引用本文： 吕长遥, 伍静, 何洪波. 六合丹对新西兰大白兔皮肤感染创面愈合过程中白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α 表达的影响. 华西医学, 2017, 32(10): 1544-1550. doi: 10.7507/1002-0179.201703100 复制
肛瘘术后患者的切口创面属于感染加开创性创面，肛门部位特殊，每日均需排便，排便后粪渣和肠道切口分泌物常会污染切口创面，因此术后换药是整个治疗过程不可或缺的环节，其直接影响着疾病治疗效果。中药外治的优势主要体现在创口愈合方面，基于中医整体观实施辩证论治，通过清热解毒祛湿、脱脓祛腐生肌、活血祛瘀通络、补益气血等方法进行治疗，采用外敷的方式治疗创面，能够起到解毒生肌、调和气血的效果，从而加速创口的愈合。六合丹是本院已故名医吴介诚先生的家传名方，该方主要由生大黄、生黄柏、乌梅肉、薄荷、白芨、白芷、乌金散、陈小粉等组成，临床多用于重症急性胰腺炎疼痛及腹腔积液、急性嵌顿痔水肿、混合痔外剥内扎术后水肿、流行性腮腺炎、早期哺乳期乳腺炎等急性炎症[1-4]。熊艳艳等[1]将六合丹敷在脱出的嵌顿痔上，发现六合丹能缓解痔水肿及疼痛。李黎等[3]将六合丹外敷于肿胀的腮腺、睾丸处，发现六合丹可缩短治疗时间、提高总有效率。但六合丹在疾病慢性感染或溃疡期的临床报道较少。为了进一步论证六合丹是否适用于肛瘘术后的慢性感染性创面，能否加速创面的愈合，我们进行了本次实验研究。现报告如下。
1 材料与仪器
1.1 实验动物
40 只普通级 3 月龄新西兰长耳大白兔，雌雄不限，体质量 2.0～2.5 kg，由四川大学实验动物中心提供[合格证：scxk（川）2013-14]。所有大白兔均由该中心负责饲养。温度调至 18～24℃，湿度调至 40%～60%。实验过程中，所有动物均能够自由饮水，食用一般饲料（由该中心直接供应）。常规喂养，时间 1 周。
1.2 试药与菌株
1.2.1 试药 六合丹：由四川大学华西医院药剂科提供；紫草油（院内制剂）：由四川大学华西医院药剂科提供；藻酸钙伤口敷料（商品名：德湿康）：由保赫曼（上海）药业有限公司提供，规格：1 g/30 cm。
1.2.2 菌株 金黄色葡萄菌：由四川大学基础医学院药理教研室提供。
1.3 试剂与仪器
1.3.1 试剂 新西兰大白兔白细胞介素（interleukin，IL）-1β 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒：北京博奥森生物技术有限公司产品；新西兰大白兔肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗体（一抗）：北京博奥森生物技术有限公司产品；链霉亲和素-生物素复合物（strept avidin-biotin complex，SABC）兔免疫球蛋白G（二/三抗）：武汉博士德生物工程公司产品；二氨基联苯胺显色剂：武汉博士德生物工程公司产品；戊巴比妥钠：5 g/瓶，成都凯派生物科技有限公司产品；硫化钠：500 g/瓶，成都凯派生物科技有限公司产品；磷酸盐缓冲液：美国 Hyclone 公司产品。
1.3.2 仪器 显微镜：Olympus BX5，日本奥林巴斯光学工业株式会社产品；图像采集系统（CCD）：Olympus DP73，日本奥林巴斯光学工业株式会社产品；冷冻高速离心机：Centrifuge 5403，美国 Thermo 公司产品；酶标仪：ELx800，美国 BioTek 公司产品；切片机：徕卡 RM2155，德国 Leica 公司产品；电热恒温培养箱：DH-360A（303-1A），北京中光伟业仪器有限公司产品；普通电冰箱：BCD-165F，容声牌；家用微波炉：PJ21C-BF，美的牌；有机玻璃湿盒；玻璃匀浆器：20 mL/支，成都市锦江区玻蜀玻璃仪器厂产品；单道可调移液器：100～1 000 μL/支，溶海实验器材经营部产品；EP 管：1.5 mL/支，美国 Hyclone 公司产品；微量移液器：美国 Thermo 公司产品；1.5 mL 离心管：美国 Axygen 公司产品。
