引用本文： 陈井阳, 王艺霖, 王霖, 刘洁. 人垂体瘤转化基因 1 抑制卵巢癌 A2780 细胞凋亡的分子机制研究. 华西医学, 2017, 32(11): 1734-1738. doi: 10.7507/1002-0179.201704187 复制
卵巢癌是妇科常见肿瘤之一。由于其自身特点，卵巢癌很难做到早期诊断和早期治疗，导致其病死率较高，预后差。而细胞凋亡抑制是该肿瘤形成的关键[1]，因此，深入探究细胞凋亡和卵巢癌的关系有重要意义。人垂体瘤转化基因 1（human pituitary tumor-transforming gene，hPTTG1）是近年发现与卵巢癌发生、发展密切相关的原癌基因[2-3]，并可作为该肿瘤基因治疗的候选靶点[4-5]。生存素（survivin）是凋亡蛋白抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族的特殊成员，既可通过阻抑经典的胱天蛋白酶（caspase）活化，也可通过促进细胞分裂而抑制细胞凋亡[6-7]。 survivin 异常表达导致的凋亡抑制和卵巢癌的发生发展、侵袭转移及预后相关[8]。在不同的肿瘤组织、病理条件下 hPTTG1 对细胞凋亡有诱导和抑制的双重作用[9-10]。本研究将 hPTTG1 小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）转染体外培养的卵巢癌 A2780 细胞株，观察其对细胞凋亡的影响；探讨 hPTTG1 与 survivin 在卵巢癌细胞凋亡调控中的作用和相互关系，为揭示卵巢癌的发生机制、寻找新的治疗手段提供理论参考和实验依据。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
1.1.1 主要试剂
细胞培养基、胎牛血清、胰酶购自美国 Gibco/BRL 公司；hPTTG1 siRNA、阴性对照 siRNA 及细胞凋亡 DNA 试剂盒购自德国 Qiagen 公司；逆转录试剂盒和阳离子脂质体转染试剂购自美国 Invitrogen 公司；RNA 提取试剂、RNA 酶 H 和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增试剂盒购自日本 Toyobo 公司；定量 PCR 配套的逆转录试剂盒和 SYBR 定量 PCR 试剂盒购自大连 TaKaRa 有限公司；hPTTG1 多克隆抗体、survivin 单克隆抗体、β-actin 抗体和增强型化学发光检测试剂购自美国 Santa Cruz 公司；hPTTG1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）定量 PCR 引物，survivin 和 β-actin 引物由上海生工生物工程有限公司合成；相对分子质量标志物购自立陶宛 Fermentas 公司；辣根标记兔抗山羊免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G 购自中杉金桥生物有限公司；caspase-3 活性检测试剂盒购自美国 R&D 公司。
1.1.2 仪器
Heraeus Hera Cell 150 二氧化碳细胞培养箱（德国 Kendro 公司）；细胞培养专用超净工作台（中国苏州安泰空气技术有限公司）；Sigma 3K-30 台式低温高速冷冻离心机（美国 Sigma 公司）；Eppendorf 5810R 高速冷冻离心机（德国 Eppendorf 公司）；ABI PE 9700 DNA 扩增仪、Prism 7500 Sequence Detection System 荧光实时定量 PCR 扩增仪（美国 ABI 公司）；Bio-Rad PowerPac 200 通用电泳电源仪、Bio-Rad Sub-Cell GT 水平电泳仪、Bio-Rad Mini-Protein Ⅲ 小型蛋白电泳系统、Bio-Rad Seimi-Dry 蛋白半干转印系统（美国 Bio-Rad 公司）；自动封膜仪（中国江苏仪器设备公司）；Imager 5500 电泳凝胶成像分析仪（美国 Alpha 公司）；Biosciences FACSCalibu r 流式细胞仪（美国 BD 公司）。
