调节性 T 细胞（regulatory T cell，Treg）在免疫耐受中发挥着至关重要的作用，可以通过控制对自身抗原的免疫反应来预防自身免疫性疾病的发生，同时能够抑制免疫系统对外来抗原的应答，从而减少 T 细胞介导的病理性免疫应答。近年来研究显示器官特异性自身免疫的抑制作用依赖于 Treg 的抗原特异性。一种新兴的 Treg 作用模式是表达特异性抗原的树突状细胞激活抗原特异性 Treg 并使其获得抑制活性。因此，抗原特异性 Treg 的过继治疗比多克隆 Treg 更为有效，确定相关抗原，并从多克隆 Treg 中扩增出抗原特异性 Treg。该文对抗原特异性 Treg 的扩增技术、功能、抗原特异性以及 Treg 在临床中的潜在治疗进行了综述。
引用本文： 金熙, 李虹. 抗原特异性调节性 T 细胞的研究进展及其在临床中的应用前景. 华西医学, 2018, 33(5): 616-622. doi: 10.7507/1002-0179.201707024 复制
适应性免疫应答是通过识别“自身”和“非己”，有效地排除体内异物抗原，以维持机体对自身抗原的耐受。达到对自身抗原的外周免疫耐受可以通过多种不同的机制，但是主要的途径是通过调节性 T 细胞（regulatory T cell，Treg）对免疫应答的抑制作用[1-2]。Treg 可以通过控制对自身抗原的免疫反应来预防自身免疫性疾病的发生，同时能够抑制免疫系统对外来抗原的应答，从而减少 T 细胞介导的病理性免疫应答。Treg 的免疫抑制机制主要是对 CD4+、CD8+ T 细胞以及 B 细胞的活化反应作出抑制调节。Treg 还能抑制 CD4+CD25-细胞以及树突状细胞（dendritic cell，DC）的活化增殖[3]。Treg 的抑制特性使得其成为免疫治疗的最佳候选方案。大量实验研究证实 Treg 能够控制自身免疫性疾病，诱导移植耐受以及预防移植物抗宿主疾病（graft-versus-host disease，GVHD）[4-6]等。
小鼠模型的相关研究显示多克隆 Treg 能够预防各种自身免疫疾病[7]。体外实验显示 Treg 抑制功能的激活需要通过 T 细胞受体（T cell receptor，TCR）将 Treg 活化，一旦活化，Treg 能够抑制 T 细胞，其抑制作用是非抗原特异性的。有研究分析 Treg 的 TCR，结果显示大部分该群细胞能够识别外周自身抗原[8]。Treg 在广表达外周自身抗原的长期刺激下，形成了 Treg 的广泛抑制作用，而建立抗原特异性免疫应答能够克服这个问题。近年有文献报道 Treg 的功能和器官特异性耐受主要与抗原特异性 Treg 相关[9-10]。首先，早期的 Treg 治疗研究提到 Treg 的体外回输需要扩增大量的多克隆 Treg，并且要在淋巴细胞减少的情况下实施，这样能够驱使回输 Treg 的扩增以及激活抑制能力[11-13]。其次，最近研究报道显示在小鼠异种 GVHD 模型中，抗原特异性 Treg 比多克隆扩增 Treg 能够更有效地控制 GVHD 的发生[14]。这些结果提示抗原特异性是 Treg 发挥其最佳功能的关键，同时也预测有效的 Treg 细胞治疗受益于从多克隆 Treg 中获得能够识别和选择性扩增的器官特异性 Treg。抗原特异性 Treg 的使用可能会避免回输大量多克隆 Treg 带来的副作用，例如肿瘤与感染的发生。本文将对抗原特异性 Treg 的扩增技术、功能、抗原特异性以及 Treg 在临床中的潜在治疗进行综述。
1 抗原特异性 Treg 的体外扩增
在体内回输治疗中如何获得足够数量的 Treg 细胞是早期研究的障碍。在小鼠和人中，CD4+CD25+ Treg 在 CD4+ T 细胞中占 3%～5%[14]，因此有大量实验研究建立了体外扩增多克隆 Treg 的方案[15-16]。体外研究发现 Treg 具有免疫无能性，它对效应 T 细胞的刺激源表现出无应答状态[17]。当经 TCR 介导信号刺激并有高浓度外源性白细胞介素（interleukin，IL）-2 存在的情况下，Treg 细胞可活化并增殖[18]。IL-2 最早被称为 T 细胞生长因子，在体外能够促进 T 细胞的生长和扩增。有研究发现 IL-2 不仅能够增强 Treg 的表型和功能，还可能是 Treg 的生存因子[19]。