1.4 方法
1.4.1 实验动物分组 40 只大白兔采用自体对照法，在大白兔左侧背部纵向做 2 个创面，右侧背部纵向做 3 个创面，从左上创面开始按逆时针顺序分为 5 组：空白组、模型组、治疗组（六合丹）、西药组（藻酸钙伤口敷料）、中药组（紫草油）。
1.4.2 麻醉方法 将大白兔放入兔盒中，0.7% 戊巴比妥钠从大白兔耳缘静脉给药，给药剂量 6 mL/kg。先给总量的 2/3，大白兔无不适反应后再给剩余药量。
1.4.3 造模方法 将麻醉后的大白兔俯卧固定在兔台上，弯剪剪去部分兔毛，用 5% 的硫化钠脱掉大白兔背部两侧兔毛，脱毛范围约 12 cm×10 cm，脱毛后用生理盐水洗净擦干。聚维酮碘局部消毒后，用尖锐组织剪在皮肤上剪 5 个直径约 2 cm 圆形伤口，深达肌筋膜，破坏部分肌肉表面筋膜，在创面上覆盖直径约 2 cm 的圆形纱布，移液器吸取 1 mL 金黄色葡萄菌滴在模型组、治疗组、西药组及中药组纱布上，空白组不滴菌，单层纱布及网状弹力绷带包扎固定，防止大白兔舔蹭。大白兔分笼饲养，给予充足的饲料和水。1 d 后观察大白兔情况及创面情况，大白兔精神略萎靡，食欲不振，造模成功的创面表面附有黄白色脓性分泌物，周围皮温略高。
1.4.4 给药方法 术后第 1 天开始换药，此后每天换药。先用生理盐水清洗 5 组创面，再用聚维酮碘消毒。空白组和模型组均不给药；治疗组：六合丹涂于创面周围；西药组：藻酸钙伤口敷料填塞创面；中药组：紫草油涂于创面周围。换完药后用单层纱布及网状弹力绷带包扎固定，防止大白兔舔蹭。
1.4.5 取材 术后第 3、7、14、21 天随机处死 10 只兔，聚维酮碘消毒局部后沿创面外缘约 2 mm 切下整个创面组织，将创面组织平均剪为 2 份，1 份放入 10% 甲醛溶液中固定，1 份用磷酸盐缓冲液洗净组织表面的脓液，剪除脂肪、结缔组织和血管，剪碎组织后放入玻璃均浆器，加入 1 mL 磷酸盐缓冲液，在冰盒中充分碾磨创面组织后倒入 1.5 mL EP 管，放入冰盒中贮存，2 h 内置于离心机，以离心半径 15 cm、转速 15 000 r/min 离心 15 min。
1.5 检测指标
1.5.1 创面愈合率 术后第 3、7、14、21 天，根据透明薄膜来对创面大小进行描绘，再将描绘好的透明薄膜覆盖在心电图纸上，算出创面面积。计算出创面愈合率：创面愈合率=（原始创面面积－残余创面面积）/原始创面面积×100%。
1.5.2 创面愈合时间 创面彻底上皮化即判断为愈合。记录完全上皮化所需的时间。
1.5.3 创面的组织学观察 切片后进行苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin，HE）染色后，采用图像分析系统分析。使用显微镜在各组组织随机选择 1 个视野（非坏死及出血、非特异性染色的边缘区），用 CCD 采集高质量的图像（像素 1 600×1 200）。在采集图像时保证每次条件的一致，即以手动调节光源、光圈大小、白平衡、曝光强度、敏感度、对比度、Gamma 值等各项设置并且固定。即使是在更换切片时，除调整焦距和视野以外，显微镜上的其他部件的设置都保持不变，包括物镜的放大倍数。再换用 20 倍的物镜（总放大倍数为 200 倍），依据上述要求每张切片不同倍数下随机选取 1 个视野进行图像采集，其中 HE 采图每张切片选取 40 倍及 200 倍两个视野便于观察。
HE 评价及描述涉及指标：坏死组织厚度及肉芽、瘢痕组织厚度（大致范围：>3 mm、1～3 mm、<1 mm）；炎细胞数（少/中/多）：炎性细胞浸及皮肤表皮层为少量，浸及真皮层为中量，浸及真皮下为大量[5]。
1.5.4 创面组织中 IL-1β 含量的检测 采用 ELISA 法，按照 ELISA 试剂盒说明操作。