1.2 细胞培养及转染
人卵巢癌细胞株 A2780 由中国医学科学院肿瘤研究所提供。常规培养在含 10% 胎牛血清、1×105 U/L 青霉素及 100 mg/L 链霉素的 RPMI1640 培养基中，待细胞生长到 85% 汇聚时用 0.25% 胰蛋白酶消化传代。转染前 24 h 用无血清、无抗生素的培养液接种细胞。hPPTG1 siRNA 靶序列：5’-AAG ACC TGC AAT AAT CCA GAA-3’，经 Blast 分析未见与其他任何人类基因存在同源性。首先参照 Lipofectamine 2000 操作说明，利用带有荧光的阴性对照 siRNA（3’-AlexaFluor 488）优化转染条件，荧光显微镜观察转染后荧光强度。以该条件进行转染，分为转染 hPPTG1 siRNA 的 hPTTG1 siRNA 干扰组、未转染任何 siRNA 的正常组和转染阴性对照 siRNA 的阴性对照组，转染 48 h 后进行检测。
1.3 实时 PCR 检测 hPPTG1 基因 mRNA 表达
参照 TRIzol 试剂说明书提取各组细胞总 RNA，利用可除去基因组 DNA 的定量 PCR 专用反转录试剂盒合成互补 DNA（complementary DNA，cDNA）；使用 SYBR Green Ⅰ嵌合荧光法进行实时 PCR，反应条件：95℃ 30 s 预变性，95℃ 3 s，60℃ 30 s，40 个循环。hPPTG1 和内参 GAPDH 基因引物见表 1。每个样品设 3 个平行孔，经 3 次重复实验，计算平均循环阈值（cycle threshold，Ct），以 2–ΔΔCt法计算实验组与对照组 hPPTG1 相对表达量。
表1
引物序列表
1.4 DNA 梯形电泳
离心收集转染后细胞，按照细胞凋亡 DNA Ladder 检测试剂盒说明抽提细胞 DNA，乙醇沉淀后用加入 10 μL TE 缓冲液溶解 DNA，在该样品中加入 2 μL 上样缓冲液，1.5% 琼脂糖凝胶电泳，自动电泳凝胶扫描分析系统观察。
1.5 碘化丙啶（propidium iodide，PI）单染法流式细胞仪检测细胞凋亡
细胞先用不含乙二胺四乙酸的 0.25% 胰酶消化，离心收集；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤 1 次，离心去除 PBS，加入预冷的 70% 乙醇 4℃ 固定 2 h；离心弃去固定液，3 mL PBS 重悬 5 min，400 目筛网过滤 1 次，800 r/min 离心 5 min，离心半径 9.30 cm，弃去 PBS；用 1 mL PI 染液 4℃ 避光染色 30 min；流式细胞仪检测。
1.6 逆转录-PCR 检测 survivin 基因 mRNA 表达
在 GeneBank 中检索基因序列，利用 Primer-Blast 在线设计引物，引物序列见表 1。参照 TRIzol 试剂说明书提取各组细胞总 RNA，利用 oligo（dT）20 引物和 SuperScriptTM Ⅲ 试剂盒逆转录成 cDNA，按照 KOD FX DNA polymerase 试剂盒说明书进行 PCR 扩增，反应条件为：94℃ 2 min，94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，33 个循环，72℃ 5 min。PCR 产物经 2% 琼脂糖电泳检测，溴化乙锭染色后利用自动电泳凝胶扫描分析系统测定电泳条带的积分密度值（integrated density value，IDV），实验重复 3 次，取目的基因/β-actin IDV 平均值作为其 mRNA 表达水平的相对值。
1.7 蛋白质免疫法检测 survivin 蛋白表达