Treg 的扩增依赖于 TCR 和 CD28 信号途径[15, 20]。扩增多克隆 Treg 需要外源性添加 IL-2 与通过 TCR 和 CD28 对 Treg 进行刺激。Treg 的扩增方案一般先通过 CD4、CD25 表面分子分选纯化出 Treg，然后用 CD3/CD28 抗体包被磁珠刺激纯化的 Treg，同时添加外源性的高剂量 IL-2[18, 21-22]。Treg 经过扩增后仍然维持其抑制作用，与新鲜分离 Treg 相比，扩增后的 Treg 甚至获得较强的抑制能力。
高效能的抗原特异性 Treg 的应用能够减少 Treg 回输的数量，而目前抗原特异性 Treg 的细胞频率还尚不明确，但似乎与抗原特异性 T 细胞在 CD4+效应细胞中的细胞频率相似[23]。尽管细胞频率很低，抗原特异性 Treg 从多克隆 Treg 中扩增还是能够实现。Peters 等[20]将人 Treg 分别经过 2 轮扩克隆刺激（抗 CD3/CD28 磁珠）和人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）不匹配的异基因外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）刺激联合重组 IL-2 和重组 IL-15 来诱导异基因抗原特异性 Treg。经过 2 轮刺激后，Treg 扩增倍数能够达到 780 倍，并具有抑制功能以及抗原特异性。抗原特异性 Treg 的成功诱导取决于抗原刺激的顺序。当 Treg 先用异基因抗原刺激，后用多克隆刺激，2 轮刺激后可获得大量 Treg 并具有抗原特异性抑制作用。而 Treg 在体外先经过多克隆刺激后，再接受异基因抗原刺激，虽然能够获得大量细胞，抑制作用具有抗原特异性，但是对第三方抗原刺激仍有抑制作用。而在我们的研究中，人的 Treg 在 CD3/CD28 抗体包被磁珠刺激联合雷帕霉素和高剂量 IL-2 在体外培养 1 个周期（7 d），以富集 Treg 数，扩增后的 Treg 再与异种抗原（猪 PBMC）共培养 2 个周期以获得异种抗原特异性 Treg[18, 24]。研究结果显示，Treg 经过 1 个周期异种抗原刺激后，Treg 表型没有发生改变且具有抑制作用，但是扩增倍数只有 14.2 倍，并且没有获得异种抗原特异性。经过 3 个周期异种抗原刺激后，Treg 的异种抗原特异性显著增强，其扩增倍数达到 1 329 倍，但 Treg 抑制能力较第 2 周期时有所下降。经过 2 个周期异种抗原刺激后，Treg 的扩增倍数达到 814 倍，在异种抗原刺激的混合淋巴细胞反应中，异种抗原特异性 Treg 在反应细胞与 Treg 比例为 8∶1、16∶1 和 32∶1 时的抑制率都远高于多克隆 Treg 在相同比例下的抑制率。结果提示异种抗原刺激 2 个周期，Treg 在异种抗原反应中的抑制作用增强，具有异种抗原特异性。
除此之外，也有其他方法用来扩增 Treg。利用异基因 DC 联合 IL-2，能够从多克隆 Treg 中扩增出抗原特异性 Treg，并且能够抑制 CD4+CD25-细胞增殖以及 GVHD 的发生[25]。Litjens 等[26]利用异基因 DC 联合 IL-15 扩增出抗原特异性 Treg。在胰岛表达溶血素的转基因小鼠模型中，DC 细胞能够向多克隆 Treg 递呈胰岛溶血素肽，从而扩增出抗原特异性 Treg，并且具有抑制功能[27]。同时也有大量研究显示，在体外各种条件刺激下能够诱导 CD4+CD25-细胞表达叉头框蛋白 P3（forkhead box P3，Foxp3），从而转变为 Treg[28-29]。