1.5.5 创面组织中 TNF-α 表达的检测 采用免疫组织化学法。考虑到本实验涂片是皮肤溃疡修复，要避开大量坏死区域（非特异性染色），同时要考虑炎细胞浸润所带的影响，故采用经典半定量方法。利用高倍镜，对每张切片进行观察，视野共计 10 个，对 1 000 个细胞进行记录，根据染色强度以及阳性细胞的具体个数作出最后判断[6]。① 着色评分：0 分，细胞没有显色；1 分，呈淡黄色；2 分，显示棕黄色；3 分，显示棕褐色。② 根据同类细胞中阳性细胞占据的比例进行评定：0 分，阴性；1 分，阳性细胞的占比≤10%；2 分，阳性细胞的占比>10% 且≤50%；3 分，阳性细胞的占比>50% 且≤75%；4 分，阳性细胞的占比≥75%。将 ① 和 ② 所得乘积视作总积分：0～3 分，记作（–）；3～6 分，记作（+）；7～9 分，记作（++），9～12 分，记作（+++）。
1.6 统计学方法
统计学分析由不知分组意义的第三方统计者负责，采用 SPSS 17.0 软件处理所有的实验数据。符合正态分布的计量数据采用均数±标准差表示，组间两两比较采用 SNK-q 法。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 创面愈合率
术后第 3 天，不同组别创面愈合率差异无统计学意义（P>0.05）。术后第 7、14、21 天西药组、治疗组和空白组创面愈合率明显优于模型组和中药组，差异有统计学意义（P<0.05）；西药组、治疗组和空白组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；中药组优于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
表1
术后不同时间各组创面愈合率比较（n=40，%，
）
2.2 创面愈合时间
空白组、模型组、中药组、西药组和治疗组创面愈合时间分别为（16.35±0.95）、（20.38±1.28）、（20.17±1.12）、（18.05±1.55）、（17.39±1.23） d。空白组创面愈合最为迅速，相较于其他组别，差异有统计学意义（P<0.05）；模型组和中药组愈合相对最慢，相较于其他组别，差异有统计学意义（P<0.05）；在愈合时间上，模型组和中药组比较、西药组和治疗组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
表2
各组组织不同时间 IL-1β 含量的动态比较（n=10，pg/mL，
）
2.3 HE 染色结果
术后第 3 天：治疗组、空白组创面炎症反应与其他 3 组相比较轻，其他 3 组创面炎症反应重，创面肿胀、渗出，镜下皮下组织可见大量坏死组织及炎性细胞浸润。术后第 7 天：各组均可见部分坏死组织及炎细胞浸润，治疗组、西药组的坏死组织及炎细胞浸润程度比模型组、中药组轻，但各组炎症反应均比第 3 天减轻。术后第 14 天：上皮组织大部分形成，表皮细胞分化良好，较正常上皮更为肥厚，且能够看到胶原纤维（新生）和部分炎细胞。其下为平行排列的胶原纤维及小血管，可见瘢痕形成。治疗组、西药组的小血管数量比模型组、中药组多，胶原纤维排列更为致密。术后第 21 天：各组创面可见上皮组织覆盖，并可见大量瘢痕组织增生，大量成熟的且数量较多的胶原纤维，毛细血管管径大，数量较前有所减少。见图 1。
图1
术后不同时间各组创面 HE 染色结果（HE ×200）
2.4 创面肉芽组织中 IL-1β 变化情况
在术后第 3、7 天，IL-1β 含量从低到高依次为空白组、治疗组、西药组、中药组、模型组，组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）；术后第 14 天，IL-1β 含量从低到高依次为治疗组、空白组、西药组、中药组、模型组，除西药组和中药组间差异无统计学意义（P>0.05）外，其余组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）；术后第 21 天，治疗组的 IL-1β 含量低于其余各组，差异有统计学意义（P<0.05），其余组间两两比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 2。