提取细胞总蛋白，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳后，半干转印到硝酸纤维素膜，5% 脱脂奶粉封闭 2 h 后，加入第一抗体（hPTTG1 1∶200，β-actin 1∶500）室温孵育 2 h，含有吐温-20 的 PBS 洗膜后加入 1∶5 000 稀释的第二抗体孵育 1 h，洗膜后，增强化学发光法显色曝光并通过 X 线胶片曝光洗片，经自动电泳凝胶分析系统扫描并测定杂交条带 IDV，实验重复 3 次，将 survivin IDV/β-actin IDV 平均值作为其蛋白表达水平的相对值。
1.8 caspase-3 活性测定
离心收集细胞，根据试剂盒说明书进行裂解，离心收集上清液，取 50 μL 细胞溶解液加入 50 μL 反应缓冲液（含 0.5 μL 二硫苏糖醇）和 5 μL caspase-3 底物乙酰基-天冬氨酸-谷氨酸-颉氨酸-天冬氨酸-对硝基苯胺，37℃ 孵育 1 h，利用酶标仪在 405 nm 波长处测定吸光度值（A405 nm），实验重复 3 次，取其平均值作为每组 caspase-3 的相对活性。
1.9 统计学方法
使用 SPSS 13.0 软件进行统计分析。所有数据以均数±标准差来表示，组间比较采用单因素方差分析。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 hPTTG1 siRNA 的沉默效应检测
以正常组 hPTTG1 基因表达平均值作为 1，阴性对照组 hPTTG1 基因表达相对水平为 0.95±0.02，hPTTG1 siRNA 干扰组 hPTTG1 基因表达相对水平为 0.29±0.04，是正常组 hPTTG1 基因表达水平的（28.72±3.56）%，与正常和阴性对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05），正常组和阴性对照组间hPTTG1 基因表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。
2.2 DNA 琼脂糖电泳
hPTTG1 siRNA 干扰组可见典型的 DNA 梯状条形带，正常及阴性对照组未检测到明显的梯形带，表明转染 hPTTG1 siRNA 可诱导 A2780 细胞凋亡。见图 1。
图1
各组细胞的 DNA ladder 检测结果
M：100 bp DNA marker；1：正常组；2：阴性对照组；3：
2.3 细胞凋亡流式检测结果
在流式细胞仪检测到的 PI 荧光直方图上，凋亡细胞在 G1/G0 期前出现一亚二倍体峰，正常组、阴性对照组、hPTTG1 siRNA 干扰组细胞凋亡率分别为（8.97±1.56）%、（9.64±1.31）%、（17.53± 2.17）%，hPTTG1 siRNA 干扰组细胞凋亡率高于正常和阴性对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 2。
图2
各组细胞 PI 单染流式检测结果
a. 正常组；b. 阴性对照组；c.
2.4 hPTTG1 siRNA 对 A2780 细胞中 survivin mRNA 和蛋白表达的影响
hPTTG1 siRNA 干扰组 survivin 在 mRNA 和蛋白水平表达均下调，hPTTG1 siRNA 干扰组 survivin mRNA 表达量为 0.39±0.11，低于正常组的 0.73±0.02 和阴性对照组的 0.65±0.07，差异有统计学意义（P<0.05）；hPTTG1 siRNA 干扰组 survivin 蛋白表达量为 0.41±0.05，低于正常组的 0.81±0.04 和阴性对照组的 0.72±0.01，差异有统计学意义（P<0.05），而正常组和阴性对照组间 mRNA 和蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。见图 3、4。
图3
hPTTG1 siRNA 对 A2780 细胞 survivin mRNA 表达的影响
M：ФX174 DNA/
图4
hPTTG1 siRNA 对 A2780 细胞 survivin 蛋白表达的影响
1：正常组；2：阴性对照组；3：
