结果，大小为 839 bp，2、4、6、8、10、12、14、16 为 P4 和 P6 鉴定结果大小为 1 424 bp。阳性克隆扩增出的 DNA 片段大小与预期值一致，隐性对照大肠杆菌野生型（wild type，WT）及水对照均没有扩增出任何 DNA 片段。
图3
菌液 PCR 扩增鉴定结果
泳道 M：5 000 bp Marker；泳道 1、3、5、7、9、11：分别为
2.3 蛋白质印迹法检测结果
将经浓缩后的WT和 OmpA 缺失后的 E.coli△OmpA1 细菌裂解上清液进行 SDS-PAGE，转膜后进行蛋白质印迹法分析。图 4 中样品均为全菌体，一抗为抗 OmpA 蛋白的血清，第1道为 E.coli△OmpA1，未出现特异性条带，第2道为大肠杆菌 WT，出现 1 条特异性条带，相对分子质量约为 34×103，34×103处条带与预期值大小接近，证明大肠杆菌 WT 表达的 OmpA 蛋白成功敲除。
图4
蛋白质印迹法检测 OmpA 蛋白表达结果
泳道 M：170×103 maker；泳道 1：大肠杆菌重组
2.4 缺失株生长曲线
为检测 OmpA 缺失是否影响细菌的生长，将大肠杆菌重组缺失株 E.coli△OmpA1 和大肠杆菌野生株 WT 培养不同时期的 A600 值为纵坐标，时间为横坐标绘制菌株随时间变化的生长曲线，大肠杆菌重组缺失株 E.coli△OmpA1 的生长曲线符合大肠杆菌的生长规律。细菌的生长没有显著的影响。见图 5。
图5
大肠杆菌 OmpA 缺失株与大肠杆菌野生株的生长曲线
WT：大肠杆菌野生株；△OmpA1：大肠杆菌
3 讨论
大肠杆菌的 β-桶状 Omp，能以 β-折叠组成桶状样结构，并多次跨越外膜，此类蛋白主要为 OmpA、OmpC、OmpT 等。大多数以 Omp 为载体的展示系统在不影响其结构稳定性的情况下，仅允许小肽插入到 Omp 的膜外环上[13]。为了突破这种限制，新的以 Omp 为载体的展示系统被开发出来并广为利用。如利用融合到假单胞菌的 OmpA 的羧基端的蛋白质分子大至 56×103 都可以被转运到外膜[14]，而截断的 OmpC 可以转运 50×103 的蛋白质[15]。Lpp 是另一种 Omp，借于氨基端的脂质部分锚定在外膜上。Lpp 则是大肠杆菌表面最丰富的蛋白，它的信号肽与 OmpA 部分肽段融合组成一个复合展示系统 lpp-OmpA，这个系统已经展示许多大分子蛋白，如 β-内酰胺酶（30×103）、绿色荧光蛋白（27×103）和甲基对硫磷与绿色荧光蛋白融合物（60×103）[16-17]，解决利用大肠杆菌展示外源片段大小问题。
利用大肠杆菌外源展示系统制备基因工程活载体疫苗已见报道，无论是构建表达载体后导入大肠杆菌体内进行展示的，还是直接对大肠杆菌基因组进行外源片段同源重组打靶构建的，均面临外源基因表达量小，疫苗免疫效果不佳，无法作为一个有效的活载体疫苗进行推广，迫切需要找到影响表达量的关键因素。前期研究发现在利用大肠杆菌 Lpp-OmpA 系统进行外源片段展示的时候，保留了细菌原来的 OmpA，未进行丢失处理[18]。可对大肠杆菌 OmpA 进行基因敲除，得到大肠杆菌 OmpA 缺失突变菌株，以此突变菌株为宿主菌利用 Lpp-OmpA 进行外源基因的展示，来探索丢失原来的 OmpA 后重组细菌的表达量会有所变化。
本研究利用 Red 重组系统来构建OmpA 敲除菌株，通过菌落 PCR 检测得到了 6 株大肠杆菌 OmpA 缺失菌株。对其中1株 E.coli△OmpA1 进行蛋白质印迹法检测发现 OmpA 成功地完全丢失，重组菌株 E.coli△OmpA1 敲除 OmpA 成功。对 E.coli△OmpA1 进行生物特性检查发现该重组菌株的生长情况不受敲除了OmpA 影响，与正常的大肠杆菌生长曲线类似。该结果为后续研究大肠杆菌外膜展示系统奠定了一定基础。