2.5 创面肉芽组织中 TNF-α 的表达
根据免疫组织化学图像染色强度以及阳性细胞来判断 TNF-α 的表达，模型组创面中 TNF-α 的表达在整个实验过程中均高于其余各组，而经药物干预的治疗组和西药组的 TNF-α 的表达下降较模型组明显，中药组 TNF-α 的表达强于治疗组和西药组。免疫组织化学图像见图 2。
图2
各组术后不同时间 TNF-α 的免疫组织化学图像（SABC ×200）
3 讨论
创伤修复分为炎症期、细胞增生期及重塑期[7]，炎症期的应答对创面的修复至关重要，IL-1β、TNF-α 都是炎症期重要的炎性因子。IL-1β 主要出现在早期炎症免疫反应中，使不同的免疫活性细胞具备更多功能，它对炎性反应、机体防御有一定诱导作用，维持机体内环境相对平衡[8-9]。TNF-α 主要由巨噬细胞、成纤维细胞、淋巴细胞以及内皮细胞等产生[10]，TNF-α 若发生高表达，表皮细胞将无法进行增殖，进而导致慢性创面无法实现短期愈合[11]。相关研究结果显示创伤伤口、全身血液均可表达出炎症细胞因子，前者对机体组织造成的影响要大于后者，局部表达可快速启动创伤修复，而 IL-1β、TNF-α 可对细胞反应进行调节，决定细胞外基质能不能合成，细胞是否能产生更多的血管以及肉芽组织，同时还决定细胞组织是否能进行更快分化，决定细胞组织是否具备更高的迁移活性[12]。因此，IL-1β、TNF-α 达到怎样的表达水平，与组织创面的修复有很大的关系[13]，可见创面若具备良好的炎症环境，其愈合时间也将大大缩短。
六合丹以清热解毒、活血化瘀通络立法，方中大黄为君药，性寒，味苦，入胃、大肠和肝经，有泻热毒、荡积滞、行瘀血的功效。黄柏为臣，性寒、味苦，归肾、大肠、膀胱经，能清热燥湿、泻火解毒、利水消肿，祛瘀化腐。两者协同发挥清热解毒、祛腐通络、逐瘀止痛的功效。白芨为佐使，性辛温，能消肿生肌敛疮，薄荷辛凉，可辛散通络、活血散肿、透热外出，温凉并用，辛而行气，以温济寒，加之乌梅酸涩，白芷辛温芳香、长于止痛，乌金散拔毒解毒，陈小粉散瘀止痛，再使用蜂蜜调制成中药糊剂，减少药物刺激，诸药共用，共奏清热解毒、行气活血、消肿止痛、散结化瘀之功效。彭小航等[14-15]将微米六合丹外敷于急性胰腺炎大鼠腹部，发现六合丹能降低急性胰腺炎大鼠的血清淀粉酶、TNF-α、IL-6、IL-10、血栓烷素 B2 及 6-酮-前列腺素 F1α 水平，提示六合丹外敷有助于减轻实验大鼠急性胰腺炎过氧化损伤和炎症反应。
本研究结果显示在创面修复过程中，炎症细胞因子呈现动态变化，在术后第 3 天开始明显升高，术后第 7 天达到峰值，然后逐渐下降。模型组创面相较于其他组表达出更多的 IL-1β、TNF-α，所以创面愈合时间也更长，而经药物干预的治疗组和西药组的 IL-1β、TNF-α 的表达下降较模型组明显。西药组和中药组相比，西药组的 IL-1β、TNF-α 的表达下降较中药组明显，藻酸钙伤口敷料对炎症因子的调控作用比紫草油强。术后第 14、21 天创面处于细胞增生期及重塑期，各组创面中的 IL-1β、TNF-α 表达下降，虽空白组未滴细菌，但实验环境并不是无菌环境，治疗组使用六合丹治疗感染性创面，对创面的炎症因子仍有调控作用，对比未使用药物治疗的空白组，其 IL-1β、TNF-α 表达减弱，从该层面也证实六合丹对慢性感染创面的促愈合作用。早期炎症反应关系到创面愈合，IL-1β、TNF-α 这两种因子间可相互协同导致后期感染性创面很难实现愈合。六合丹外敷感染性创面可有效抑制 IL-1β、TNF-α 的表达，减少感染性创面炎性因子的释放。
综上所述，六合丹具有清热解毒、活血化瘀的功效，在炎症期，通过降低感染性创面 IL-1β 和 TNF-α 的表达水平，阻止创面释放出更多的炎症介质，为创面愈合提供良好的条件。进入组织重建期后，前期炎症反应轻的创面组织的细胞外基质、成纤维细胞、毛细血管具有更强的生长能力，加速创面的愈合。所以，六合丹通过对创面炎症进行有效抑制，加快创面更好地愈合，但创面的愈合是一个复杂的过程，多种调控因子参与组织修复，我们未来仍需发掘研究六合丹对调控因子之间的影响。