2.5 hPTTG1 siRNA 对 A2780 细胞中 caspase-3 活性的影响
hPTTG1 siRNA 干扰组 caspase-3 活性明显增强，A405 nm 为 0.26±0.07，与正常组和阴性对照组 A405 nm 相比差异有统计学意义（P<0.05）；正常组A405 nm 为 0.13±0.03，阴性对照组 A405 nm 为 0.11±0.02，二者比较差异无统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
hPTTG1 定位于人类染色体 5q33，全长 787 bp，含有 5 个外显子和 4 个内含子，编码由 202 个氨基酸残基组成的相对分子质量为 22×103的分离素抑制蛋白（securin），以细胞周期依赖性方式表达。hPTTG1 亚细胞定位既可位于细胞核也可位于细胞质中[2]。hPTTG1 在胎儿肝脏、胸腺和睾丸组织中强表达，在结肠、小肠、脑、胎盘和胰腺中弱表达，在其他正常成人组织中表达极低甚至检测不到。hPTTG1 是一种强肿瘤转化基因，可通过调节细胞周期、干扰姊妹染色单体分离、调控细胞凋亡、反式激活及细胞转化作用参与肿瘤进程，并与肿瘤的侵袭转移等关系密切[11-12]。survivin 是 IAP 家族中的新成员，定位于 17q25 染色体，全长 15 kb，含 4 个外显子和 3 个内含子，编码含 142 个氨基酸、相对分子质量为 16.5×103 的蛋白质。survivin 主要表达于胚胎、发育的胎儿组织等分化不成熟组织，除在胸腺、胎盘、CD34+ 细胞、结肠基底上皮细胞、甲状腺、生殖腺中微弱表达外，其在绝大多数正常成人组织和细胞中均无表达。survivin 可通过以下途径抑制细胞凋亡[6-7]：① 介导原 caspase-3/P21 复合体的形成，抑制 caspase-3 的激活及其介导的细胞凋亡级联反应；② 直接抑制 caspase-3、caspase-7 的激活和活性；③ 与 caspase-9 结合，抑制其激活下游效应 caspase；④ 与 Smac/DIABLO 结合，使其他 IAP 不受抑制，继续发挥抗细胞凋亡的作用。survivin 在人类多种肿瘤中均高表达，并与肿瘤的病理分级、病情分期、患者预后、放射/化学治疗效果等存在一定关系[13]。survivin 在正常卵巢组织中无表达，在恶性或交界性肿瘤中表达强度和阳性率明显高于良性肿瘤，且同卵巢癌的临床分期、组织学分型、p53 基因突变等反映卵巢癌不良预后的因素相关[14]，这提示其可通过抑制卵巢癌细胞凋亡而对卵巢癌的发展与侵袭起重要作用[15]。迄今为止，hPTTG1 和 survivin 在卵巢癌细胞凋亡中是否发生作用也未见报道。
本研究利用体外合成的 hPTTG1 siRNA 转染 A2780 细胞，通过定量 PCR 检测沉默效应，结果显示 hPTTG1 siRNA 转染后 A2780 细胞内 hPTTG1 基因表达水平显著降低，下调了 72.3%，与正常组和阴性对照组间差异有统计学意义，这表明hPTTG1 siRNA 能高效特异地抑制该靶基因表达，实现基因沉默效应。随后的 DNA 梯形电泳和流式细胞仪结果表明 hPTTG1 表达下调可诱导 A2780 细胞凋亡。对 survivin mRNA 和蛋白的检测表明 hPTTG1 水平降低可引起 survivin 表达下调，提示 survivin 可能是 hPTTG1 下游的靶点，由于 survivin 具有凋亡抑制作用，其表达下调导致对细胞凋亡的抑制作用减弱，从而引起细胞凋亡增多。在细胞凋亡始动和发生阶段，caspase 家族处于核心地位，其中 caspase-3 激活与细胞凋亡几乎是同步，是哺乳动物凋亡中的关键蛋白酶。实验结果显示 hPTTG1 siRNA 干扰组 caspase-3 活性增强，因此，我们推测在卵巢癌中 hPTTG1 有凋亡抑制作用，主要通过上调下游凋亡抑制基因 survivin 表达，抑制 caspase-3 活化实现。siRNA 以其基因沉默的高度特异性、高效性和安全性，为卵巢癌的基因治疗开辟了新途径[16-17]。对 hPTTG1 在卵巢癌中的作用及调控机制的深入研究，将为该肿瘤的基因治疗提供新思路。