许多微生物都可以作为表面展示多肽或蛋白的宿主，包括革兰阳性（Gram-positive，G+）菌、革兰阴性菌和酵母菌[1]。但由于 G+菌细胞壁是由一层厚而致密的肽聚糖和磷壁酸组成[2]，导致转化效率低等缺点，而大肠杆菌以其高产量和便于基因工程操作成为主要的蛋白质表面展示菌株。尽管有许多的载体蛋白都被研究人员开发用来展示其他的异源蛋白，但多数载体蛋白的应用因承载蛋白的大小而受到了较大的限制[3]。相比较而言，外膜蛋白（outer membrane protein，Omp）展示系统能展示相对分子质量较大且结构复杂的目的蛋白，从而成为生物技术研究的热点[4]。大肠杆菌Omp是一类高度保守的、由 325 个氨基酸所组成的蛋白，该蛋白主要由 N 端和 C 端两个结构域组成，能以 β-折叠组成桶状样结构，跨越外膜，此类蛋白主要包括 OmpA、麦芽糖孔蛋白、铁色素外膜受体蛋白、OmpC 和 OmpX[5-8]。
大肠杆菌的 OmpA 因其自身具备的 β-折叠桶状跨膜结构，常被人用于在大肠杆菌表面展示外源片段。外源抗原在大肠杆菌外表面进行表达，利于此种优势可制备成有效的活载体疫苗。大肠杆菌外膜展示系统中，因表达量问题，常在 OmpA 前嵌入脂蛋白（lipoprotein，Lpp）构建 Lpp-OmpA 表达系统[9]。本实验室前期构建了表达质粒 pet28a-lpp-ompa-trap 成功转入大肠杆菌内，同时成功地在大肠杆菌基因组直接用 Red 同源重组的方式在 OmpA 跨膜区域插入外源基因 gapc1，但这两类外源片段的展示均面临一个问题就是外源基因表达量不够，活载体疫苗的保护率不高[10-12]。分析认为在做外源片段展示的时候是直接构建好 Lpp-OmpA- 连接目的片段，直接进入宿主菌，不论是重组质粒转化还是基因组外源片段电击转入均未去掉宿主菌原来的 OmpA，为进一步探究 OmpA 的保留是否与表达量有关，本研究利用 Red 同源重组的方法对大肠杆菌进行 OmpA 敲除，构建大肠杆菌 OmpA 缺失株，为后续研究奠定一定的基础。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒
大肠杆菌由黑龙江八一农垦大学预防兽医学系实验室提供。质粒 pKD46、pKD3、由扬州大学朱国强教授惠赠。
1.1.2 试剂
限制性内切酶 DpnⅠ；pfu DNA 聚合酶购自美国 New England BioLabs 公司；DreamTagTM Green PCR Master Mix（2×）购自立陶宛 MBI 公司；氨苄青霉素、氯霉素购自德国 Sigma 公司；细菌培养用胰蛋白胨和酵母提取物购自英国 Oxoid 公司；E.Z.N.ATM Plasmid Mini Kit 和 E.Z.N.ATM Gei Extraction Kit 购自美国 Omega bio-tek 公司；核酸标准品（DL2000 Plus DNA Marker）购自日本 Takara 公司；蛋白质标准品（SM0671 Protein Marker）购自美国 Thermo 公司；二氨基联苯胺（3，3-diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒购自中山金桥公司；羊抗鼠免疫球蛋白G 二抗购自英国 Abcam 公司；其他试剂为国产分析纯。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成
根据已发表的大肠杆菌OmpA（GenBank Accessed Number AC-00091.1）基因序列和 pKD3 质粒序列，应用 DNA Star 软件设计，其中 P1-C1和 P2-C2 分别由 2 部分组成，5’端加下划线的序列与 OmpA 基因两翼序列同源，3’端未加下划线的序列与质粒 pKD3 上cm 基因两侧序列互补。在大肠杆菌 OmpA 基因同源重组区域外侧和 cat 基因上设计鉴定引物 P3、P4、P5、P6。引物由上海生工生物有限公司合成，如表 1 和图 1。
表1
实验中所使用的引物
图1
引物示意图
1.2.2 基因敲除 cat 的制备和纯化
以质粒 pKD3 为模板，P1-C1、P2-C2 为引物，进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。扩增产物用 DpnⅠ进行酶切，以切除模板减少模板质粒对实验的影响。酶切后的产物经琼脂糖凝胶电泳检测、DNA 回收试剂盒纯化和 DNA 浓度测定。回收产物于 4℃ 保存备用。