Long 等[30]研究报道能够通过谷氨酸脱羧酶、葡糖-6-磷酸催化亚基相关蛋白肽和 1 型糖尿病相关 HLA-DRbeta 等位基因将 CD4+Foxp3- T 细胞诱导成胰岛抗原特异性 Treg。Tu 等[31]报道在没有外源细胞因子的刺激下，将 CD40 活化 B 细胞与 CD4+CD25- T 细胞共培养 3 周后，能诱导出抗原特异性 Treg。这种诱导的异基因抗原特异性 Treg 属于 CD45RO+CCR7-记忆细胞，表达 CD4、CD25、Foxp3 以及 CD62L。尽管 CD4+CD25+Foxp3+抗原特异性 Treg 没有细胞毒性作用，但是他们通过细胞间接触来发挥其抑制功能并依赖于细胞毒 T 淋巴细胞相关抗原 4（cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA-4）。Zheng 等[32]用 CD40 活化 B 细胞诱导和扩增 CD8 Treg，使其具有抗原特异性，其发挥抑制功能依赖于干扰素 γ、IL-2、IL-4 和 CTLA-4。
2 Treg 的抗原特异性
Treg 对器官特异性自身免疫的治疗依赖于 Treg 对相关抗原的识别能力，研究发现 Treg 和 CD4+CD25- T 细胞一样都能表达 TCR 家族多种基因，提示 Treg 能够识别多种抗原[33-34]。在胸腺中发育，Treg 在阳性和阴性选择的亲和范围内对自身抗原作出应答，因此使 Treg 的 TCR 对自身抗原具有高度亲和力[35]。但是近来有研究提出亲和力的重要性[36]，提示嵌合抗原受体在 T 细胞中更重要。一种 Treg 发育模式表明未成熟的胸腺细胞上的 TCR 与特异性的主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）Ⅱ类分子抗原肽复合物结合诱导 Foxp3 表达，这种亲和力的范围在阳性选择和阴性选择之间[36]。分析 Treg 的 TCR 证实与 CD4+CD25-细胞相比，这群细胞对自身抗原具有高度亲和力，而 Treg 的 TCR 与 CD4+CD25-细胞的 TCR 只有小部分的重叠[8]。
抗原特异性 Treg 通过识别靶抗原或表位对治疗自身免疫性疾病有潜在作用。不同自身免疫性疾病的致病抗原被发现，如 1 型糖尿病中的胰岛素和谷氨酸脱羧酶，多发性硬化症的髓磷脂碱基蛋白以及风湿性关节炎中的Ⅱ型胶原等。抗原特异性 Treg 的过继转移治疗能够针对特异性抗原发挥抑制作用，而不影响机体其他免疫功能。非肥胖型糖尿病（non-obese diabetic，NOD）小鼠模型实验数据表明胰岛抗原特异性 Treg 具有抑制功能并且能够控制糖尿病的发生[37]。Karim 等[38]将 CBA 小鼠的 Treg 分离后用供者特异性抗原（B10 小鼠血液）和抗 CD4 单克隆抗体预处理，再与 CD45RBhighCD4+细胞共同回输到 CBA Rag-/- 小鼠，1 d 后将 B10 小鼠的皮肤移植到细胞回输的 CBA Rag-/-小鼠的尾部，结果发现这种方式诱导的抗原特异性 Treg 能够预防供者来源皮肤移植排斥的发生，长达 100 d。为了证明 Treg 的抗原特异性，作者将 CBA 小鼠的 Treg 分离后用第三方来源抗原（BALB/c 小鼠血液）和抗 CD4 单克隆抗体预处理，再与 CD45RBhighCD4+细胞共同回输到 CBA Rag-/-小鼠，1 d 后将 B10 小鼠的皮肤移植到细胞回输的 CBA Rag-/-小鼠的尾部，结果发现诱导的第三方抗原特异性 Treg 不能有效地预防供者来源皮肤移植，B10 小鼠的皮肤在 25 d 被完全排斥。此外，作者用抗 CD4 单克隆抗体和 BALB/c 小鼠血液注射到 CBA 小鼠体内，将 Treg 从该小鼠脾脏中分离同时和 CD45RBhighCD4+细胞回输到 CBA Rag-/-小鼠，1 d 后将 BALB/c 小鼠的皮肤移植到细胞回输的 CBA Rag-/-小鼠的尾部，结果发现 Treg 能够有效防止 BALB/c 小鼠的皮肤移植排斥的发生。但是用 BALB/c 小鼠抗原诱导出的 Treg 并不能阻止 B10 小鼠皮肤移植排斥反应的发生。这些结果提示用抗 CD4 单克隆抗体和供者特异性抗原能够在体内和体外诱导出具有抗原特异性的 Treg，并且能够发挥抗原特异性的抑制作用。