卵巢癌是妇科常见肿瘤之一。由于其自身特点，卵巢癌很难做到早期诊断和早期治疗，导致其病死率较高，预后差。而细胞凋亡抑制是该肿瘤形成的关键[1]，因此，深入探究细胞凋亡和卵巢癌的关系有重要意义。人垂体瘤转化基因 1（human pituitary tumor-transforming gene，hPTTG1）是近年发现与卵巢癌发生、发展密切相关的原癌基因[2-3]，并可作为该肿瘤基因治疗的候选靶点[4-5]。生存素（survivin）是凋亡蛋白抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族的特殊成员，既可通过阻抑经典的胱天蛋白酶（caspase）活化，也可通过促进细胞分裂而抑制细胞凋亡[6-7]。 survivin 异常表达导致的凋亡抑制和卵巢癌的发生发展、侵袭转移及预后相关[8]。在不同的肿瘤组织、病理条件下 hPTTG1 对细胞凋亡有诱导和抑制的双重作用[9-10]。本研究将 hPTTG1 小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）转染体外培养的卵巢癌 A2780 细胞株，观察其对细胞凋亡的影响；探讨 hPTTG1 与 survivin 在卵巢癌细胞凋亡调控中的作用和相互关系，为揭示卵巢癌的发生机制、寻找新的治疗手段提供理论参考和实验依据。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
1.1.1 主要试剂
细胞培养基、胎牛血清、胰酶购自美国 Gibco/BRL 公司；hPTTG1 siRNA、阴性对照 siRNA 及细胞凋亡 DNA 试剂盒购自德国 Qiagen 公司；逆转录试剂盒和阳离子脂质体转染试剂购自美国 Invitrogen 公司；RNA 提取试剂、RNA 酶 H 和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增试剂盒购自日本 Toyobo 公司；定量 PCR 配套的逆转录试剂盒和 SYBR 定量 PCR 试剂盒购自大连 TaKaRa 有限公司；hPTTG1 多克隆抗体、survivin 单克隆抗体、β-actin 抗体和增强型化学发光检测试剂购自美国 Santa Cruz 公司；hPTTG1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）定量 PCR 引物，survivin 和 β-actin 引物由上海生工生物工程有限公司合成；相对分子质量标志物购自立陶宛 Fermentas 公司；辣根标记兔抗山羊免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G 购自中杉金桥生物有限公司；caspase-3 活性检测试剂盒购自美国 R&D 公司。
1.1.2 仪器
Heraeus Hera Cell 150 二氧化碳细胞培养箱（德国 Kendro 公司）；细胞培养专用超净工作台（中国苏州安泰空气技术有限公司）；Sigma 3K-30 台式低温高速冷冻离心机（美国 Sigma 公司）；Eppendorf 5810R 高速冷冻离心机（德国 Eppendorf 公司）；ABI PE 9700 DNA 扩增仪、Prism 7500 Sequence Detection System 荧光实时定量 PCR 扩增仪（美国 ABI 公司）；Bio-Rad PowerPac 200 通用电泳电源仪、Bio-Rad Sub-Cell GT 水平电泳仪、Bio-Rad Mini-Protein Ⅲ 小型蛋白电泳系统、Bio-Rad Seimi-Dry 蛋白半干转印系统（美国 Bio-Rad 公司）；自动封膜仪（中国江苏仪器设备公司）；Imager 5500 电泳凝胶成像分析仪（美国 Alpha 公司）；Biosciences FACSCalibu r 流式细胞仪（美国 BD 公司）。