1.2.3 表达 Red 重组酶菌株的诱导和同源重组
用氯化钙法将 pKD46 质粒转化到野生型大肠杆菌中，用含有 100 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基筛选单个菌落并鉴定后， 经30℃ 震荡培养至 600 nm 波长的吸光度（A600）值为 0.4～0.6 时加 30 mmol/L L-阿拉伯糖诱导，Exo、Bet、Gam 蛋白充分表达后，制备含有 10% 甘油的电转感受态细胞。在 MicroPulser 电转化仪（美国 Bio-Rad 公司）上，电压 1.8 kV，脉冲 25 Μf，电阻 200 Ω 的参数下，将上述纯化融合 PCR 产物电击转化到感受态细胞，在含氯霉素和氨苄青霉素的 LB 平板上筛选单克隆菌株。
1.2.4 重组菌株的 PCR 鉴定
将在氯霉素和氨苄青霉素的 LB 平板生长的菌株转接入含相应抗性的液体 LB 中培养，后用鉴定引物 P3、P4、P5、P6 对菌株进行菌液 PCR 鉴定。鉴定体系为 Dream Tag TM Green PCR Master Mix（2×）10 μL、上下游引物各 0.5 μL、模板为单菌落，加双蒸水至 20 μL，反应条件：94℃ 预变性 10 min 后，94℃ 变性 30 s，52℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 2 min，30 个循环，最后 72℃ 延伸 5 min。鉴定对的菌株送去上海生工测序。
1.2.5 蛋白质印记法检测 OmpA 蛋白缺失
将 PCR 鉴定成功并测序正确的菌株进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）及蛋白质印迹法分析。将细菌培养至 A600 为 0.6 时，收集菌液，12 000 r/min 离心 1 min，用无菌磷酸盐缓冲液清洗 3 次后制备成电泳样品，配制 12% 的 SDS-PAGE 凝胶进行电泳，然后采用湿转法进行转膜。转印结束，将硝酸纤维素膜取出后用双蒸水漂洗 1 次，用磷酸盐吐温缓冲液（0.1%PBS-Tween20，PBST）漂洗 3 次，将硝酸纤维素膜置于 5% 脱脂乳中封闭 2h；PBST 漂洗 3 次，加入抗 OmpA 的血清，室温摇床温育 1h；PBST 漂洗 3 次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠免疫球蛋白 G，室温摇床温育 1h；PBST 漂洗 3 次，双蒸水漂洗 1 次，采用 DAB 显色试剂盒显色，见显色，立即放入双蒸水中终止反应，观察结果，照相。
1.2.6 缺失株生长曲线的测定
将野生菌种和重组缺失菌株接入 LB 中培养至 A600 为 0.6 时作为培养的母液，按照 1∶100 转接入 LB 中再培养，且分别于培养的 0、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22 h 取出 2 mL 菌液测定 A600 值，每个时间点重复测定 3 次。
1.3 观察指标
观察 PCR 扩增片段核算电泳结果，重组细菌全菌体 PCR 检测电泳结果，重组细菌蛋白质印迹法检测结果，细菌生长 0、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22h 细菌 A600 值。
2 结果
2.1 基因打靶片段构建结果
以质粒 pKD3 为模板，用引物 P1 和 P2 进行 PCR 扩增 H1-cm-H2 knock-out cat，扩增产物 经1% 琼脂糖凝胶电泳，可见特异性 DNA 条带，与预期值 1 104 bp 大小相符，见图 2。
图2
Hl-cm-H2 扩增产物电泳结果
泳道 1：H1-cm-H2 打靶片段扩增产物，大小为 1 104 bp（白色条带）；泳道 M：8 000 bp Marker
2.2 基因缺失株的鉴定