3 抗原特异性 Treg 的抑制机制
目前 Treg 机制的研究有很多，而且对 Treg 抑制免疫应答的机制仍然存在很多争论。我们的体外研究表明抗原特异性 Treg 不仅通过细胞与细胞之间的接触来发挥其抑制作用，还通过细胞因子的分泌来发挥其抑制功能[18, 24]。体外扩增的抗原特异性 Treg 比非特异性 Treg 分泌更多的 IL-10、IL-35 和转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），并且表达更多的 CTLA-4 和可诱导共刺激分子（inducible costimulator，ICOS）[18, 24]，提示这些分子可能与 Treg 免疫调节的增强有关。当在体外培养体系中封闭 IL-10 和 IL-35 后，Treg 保持抑制功能但其功能下降。当用 Transwell 小室将 Treg 与反应细胞分开后，再向该培养体系中加入抗体封闭 IL-10 和 IL-35，则能阻断 Treg 的抑制功能。尽管 Treg 依赖于细胞表面分子 Foxp3 和 CTLA-4 以及表面活化因子 ICOS 和 HLA-DR 发挥抑制作用，但依赖细胞因子的抑制作用仍是其发挥功能的重要机制之一。而在体内，Treg 可能不止通过一种机制来发挥抑制作用。Yi 等[39]的体内研究表明 IL-10 在 Treg 介导的异种抗原免疫应答的抑制作用中扮演着重要的角色。不同机制的发挥可能取决于 Treg 是否抑制自身免疫性疾病的起始应答还是对疾病中活化 T 细胞的控制。局部细胞因子环境或疾病病理环境可能都对 Treg 的抑制功能有影响。
为了更好地了解抗原特异性 Treg 在体内的机制，Tang 等[40]使用双光子扫描显微镜观察淋巴结内 Treg 和糖尿病致病 T 细胞以及 DC 之间的动态变化。当胰岛反应性 T 细胞过继到 CD28 缺陷 NOD 小鼠中，这些辅助性 T 细胞（T helper cell，Th）起初在胰腺淋巴结与 DC 短暂性地相互作用，并且在胰腺淋巴结集结成簇[41-43]，Th 细胞识别 DC 呈递的抗原，形成一个比较稳定的结合状态，促使 T 细胞的活化与增殖。当胰岛抗原特异性 Treg 与胰岛反应性 T 细胞同时过继到 CD28 缺陷 NOD 小鼠中时，在胰腺淋巴结中却表现为不规则和大幅度的运动状态。这表明 Treg 可在胰腺淋巴结内阻止糖尿病致病性 T 细胞与 DC 接触从而抑制其活化。Treg 和 Th 之间的作用不如二者与 DC 之间的作用稳定。虽然 Treg 在胰腺淋巴结内可以部分抑制活化前的 Th 与 DC 的相互作用，但却无法完全阻断这种作用。实际上，在淋巴结内无论是 Treg 还是 Th 都与 DC 间存在着稳固的相互作用，虽然 Treg 与 Th 相互间的接触并不稳定，但由于 DC 的存在，Treg 与 DC 相互作用，使其活化并分泌可溶性细胞因子，从而发挥抑制功能[40]。
4 抗原特异性 Treg 在临床中的应用前景
4.1 抗原特异性 Treg 与自身免疫性疾病