肛瘘术后患者的切口创面属于感染加开创性创面，肛门部位特殊，每日均需排便，排便后粪渣和肠道切口分泌物常会污染切口创面，因此术后换药是整个治疗过程不可或缺的环节，其直接影响着疾病治疗效果。中药外治的优势主要体现在创口愈合方面，基于中医整体观实施辩证论治，通过清热解毒祛湿、脱脓祛腐生肌、活血祛瘀通络、补益气血等方法进行治疗，采用外敷的方式治疗创面，能够起到解毒生肌、调和气血的效果，从而加速创口的愈合。六合丹是本院已故名医吴介诚先生的家传名方，该方主要由生大黄、生黄柏、乌梅肉、薄荷、白芨、白芷、乌金散、陈小粉等组成，临床多用于重症急性胰腺炎疼痛及腹腔积液、急性嵌顿痔水肿、混合痔外剥内扎术后水肿、流行性腮腺炎、早期哺乳期乳腺炎等急性炎症[1-4]。熊艳艳等[1]将六合丹敷在脱出的嵌顿痔上，发现六合丹能缓解痔水肿及疼痛。李黎等[3]将六合丹外敷于肿胀的腮腺、睾丸处，发现六合丹可缩短治疗时间、提高总有效率。但六合丹在疾病慢性感染或溃疡期的临床报道较少。为了进一步论证六合丹是否适用于肛瘘术后的慢性感染性创面，能否加速创面的愈合，我们进行了本次实验研究。现报告如下。
1 材料与仪器
1.1 实验动物
40 只普通级 3 月龄新西兰长耳大白兔，雌雄不限，体质量 2.0～2.5 kg，由四川大学实验动物中心提供[合格证：scxk（川）2013-14]。所有大白兔均由该中心负责饲养。温度调至 18～24℃，湿度调至 40%～60%。实验过程中，所有动物均能够自由饮水，食用一般饲料（由该中心直接供应）。常规喂养，时间 1 周。
1.2 试药与菌株
1.2.1 试药 六合丹：由四川大学华西医院药剂科提供；紫草油（院内制剂）：由四川大学华西医院药剂科提供；藻酸钙伤口敷料（商品名：德湿康）：由保赫曼（上海）药业有限公司提供，规格：1 g/30 cm。
1.2.2 菌株 金黄色葡萄菌：由四川大学基础医学院药理教研室提供。
1.3 试剂与仪器
1.3.1 试剂 新西兰大白兔白细胞介素（interleukin，IL）-1β 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒：北京博奥森生物技术有限公司产品；新西兰大白兔肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗体（一抗）：北京博奥森生物技术有限公司产品；链霉亲和素-生物素复合物（strept avidin-biotin complex，SABC）兔免疫球蛋白G（二/三抗）：武汉博士德生物工程公司产品；二氨基联苯胺显色剂：武汉博士德生物工程公司产品；戊巴比妥钠：5 g/瓶，成都凯派生物科技有限公司产品；硫化钠：500 g/瓶，成都凯派生物科技有限公司产品；磷酸盐缓冲液：美国 Hyclone 公司产品。
1.3.2 仪器 显微镜：Olympus BX5，日本奥林巴斯光学工业株式会社产品；图像采集系统（CCD）：Olympus DP73，日本奥林巴斯光学工业株式会社产品；冷冻高速离心机：Centrifuge 5403，美国 Thermo 公司产品；酶标仪：ELx800，美国 BioTek 公司产品；切片机：徕卡 RM2155，德国 Leica 公司产品；电热恒温培养箱：DH-360A（303-1A），北京中光伟业仪器有限公司产品；普通电冰箱：BCD-165F，容声牌；家用微波炉：PJ21C-BF，美的牌；有机玻璃湿盒；玻璃匀浆器：20 mL/支，成都市锦江区玻蜀玻璃仪器厂产品；单道可调移液器：100～1 000 μL/支，溶海实验器材经营部产品；EP 管：1.5 mL/支，美国 Hyclone 公司产品；微量移液器：美国 Thermo 公司产品；1.5 mL 离心管：美国 Axygen 公司产品。
1.4 方法