1.2 细胞培养及转染
人卵巢癌细胞株 A2780 由中国医学科学院肿瘤研究所提供。常规培养在含 10% 胎牛血清、1×105 U/L 青霉素及 100 mg/L 链霉素的 RPMI1640 培养基中，待细胞生长到 85% 汇聚时用 0.25% 胰蛋白酶消化传代。转染前 24 h 用无血清、无抗生素的培养液接种细胞。hPPTG1 siRNA 靶序列：5’-AAG ACC TGC AAT AAT CCA GAA-3’，经 Blast 分析未见与其他任何人类基因存在同源性。首先参照 Lipofectamine 2000 操作说明，利用带有荧光的阴性对照 siRNA（3’-AlexaFluor 488）优化转染条件，荧光显微镜观察转染后荧光强度。以该条件进行转染，分为转染 hPPTG1 siRNA 的 hPTTG1 siRNA 干扰组、未转染任何 siRNA 的正常组和转染阴性对照 siRNA 的阴性对照组，转染 48 h 后进行检测。
1.3 实时 PCR 检测 hPPTG1 基因 mRNA 表达
参照 TRIzol 试剂说明书提取各组细胞总 RNA，利用可除去基因组 DNA 的定量 PCR 专用反转录试剂盒合成互补 DNA（complementary DNA，cDNA）；使用 SYBR Green Ⅰ嵌合荧光法进行实时 PCR，反应条件：95℃ 30 s 预变性，95℃ 3 s，60℃ 30 s，40 个循环。hPPTG1 和内参 GAPDH 基因引物见表 1。每个样品设 3 个平行孔，经 3 次重复实验，计算平均循环阈值（cycle threshold，Ct），以 2–ΔΔCt法计算实验组与对照组 hPPTG1 相对表达量。
表1
引物序列表
1.4 DNA 梯形电泳
离心收集转染后细胞，按照细胞凋亡 DNA Ladder 检测试剂盒说明抽提细胞 DNA，乙醇沉淀后用加入 10 μL TE 缓冲液溶解 DNA，在该样品中加入 2 μL 上样缓冲液，1.5% 琼脂糖凝胶电泳，自动电泳凝胶扫描分析系统观察。
1.5 碘化丙啶（propidium iodide，PI）单染法流式细胞仪检测细胞凋亡
细胞先用不含乙二胺四乙酸的 0.25% 胰酶消化，离心收集；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤 1 次，离心去除 PBS，加入预冷的 70% 乙醇 4℃ 固定 2 h；离心弃去固定液，3 mL PBS 重悬 5 min，400 目筛网过滤 1 次，800 r/min 离心 5 min，离心半径 9.30 cm，弃去 PBS；用 1 mL PI 染液 4℃ 避光染色 30 min；流式细胞仪检测。
1.6 逆转录-PCR 检测 survivin 基因 mRNA 表达
在 GeneBank 中检索基因序列，利用 Primer-Blast 在线设计引物，引物序列见表 1。参照 TRIzol 试剂说明书提取各组细胞总 RNA，利用 oligo（dT）20 引物和 SuperScriptTM Ⅲ 试剂盒逆转录成 cDNA，按照 KOD FX DNA polymerase 试剂盒说明书进行 PCR 扩增，反应条件为：94℃ 2 min，94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，33 个循环，72℃ 5 min。PCR 产物经 2% 琼脂糖电泳检测，溴化乙锭染色后利用自动电泳凝胶扫描分析系统测定电泳条带的积分密度值（integrated density value，IDV），实验重复 3 次，取目的基因/β-actin IDV 平均值作为其 mRNA 表达水平的相对值。
1.7 蛋白质免疫法检测 survivin 蛋白表达