近几年 Treg 在自身免疫疾病中的作用得到了广泛的重视和研究，Treg 数量的缺乏或者功能的缺乏与人器官特异性自身免疫性疾病的发生相关。在 1 型糖尿病患者中发现，Treg 在外周血中的数量减少[44]，而在另一些研究中发现 1 型糖尿病患者中 Treg 在外周血的数量并没有减少，但是其抑制增殖和炎性细胞因子分泌的功能显著下降[45]。Tang 等[46]首次采用有效方法从 NOD 小鼠中扩增出抗原特异性 Treg，并具有抑制效应 T 细胞增殖的作用。将其回输到 NOD 小鼠体内，能有效地阻止糖尿病的发展，逆转糖尿病并长期维持免疫稳定。Masteller 等[47]研究也显示扩增出的胰岛抗原特异性 Treg 具有免疫抑制功能，与多克隆 Treg 相比具有更好控制 NOD 小鼠糖尿病的作用。Tran 等[48]将 CD4+CD25+ Treg 与 IL-4 和表达 IL5Rα 的自身抗原共培养，诱导抗原特异性 Treg。rIL-5 治疗实验性自身免疫性神经炎能够显著减少临床瘫痪，减轻体质量，减少脱髓鞘以及 CD4+、CD8+ T 细胞和巨噬细胞在神经中的浸润。实验中通过 rIL-5 扩增出自身抗原特异性 Treg，而这些细胞能有效控制自身免疫性疾病。最近有研究报道用自身免疫疾病相关肽结合 MHCⅡ类分子包被的纳米颗粒能够诱导出类似抗原特异性 1 型 Treg，将其回输到不同自身免疫疾病的小鼠模型中，能够抑制自身免疫反应[49]。
4.2 抗原特异性 Treg 与 GVHD
异基因造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）已经被广泛用于治疗恶性和非恶性血液系统疾病，但 GVHD 是 HSCT 的主要障碍，也是移植后主要并发症和死亡原因。GVHD 是由供者 T 细胞特异性识别受者异基因抗原后发生的多阶段病理过程而造成。在鼠类 HSCT 模型中，共移植多克隆扩增 Treg 能够有效减少 GVHD 的发生，促进免疫重建，保留抗肿瘤的活性[50-52]。抗原特异性 Treg 可选择性清除对供者有特异性反应的效应 T 细胞，使对宿主的影响减到最小，促进移植后免疫重建，推测其控制 GVHD 更为有效。而多项实验研究证明体外诱导扩增的抗原特异性 Treg 比多克隆扩增 Treg 能更有效地控制 GVHD 的发生，并保留移植物抗肿瘤效应[53]。Trenado 等[54]将异体抗原特异性 Treg 与多克隆 Treg 相比发现，两种 Treg 都能预防 GVHD，但在接受多克隆 Treg 回输小鼠组中，在脾脏、肺和肝脏中出现 GVHD 病理征兆，而在接受异体抗原特异性 Treg 小鼠中未发现 GVHD 的征兆。因此抗原特异性 Treg 可能更有效地改善 GVHD。Veerapathran 等[55]研究发现，异体抗原特异性 Treg 能够选择性地对异基因抗原作出应答，其作用效率是多克隆 Treg 和新鲜分离 Treg 的 100 倍。抗原特异性 Treg 高表达 Foxp3、Bcl-2、CD62L 以及 CCR7，并且迁移到淋巴组织中。与非特异性 Treg 相比，抗原特异性 Treg 分泌更多的 TGF-β 和 IL-10，表达更多的 CTLA-4，提示用 HLA 不匹配的抗原选择性扩增 Treg 能够有效地预防 GVHD 并保留移植物抗肿瘤效应[55]。但是在 Koenecke 等[56]的研究中，他们的观点与上述报道不尽相同。他们通过 DC 诱导的抗原特异性 Foxp3+ Treg 主要表达 CD62L，在体外具有有效的抑制作用。但是与天然调节性 T 细胞（nature Treg, nTreg）相比，抗原特异性 Foxp3+ Treg 过继治疗并不能预防 GVHD。在体内，回输的抗原特异性 Foxp3+CD4+ Treg 很快转变成 Foxp3-CD4+ T 细胞。因此他们提出在 GVHD 治疗中只能采用 nTreg 的过继治疗，而对抗原特异性 Treg 的使用需要谨慎，诱导的抗原特异性 Treg 的调节表型的稳定性值得关注[56]。
4.3 抗原特异性 Treg 与移植耐受