1.4.1 实验动物分组 40 只大白兔采用自体对照法，在大白兔左侧背部纵向做 2 个创面，右侧背部纵向做 3 个创面，从左上创面开始按逆时针顺序分为 5 组：空白组、模型组、治疗组（六合丹）、西药组（藻酸钙伤口敷料）、中药组（紫草油）。
1.4.2 麻醉方法 将大白兔放入兔盒中，0.7% 戊巴比妥钠从大白兔耳缘静脉给药，给药剂量 6 mL/kg。先给总量的 2/3，大白兔无不适反应后再给剩余药量。
1.4.3 造模方法 将麻醉后的大白兔俯卧固定在兔台上，弯剪剪去部分兔毛，用 5% 的硫化钠脱掉大白兔背部两侧兔毛，脱毛范围约 12 cm×10 cm，脱毛后用生理盐水洗净擦干。聚维酮碘局部消毒后，用尖锐组织剪在皮肤上剪 5 个直径约 2 cm 圆形伤口，深达肌筋膜，破坏部分肌肉表面筋膜，在创面上覆盖直径约 2 cm 的圆形纱布，移液器吸取 1 mL 金黄色葡萄菌滴在模型组、治疗组、西药组及中药组纱布上，空白组不滴菌，单层纱布及网状弹力绷带包扎固定，防止大白兔舔蹭。大白兔分笼饲养，给予充足的饲料和水。1 d 后观察大白兔情况及创面情况，大白兔精神略萎靡，食欲不振，造模成功的创面表面附有黄白色脓性分泌物，周围皮温略高。
1.4.4 给药方法 术后第 1 天开始换药，此后每天换药。先用生理盐水清洗 5 组创面，再用聚维酮碘消毒。空白组和模型组均不给药；治疗组：六合丹涂于创面周围；西药组：藻酸钙伤口敷料填塞创面；中药组：紫草油涂于创面周围。换完药后用单层纱布及网状弹力绷带包扎固定，防止大白兔舔蹭。
1.4.5 取材 术后第 3、7、14、21 天随机处死 10 只兔，聚维酮碘消毒局部后沿创面外缘约 2 mm 切下整个创面组织，将创面组织平均剪为 2 份，1 份放入 10% 甲醛溶液中固定，1 份用磷酸盐缓冲液洗净组织表面的脓液，剪除脂肪、结缔组织和血管，剪碎组织后放入玻璃均浆器，加入 1 mL 磷酸盐缓冲液，在冰盒中充分碾磨创面组织后倒入 1.5 mL EP 管，放入冰盒中贮存，2 h 内置于离心机，以离心半径 15 cm、转速 15 000 r/min 离心 15 min。
1.5 检测指标
1.5.1 创面愈合率 术后第 3、7、14、21 天，根据透明薄膜来对创面大小进行描绘，再将描绘好的透明薄膜覆盖在心电图纸上，算出创面面积。计算出创面愈合率：创面愈合率=（原始创面面积－残余创面面积）/原始创面面积×100%。
1.5.2 创面愈合时间 创面彻底上皮化即判断为愈合。记录完全上皮化所需的时间。
1.5.3 创面的组织学观察 切片后进行苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin，HE）染色后，采用图像分析系统分析。使用显微镜在各组组织随机选择 1 个视野（非坏死及出血、非特异性染色的边缘区），用 CCD 采集高质量的图像（像素 1 600×1 200）。在采集图像时保证每次条件的一致，即以手动调节光源、光圈大小、白平衡、曝光强度、敏感度、对比度、Gamma 值等各项设置并且固定。即使是在更换切片时，除调整焦距和视野以外，显微镜上的其他部件的设置都保持不变，包括物镜的放大倍数。再换用 20 倍的物镜（总放大倍数为 200 倍），依据上述要求每张切片不同倍数下随机选取 1 个视野进行图像采集，其中 HE 采图每张切片选取 40 倍及 200 倍两个视野便于观察。
HE 评价及描述涉及指标：坏死组织厚度及肉芽、瘢痕组织厚度（大致范围：>3 mm、1～3 mm、<1 mm）；炎细胞数（少/中/多）：炎性细胞浸及皮肤表皮层为少量，浸及真皮层为中量，浸及真皮下为大量[5]。
1.5.4 创面组织中 IL-1β 含量的检测 采用 ELISA 法，按照 ELISA 试剂盒说明操作。