提取细胞总蛋白，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳后，半干转印到硝酸纤维素膜，5% 脱脂奶粉封闭 2 h 后，加入第一抗体（hPTTG1 1∶200，β-actin 1∶500）室温孵育 2 h，含有吐温-20 的 PBS 洗膜后加入 1∶5 000 稀释的第二抗体孵育 1 h，洗膜后，增强化学发光法显色曝光并通过 X 线胶片曝光洗片，经自动电泳凝胶分析系统扫描并测定杂交条带 IDV，实验重复 3 次，将 survivin IDV/β-actin IDV 平均值作为其蛋白表达水平的相对值。
1.8 caspase-3 活性测定
离心收集细胞，根据试剂盒说明书进行裂解，离心收集上清液，取 50 μL 细胞溶解液加入 50 μL 反应缓冲液（含 0.5 μL 二硫苏糖醇）和 5 μL caspase-3 底物乙酰基-天冬氨酸-谷氨酸-颉氨酸-天冬氨酸-对硝基苯胺，37℃ 孵育 1 h，利用酶标仪在 405 nm 波长处测定吸光度值（A405 nm），实验重复 3 次，取其平均值作为每组 caspase-3 的相对活性。
1.9 统计学方法
使用 SPSS 13.0 软件进行统计分析。所有数据以均数±标准差来表示，组间比较采用单因素方差分析。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 hPTTG1 siRNA 的沉默效应检测
以正常组 hPTTG1 基因表达平均值作为 1，阴性对照组 hPTTG1 基因表达相对水平为 0.95±0.02，hPTTG1 siRNA 干扰组 hPTTG1 基因表达相对水平为 0.29±0.04，是正常组 hPTTG1 基因表达水平的（28.72±3.56）%，与正常和阴性对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05），正常组和阴性对照组间hPTTG1 基因表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。
2.2 DNA 琼脂糖电泳
hPTTG1 siRNA 干扰组可见典型的 DNA 梯状条形带，正常及阴性对照组未检测到明显的梯形带，表明转染 hPTTG1 siRNA 可诱导 A2780 细胞凋亡。见图 1。
图1
各组细胞的 DNA ladder 检测结果
M：100 bp DNA marker；1：正常组；2：阴性对照组；3：
2.3 细胞凋亡流式检测结果
在流式细胞仪检测到的 PI 荧光直方图上，凋亡细胞在 G1/G0 期前出现一亚二倍体峰，正常组、阴性对照组、hPTTG1 siRNA 干扰组细胞凋亡率分别为（8.97±1.56）%、（9.64±1.31）%、（17.53± 2.17）%，hPTTG1 siRNA 干扰组细胞凋亡率高于正常和阴性对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 2。
图2
各组细胞 PI 单染流式检测结果
a. 正常组；b. 阴性对照组；c.
2.4 hPTTG1 siRNA 对 A2780 细胞中 survivin mRNA 和蛋白表达的影响
hPTTG1 siRNA 干扰组 survivin 在 mRNA 和蛋白水平表达均下调，hPTTG1 siRNA 干扰组 survivin mRNA 表达量为 0.39±0.11，低于正常组的 0.73±0.02 和阴性对照组的 0.65±0.07，差异有统计学意义（P<0.05）；hPTTG1 siRNA 干扰组 survivin 蛋白表达量为 0.41±0.05，低于正常组的 0.81±0.04 和阴性对照组的 0.72±0.01，差异有统计学意义（P<0.05），而正常组和阴性对照组间 mRNA 和蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。见图 3、4。
图3
hPTTG1 siRNA 对 A2780 细胞 survivin mRNA 表达的影响
M：ФX174 DNA/
图4
hPTTG1 siRNA 对 A2780 细胞 survivin 蛋白表达的影响
1：正常组；2：阴性对照组；3：
2.5 hPTTG1 siRNA 对 A2780 细胞中 caspase-3 活性的影响