nTreg 可对自身和非自身抗原进行免疫调节，并广泛运用于诱导移植耐受。有研究小组发现在人源化小鼠模型中输注体外多克隆扩增的 Treg 能通过抑制效应 T 细胞的免疫反应，有效预防异种胰岛移植物的排斥和异种 GVHD，诱导移植物耐受[39]。这些数据证实了 Treg 过继治疗的潜在可能，这种免疫疗法可抑制免疫排斥反应，也能减少免疫抑制剂的使用负担。nTreg 和多克隆活化的 Treg 被广泛应用，但同时他们会导致全身性免疫抑制，增加感染和肿瘤发生的风险。抗原特异性 Treg 能达到有效免疫，同时又能减少免疫抑制剂或多克隆 Treg 带来的副作用。多个实验抑制模型证明供者特异性 Treg 比多克隆 Treg 更有效，能延长移植物存活，诱导耐受。Sagoo 等[57]通过 DC 在体外扩增出异基因抗原特异性人 Treg，共表达 CD69 和 CD71 两种活化表型。在人源化小鼠皮肤移植的异基因免疫损伤模型中，与多克隆 Treg 相比，回输异基因抗原特异性 Treg 能显著减少临床相关的皮肤组织损伤指标，能更有效地保护皮肤移植物不受免疫损伤，诱导移植物耐受。在 Treg 过继治疗后 3 d，不管是抗原特异性 Treg 还是多克隆 Treg 都被招募到皮肤移植物处，但抗原特异性 Treg 的数量大于多克隆 Treg，并在移植处与供者细胞相互作用。实验结果提示供者特异性 Treg 介导的抑制作用发生在异体抗原表达的部位和效应细胞的靶组织处，并可能通过早期的相互作用，影响抗原递呈细胞的功能和效应细胞的募集。Takasato 等[58]研究中发现回输体外扩增的抗原特异性 Treg 至心脏移植的小鼠模型中，能预防心脏移植物排斥反应的发生并能延长移植物存活时间，同时他们证明了在临床细胞治疗中回输体外扩增的抗原特异性 Treg 诱导心脏同种异体移植终生免疫耐受的潜在可能。临床预实验显示人或小鼠抗原特异性 Treg 能从多克隆 Treg 中选择性扩增，而这些抗原特异性 Treg 比多克隆 Treg 在预防移植物排斥和诱导耐受中更为有效[59]。
5 对抗原特异性 Treg 治疗疾病的展望
Treg 是一种重要的具有免疫调节功能的细胞，在体内外得到广泛研究并取得较大进展，但其能否在临床中得以应用仍需进一步研究与改善。例如探寻识别鉴定 Treg 更好的方法，建立更有效的方法来扩增抗原特异性 Treg，检测 Treg 在体内功能的方法需要进一步开发。如何在体内诱导 Treg 以及功能的发挥需要进一步研究，而在体内诱导和扩增抗原特异性 Treg 的研究不多。因此，在体内外诱导扩增抗原特异性 Treg 是治疗自身免疫性疾病和诱导移植耐受的重要目标。
适应性免疫应答是通过识别“自身”和“非己”，有效地排除体内异物抗原，以维持机体对自身抗原的耐受。达到对自身抗原的外周免疫耐受可以通过多种不同的机制，但是主要的途径是通过调节性 T 细胞（regulatory T cell，Treg）对免疫应答的抑制作用[1-2]。Treg 可以通过控制对自身抗原的免疫反应来预防自身免疫性疾病的发生，同时能够抑制免疫系统对外来抗原的应答，从而减少 T 细胞介导的病理性免疫应答。Treg 的免疫抑制机制主要是对 CD4+、CD8+ T 细胞以及 B 细胞的活化反应作出抑制调节。Treg 还能抑制 CD4+CD25-细胞以及树突状细胞（dendritic cell，DC）的活化增殖[3]。Treg 的抑制特性使得其成为免疫治疗的最佳候选方案。大量实验研究证实 Treg 能够控制自身免疫性疾病，诱导移植耐受以及预防移植物抗宿主疾病（graft-versus-host disease，GVHD）[4-6]等。
小鼠模型的相关研究显示多克隆 Treg 能够预防各种自身免疫疾病[7]。体外实验显示 Treg 抑制功能的激活需要通过 T 细胞受体（T cell receptor，TCR）将 Treg 活化，一旦活化，Treg 能够抑制 T 细胞，其抑制作用是非抗原特异性的。有研究分析 Treg 的 TCR，结果显示大部分该群细胞能够识别外周自身抗原[8]。Treg 在广表达外周自身抗原的长期刺激下，形成了 Treg 的广泛抑制作用，而建立抗原特异性免疫应答能够克服这个问题。近年有文献报道 Treg 的功能和器官特异性耐受主要与抗原特异性 Treg 相关[9-10]。首先，早期的 Treg 治疗研究提到 Treg 的体外回输需要扩增大量的多克隆 Treg，并且要在淋巴细胞减少的情况下实施，这样能够驱使回输 Treg 的扩增以及激活抑制能力[11-13]。