1.5.5 创面组织中 TNF-α 表达的检测 采用免疫组织化学法。考虑到本实验涂片是皮肤溃疡修复，要避开大量坏死区域（非特异性染色），同时要考虑炎细胞浸润所带的影响，故采用经典半定量方法。利用高倍镜，对每张切片进行观察，视野共计 10 个，对 1 000 个细胞进行记录，根据染色强度以及阳性细胞的具体个数作出最后判断[6]。① 着色评分：0 分，细胞没有显色；1 分，呈淡黄色；2 分，显示棕黄色；3 分，显示棕褐色。② 根据同类细胞中阳性细胞占据的比例进行评定：0 分，阴性；1 分，阳性细胞的占比≤10%；2 分，阳性细胞的占比>10% 且≤50%；3 分，阳性细胞的占比>50% 且≤75%；4 分，阳性细胞的占比≥75%。将 ① 和 ② 所得乘积视作总积分：0～3 分，记作（–）；3～6 分，记作（+）；7～9 分，记作（++），9～12 分，记作（+++）。
1.6 统计学方法
统计学分析由不知分组意义的第三方统计者负责，采用 SPSS 17.0 软件处理所有的实验数据。符合正态分布的计量数据采用均数±标准差表示，组间两两比较采用 SNK-q 法。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 创面愈合率
术后第 3 天，不同组别创面愈合率差异无统计学意义（P>0.05）。术后第 7、14、21 天西药组、治疗组和空白组创面愈合率明显优于模型组和中药组，差异有统计学意义（P<0.05）；西药组、治疗组和空白组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；中药组优于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
表1
术后不同时间各组创面愈合率比较（n=40，%，
）
2.2 创面愈合时间
空白组、模型组、中药组、西药组和治疗组创面愈合时间分别为（16.35±0.95）、（20.38±1.28）、（20.17±1.12）、（18.05±1.55）、（17.39±1.23） d。空白组创面愈合最为迅速，相较于其他组别，差异有统计学意义（P<0.05）；模型组和中药组愈合相对最慢，相较于其他组别，差异有统计学意义（P<0.05）；在愈合时间上，模型组和中药组比较、西药组和治疗组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
表2
各组组织不同时间 IL-1β 含量的动态比较（n=10，pg/mL，
）
2.3 HE 染色结果
术后第 3 天：治疗组、空白组创面炎症反应与其他 3 组相比较轻，其他 3 组创面炎症反应重，创面肿胀、渗出，镜下皮下组织可见大量坏死组织及炎性细胞浸润。术后第 7 天：各组均可见部分坏死组织及炎细胞浸润，治疗组、西药组的坏死组织及炎细胞浸润程度比模型组、中药组轻，但各组炎症反应均比第 3 天减轻。术后第 14 天：上皮组织大部分形成，表皮细胞分化良好，较正常上皮更为肥厚，且能够看到胶原纤维（新生）和部分炎细胞。其下为平行排列的胶原纤维及小血管，可见瘢痕形成。治疗组、西药组的小血管数量比模型组、中药组多，胶原纤维排列更为致密。术后第 21 天：各组创面可见上皮组织覆盖，并可见大量瘢痕组织增生，大量成熟的且数量较多的胶原纤维，毛细血管管径大，数量较前有所减少。见图 1。
图1
术后不同时间各组创面 HE 染色结果（HE ×200）
2.4 创面肉芽组织中 IL-1β 变化情况
在术后第 3、7 天，IL-1β 含量从低到高依次为空白组、治疗组、西药组、中药组、模型组，组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）；术后第 14 天，IL-1β 含量从低到高依次为治疗组、空白组、西药组、中药组、模型组，除西药组和中药组间差异无统计学意义（P>0.05）外，其余组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）；术后第 21 天，治疗组的 IL-1β 含量低于其余各组，差异有统计学意义（P<0.05），其余组间两两比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 2。
2.5 创面肉芽组织中 TNF-α 的表达