经过抗生素初步筛选，得到 40 个克隆，利用 2 对鉴定引物 P3-P5、P4-P5 进行菌落 PCR 扩增鉴定，结果得到 6 个阳性克隆，命名为 E.coli△ OmpA1、E.coli△OmpA2、E.coli△OmpA3、E.coli△OmpA4、E.coli△OmpA5、E.coli△OmpA6，结果详见图 3。其中 1、3、5、7、9、11、13、15 为 P 和 P5 鉴定结果，大小为 839 bp，2、4、6、8、10、12、14、16 为 P4 和 P6 鉴定结果大小为 1 424 bp。阳性克隆扩增出的 DNA 片段大小与预期值一致，隐性对照大肠杆菌野生型（wild type，WT）及水对照均没有扩增出任何 DNA 片段。
图3
菌液 PCR 扩增鉴定结果
泳道 M：5 000 bp Marker；泳道 1、3、5、7、9、11：分别为
2.3 蛋白质印迹法检测结果
将经浓缩后的WT和 OmpA 缺失后的 E.coli△OmpA1 细菌裂解上清液进行 SDS-PAGE，转膜后进行蛋白质印迹法分析。图 4 中样品均为全菌体，一抗为抗 OmpA 蛋白的血清，第1道为 E.coli△OmpA1，未出现特异性条带，第2道为大肠杆菌 WT，出现 1 条特异性条带，相对分子质量约为 34×103，34×103处条带与预期值大小接近，证明大肠杆菌 WT 表达的 OmpA 蛋白成功敲除。
图4
蛋白质印迹法检测 OmpA 蛋白表达结果
泳道 M：170×103 maker；泳道 1：大肠杆菌重组
2.4 缺失株生长曲线
为检测 OmpA 缺失是否影响细菌的生长，将大肠杆菌重组缺失株 E.coli△OmpA1 和大肠杆菌野生株 WT 培养不同时期的 A600 值为纵坐标，时间为横坐标绘制菌株随时间变化的生长曲线，大肠杆菌重组缺失株 E.coli△OmpA1 的生长曲线符合大肠杆菌的生长规律。细菌的生长没有显著的影响。见图 5。
图5
大肠杆菌 OmpA 缺失株与大肠杆菌野生株的生长曲线
WT：大肠杆菌野生株；△OmpA1：大肠杆菌
3 讨论
大肠杆菌的 β-桶状 Omp，能以 β-折叠组成桶状样结构，并多次跨越外膜，此类蛋白主要为 OmpA、OmpC、OmpT 等。大多数以 Omp 为载体的展示系统在不影响其结构稳定性的情况下，仅允许小肽插入到 Omp 的膜外环上[13]。为了突破这种限制，新的以 Omp 为载体的展示系统被开发出来并广为利用。如利用融合到假单胞菌的 OmpA 的羧基端的蛋白质分子大至 56×103 都可以被转运到外膜[14]，而截断的 OmpC 可以转运 50×103 的蛋白质[15]。Lpp 是另一种 Omp，借于氨基端的脂质部分锚定在外膜上。Lpp 则是大肠杆菌表面最丰富的蛋白，它的信号肽与 OmpA 部分肽段融合组成一个复合展示系统 lpp-OmpA，这个系统已经展示许多大分子蛋白，如 β-内酰胺酶（30×103）、绿色荧光蛋白（27×103）和甲基对硫磷与绿色荧光蛋白融合物（60×103）[16-17]，解决利用大肠杆菌展示外源片段大小问题。
利用大肠杆菌外源展示系统制备基因工程活载体疫苗已见报道，无论是构建表达载体后导入大肠杆菌体内进行展示的，还是直接对大肠杆菌基因组进行外源片段同源重组打靶构建的，均面临外源基因表达量小，疫苗免疫效果不佳，无法作为一个有效的活载体疫苗进行推广，迫切需要找到影响表达量的关键因素。前期研究发现在利用大肠杆菌 Lpp-OmpA 系统进行外源片段展示的时候，保留了细菌原来的 OmpA，未进行丢失处理[18]。可对大肠杆菌 OmpA 进行基因敲除，得到大肠杆菌 OmpA 缺失突变菌株，以此突变菌株为宿主菌利用 Lpp-OmpA 进行外源基因的展示，来探索丢失原来的 OmpA 后重组细菌的表达量会有所变化。
本研究利用 Red 重组系统来构建OmpA 敲除菌株，通过菌落 PCR 检测得到了 6 株大肠杆菌 OmpA 缺失菌株。对其中1株 E.coli△OmpA1 进行蛋白质印迹法检测发现 OmpA 成功地完全丢失，重组菌株 E.coli△OmpA1 敲除 OmpA 成功。对 E.coli△OmpA1 进行生物特性检查发现该重组菌株的生长情况不受敲除了OmpA 影响，与正常的大肠杆菌生长曲线类似。该结果为后续研究大肠杆菌外膜展示系统奠定了一定基础。