其次，最近研究报道显示在小鼠异种 GVHD 模型中，抗原特异性 Treg 比多克隆扩增 Treg 能够更有效地控制 GVHD 的发生[14]。这些结果提示抗原特异性是 Treg 发挥其最佳功能的关键，同时也预测有效的 Treg 细胞治疗受益于从多克隆 Treg 中获得能够识别和选择性扩增的器官特异性 Treg。抗原特异性 Treg 的使用可能会避免回输大量多克隆 Treg 带来的副作用，例如肿瘤与感染的发生。本文将对抗原特异性 Treg 的扩增技术、功能、抗原特异性以及 Treg 在临床中的潜在治疗进行综述。
1 抗原特异性 Treg 的体外扩增
在体内回输治疗中如何获得足够数量的 Treg 细胞是早期研究的障碍。在小鼠和人中，CD4+CD25+ Treg 在 CD4+ T 细胞中占 3%～5%[14]，因此有大量实验研究建立了体外扩增多克隆 Treg 的方案[15-16]。体外研究发现 Treg 具有免疫无能性，它对效应 T 细胞的刺激源表现出无应答状态[17]。当经 TCR 介导信号刺激并有高浓度外源性白细胞介素（interleukin，IL）-2 存在的情况下，Treg 细胞可活化并增殖[18]。IL-2 最早被称为 T 细胞生长因子，在体外能够促进 T 细胞的生长和扩增。有研究发现 IL-2 不仅能够增强 Treg 的表型和功能，还可能是 Treg 的生存因子[19]。
Treg 的扩增依赖于 TCR 和 CD28 信号途径[15, 20]。扩增多克隆 Treg 需要外源性添加 IL-2 与通过 TCR 和 CD28 对 Treg 进行刺激。Treg 的扩增方案一般先通过 CD4、CD25 表面分子分选纯化出 Treg，然后用 CD3/CD28 抗体包被磁珠刺激纯化的 Treg，同时添加外源性的高剂量 IL-2[18, 21-22]。Treg 经过扩增后仍然维持其抑制作用，与新鲜分离 Treg 相比，扩增后的 Treg 甚至获得较强的抑制能力。
高效能的抗原特异性 Treg 的应用能够减少 Treg 回输的数量，而目前抗原特异性 Treg 的细胞频率还尚不明确，但似乎与抗原特异性 T 细胞在 CD4+效应细胞中的细胞频率相似[23]。尽管细胞频率很低，抗原特异性 Treg 从多克隆 Treg 中扩增还是能够实现。Peters 等[20]将人 Treg 分别经过 2 轮扩克隆刺激（抗 CD3/CD28 磁珠）和人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）不匹配的异基因外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）刺激联合重组 IL-2 和重组 IL-15 来诱导异基因抗原特异性 Treg。经过 2 轮刺激后，Treg 扩增倍数能够达到 780 倍，并具有抑制功能以及抗原特异性。抗原特异性 Treg 的成功诱导取决于抗原刺激的顺序。当 Treg 先用异基因抗原刺激，后用多克隆刺激，2 轮刺激后可获得大量 Treg 并具有抗原特异性抑制作用。而 Treg 在体外先经过多克隆刺激后，再接受异基因抗原刺激，虽然能够获得大量细胞，抑制作用具有抗原特异性，但是对第三方抗原刺激仍有抑制作用。而在我们的研究中，人的 Treg 在 CD3/CD28 抗体包被磁珠刺激联合雷帕霉素和高剂量 IL-2 在体外培养 1 个周期（7 d），以富集 Treg 数，扩增后的 Treg 再与异种抗原（猪 PBMC）共培养 2 个周期以获得异种抗原特异性 Treg[18, 24]。研究结果显示，Treg 经过 1 个周期异种抗原刺激后，Treg 表型没有发生改变且具有抑制作用，但是扩增倍数只有 14.2 倍，并且没有获得异种抗原特异性。经过 3 个周期异种抗原刺激后，Treg 的异种抗原特异性显著增强，其扩增倍数达到 1 329 倍，但 Treg 抑制能力较第 2 周期时有所下降。经过 2 个周期异种抗原刺激后，Treg 的扩增倍数达到 814 倍，在异种抗原刺激的混合淋巴细胞反应中，异种抗原特异性 Treg 在反应细胞与 Treg 比例为 8∶1、16∶1 和 32∶1 时的抑制率都远高于多克隆 Treg 在相同比例下的抑制率。结果提示异种抗原刺激 2 个周期，Treg 在异种抗原反应中的抑制作用增强，具有异种抗原特异性。