根据免疫组织化学图像染色强度以及阳性细胞来判断 TNF-α 的表达，模型组创面中 TNF-α 的表达在整个实验过程中均高于其余各组，而经药物干预的治疗组和西药组的 TNF-α 的表达下降较模型组明显，中药组 TNF-α 的表达强于治疗组和西药组。免疫组织化学图像见图 2。
图2
各组术后不同时间 TNF-α 的免疫组织化学图像（SABC ×200）
3 讨论
创伤修复分为炎症期、细胞增生期及重塑期[7]，炎症期的应答对创面的修复至关重要，IL-1β、TNF-α 都是炎症期重要的炎性因子。IL-1β 主要出现在早期炎症免疫反应中，使不同的免疫活性细胞具备更多功能，它对炎性反应、机体防御有一定诱导作用，维持机体内环境相对平衡[8-9]。TNF-α 主要由巨噬细胞、成纤维细胞、淋巴细胞以及内皮细胞等产生[10]，TNF-α 若发生高表达，表皮细胞将无法进行增殖，进而导致慢性创面无法实现短期愈合[11]。相关研究结果显示创伤伤口、全身血液均可表达出炎症细胞因子，前者对机体组织造成的影响要大于后者，局部表达可快速启动创伤修复，而 IL-1β、TNF-α 可对细胞反应进行调节，决定细胞外基质能不能合成，细胞是否能产生更多的血管以及肉芽组织，同时还决定细胞组织是否能进行更快分化，决定细胞组织是否具备更高的迁移活性[12]。因此，IL-1β、TNF-α 达到怎样的表达水平，与组织创面的修复有很大的关系[13]，可见创面若具备良好的炎症环境，其愈合时间也将大大缩短。
六合丹以清热解毒、活血化瘀通络立法，方中大黄为君药，性寒，味苦，入胃、大肠和肝经，有泻热毒、荡积滞、行瘀血的功效。黄柏为臣，性寒、味苦，归肾、大肠、膀胱经，能清热燥湿、泻火解毒、利水消肿，祛瘀化腐。两者协同发挥清热解毒、祛腐通络、逐瘀止痛的功效。白芨为佐使，性辛温，能消肿生肌敛疮，薄荷辛凉，可辛散通络、活血散肿、透热外出，温凉并用，辛而行气，以温济寒，加之乌梅酸涩，白芷辛温芳香、长于止痛，乌金散拔毒解毒，陈小粉散瘀止痛，再使用蜂蜜调制成中药糊剂，减少药物刺激，诸药共用，共奏清热解毒、行气活血、消肿止痛、散结化瘀之功效。彭小航等[14-15]将微米六合丹外敷于急性胰腺炎大鼠腹部，发现六合丹能降低急性胰腺炎大鼠的血清淀粉酶、TNF-α、IL-6、IL-10、血栓烷素 B2 及 6-酮-前列腺素 F1α 水平，提示六合丹外敷有助于减轻实验大鼠急性胰腺炎过氧化损伤和炎症反应。
本研究结果显示在创面修复过程中，炎症细胞因子呈现动态变化，在术后第 3 天开始明显升高，术后第 7 天达到峰值，然后逐渐下降。模型组创面相较于其他组表达出更多的 IL-1β、TNF-α，所以创面愈合时间也更长，而经药物干预的治疗组和西药组的 IL-1β、TNF-α 的表达下降较模型组明显。西药组和中药组相比，西药组的 IL-1β、TNF-α 的表达下降较中药组明显，藻酸钙伤口敷料对炎症因子的调控作用比紫草油强。术后第 14、21 天创面处于细胞增生期及重塑期，各组创面中的 IL-1β、TNF-α 表达下降，虽空白组未滴细菌，但实验环境并不是无菌环境，治疗组使用六合丹治疗感染性创面，对创面的炎症因子仍有调控作用，对比未使用药物治疗的空白组，其 IL-1β、TNF-α 表达减弱，从该层面也证实六合丹对慢性感染创面的促愈合作用。早期炎症反应关系到创面愈合，IL-1β、TNF-α 这两种因子间可相互协同导致后期感染性创面很难实现愈合。六合丹外敷感染性创面可有效抑制 IL-1β、TNF-α 的表达，减少感染性创面炎性因子的释放。
综上所述，六合丹具有清热解毒、活血化瘀的功效，在炎症期，通过降低感染性创面 IL-1β 和 TNF-α 的表达水平，阻止创面释放出更多的炎症介质，为创面愈合提供良好的条件。进入组织重建期后，前期炎症反应轻的创面组织的细胞外基质、成纤维细胞、毛细血管具有更强的生长能力，加速创面的愈合。所以，六合丹通过对创面炎症进行有效抑制，加快创面更好地愈合，但创面的愈合是一个复杂的过程，多种调控因子参与组织修复，我们未来仍需发掘研究六合丹对调控因子之间的影响。