hPTTG1 siRNA 干扰组 caspase-3 活性明显增强，A405 nm 为 0.26±0.07，与正常组和阴性对照组 A405 nm 相比差异有统计学意义（P<0.05）；正常组A405 nm 为 0.13±0.03，阴性对照组 A405 nm 为 0.11±0.02，二者比较差异无统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
hPTTG1 定位于人类染色体 5q33，全长 787 bp，含有 5 个外显子和 4 个内含子，编码由 202 个氨基酸残基组成的相对分子质量为 22×103的分离素抑制蛋白（securin），以细胞周期依赖性方式表达。hPTTG1 亚细胞定位既可位于细胞核也可位于细胞质中[2]。hPTTG1 在胎儿肝脏、胸腺和睾丸组织中强表达，在结肠、小肠、脑、胎盘和胰腺中弱表达，在其他正常成人组织中表达极低甚至检测不到。hPTTG1 是一种强肿瘤转化基因，可通过调节细胞周期、干扰姊妹染色单体分离、调控细胞凋亡、反式激活及细胞转化作用参与肿瘤进程，并与肿瘤的侵袭转移等关系密切[11-12]。survivin 是 IAP 家族中的新成员，定位于 17q25 染色体，全长 15 kb，含 4 个外显子和 3 个内含子，编码含 142 个氨基酸、相对分子质量为 16.5×103 的蛋白质。survivin 主要表达于胚胎、发育的胎儿组织等分化不成熟组织，除在胸腺、胎盘、CD34+ 细胞、结肠基底上皮细胞、甲状腺、生殖腺中微弱表达外，其在绝大多数正常成人组织和细胞中均无表达。survivin 可通过以下途径抑制细胞凋亡[6-7]：① 介导原 caspase-3/P21 复合体的形成，抑制 caspase-3 的激活及其介导的细胞凋亡级联反应；② 直接抑制 caspase-3、caspase-7 的激活和活性；③ 与 caspase-9 结合，抑制其激活下游效应 caspase；④ 与 Smac/DIABLO 结合，使其他 IAP 不受抑制，继续发挥抗细胞凋亡的作用。survivin 在人类多种肿瘤中均高表达，并与肿瘤的病理分级、病情分期、患者预后、放射/化学治疗效果等存在一定关系[13]。survivin 在正常卵巢组织中无表达，在恶性或交界性肿瘤中表达强度和阳性率明显高于良性肿瘤，且同卵巢癌的临床分期、组织学分型、p53 基因突变等反映卵巢癌不良预后的因素相关[14]，这提示其可通过抑制卵巢癌细胞凋亡而对卵巢癌的发展与侵袭起重要作用[15]。迄今为止，hPTTG1 和 survivin 在卵巢癌细胞凋亡中是否发生作用也未见报道。
本研究利用体外合成的 hPTTG1 siRNA 转染 A2780 细胞，通过定量 PCR 检测沉默效应，结果显示 hPTTG1 siRNA 转染后 A2780 细胞内 hPTTG1 基因表达水平显著降低，下调了 72.3%，与正常组和阴性对照组间差异有统计学意义，这表明hPTTG1 siRNA 能高效特异地抑制该靶基因表达，实现基因沉默效应。随后的 DNA 梯形电泳和流式细胞仪结果表明 hPTTG1 表达下调可诱导 A2780 细胞凋亡。对 survivin mRNA 和蛋白的检测表明 hPTTG1 水平降低可引起 survivin 表达下调，提示 survivin 可能是 hPTTG1 下游的靶点，由于 survivin 具有凋亡抑制作用，其表达下调导致对细胞凋亡的抑制作用减弱，从而引起细胞凋亡增多。在细胞凋亡始动和发生阶段，caspase 家族处于核心地位，其中 caspase-3 激活与细胞凋亡几乎是同步，是哺乳动物凋亡中的关键蛋白酶。实验结果显示 hPTTG1 siRNA 干扰组 caspase-3 活性增强，因此，我们推测在卵巢癌中 hPTTG1 有凋亡抑制作用，主要通过上调下游凋亡抑制基因 survivin 表达，抑制 caspase-3 活化实现。siRNA 以其基因沉默的高度特异性、高效性和安全性，为卵巢癌的基因治疗开辟了新途径[16-17]。对 hPTTG1 在卵巢癌中的作用及调控机制的深入研究，将为该肿瘤的基因治疗提供新思路。