除此之外，也有其他方法用来扩增 Treg。利用异基因 DC 联合 IL-2，能够从多克隆 Treg 中扩增出抗原特异性 Treg，并且能够抑制 CD4+CD25-细胞增殖以及 GVHD 的发生[25]。Litjens 等[26]利用异基因 DC 联合 IL-15 扩增出抗原特异性 Treg。在胰岛表达溶血素的转基因小鼠模型中，DC 细胞能够向多克隆 Treg 递呈胰岛溶血素肽，从而扩增出抗原特异性 Treg，并且具有抑制功能[27]。同时也有大量研究显示，在体外各种条件刺激下能够诱导 CD4+CD25-细胞表达叉头框蛋白 P3（forkhead box P3，Foxp3），从而转变为 Treg[28-29]。Long 等[30]研究报道能够通过谷氨酸脱羧酶、葡糖-6-磷酸催化亚基相关蛋白肽和 1 型糖尿病相关 HLA-DRbeta 等位基因将 CD4+Foxp3- T 细胞诱导成胰岛抗原特异性 Treg。Tu 等[31]报道在没有外源细胞因子的刺激下，将 CD40 活化 B 细胞与 CD4+CD25- T 细胞共培养 3 周后，能诱导出抗原特异性 Treg。这种诱导的异基因抗原特异性 Treg 属于 CD45RO+CCR7-记忆细胞，表达 CD4、CD25、Foxp3 以及 CD62L。尽管 CD4+CD25+Foxp3+抗原特异性 Treg 没有细胞毒性作用，但是他们通过细胞间接触来发挥其抑制功能并依赖于细胞毒 T 淋巴细胞相关抗原 4（cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA-4）。Zheng 等[32]用 CD40 活化 B 细胞诱导和扩增 CD8 Treg，使其具有抗原特异性，其发挥抑制功能依赖于干扰素 γ、IL-2、IL-4 和 CTLA-4。
2 Treg 的抗原特异性
Treg 对器官特异性自身免疫的治疗依赖于 Treg 对相关抗原的识别能力，研究发现 Treg 和 CD4+CD25- T 细胞一样都能表达 TCR 家族多种基因，提示 Treg 能够识别多种抗原[33-34]。在胸腺中发育，Treg 在阳性和阴性选择的亲和范围内对自身抗原作出应答，因此使 Treg 的 TCR 对自身抗原具有高度亲和力[35]。但是近来有研究提出亲和力的重要性[36]，提示嵌合抗原受体在 T 细胞中更重要。一种 Treg 发育模式表明未成熟的胸腺细胞上的 TCR 与特异性的主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）Ⅱ类分子抗原肽复合物结合诱导 Foxp3 表达，这种亲和力的范围在阳性选择和阴性选择之间[36]。分析 Treg 的 TCR 证实与 CD4+CD25-细胞相比，这群细胞对自身抗原具有高度亲和力，而 Treg 的 TCR 与 CD4+CD25-细胞的 TCR 只有小部分的重叠[8]。
抗原特异性 Treg 通过识别靶抗原或表位对治疗自身免疫性疾病有潜在作用。不同自身免疫性疾病的致病抗原被发现，如 1 型糖尿病中的胰岛素和谷氨酸脱羧酶，多发性硬化症的髓磷脂碱基蛋白以及风湿性关节炎中的Ⅱ型胶原等。抗原特异性 Treg 的过继转移治疗能够针对特异性抗原发挥抑制作用，而不影响机体其他免疫功能。非肥胖型糖尿病（non-obese diabetic，NOD）小鼠模型实验数据表明胰岛抗原特异性 Treg 具有抑制功能并且能够控制糖尿病的发生[37]。Karim 等[38]将 CBA 小鼠的 Treg 分离后用供者特异性抗原（B10 小鼠血液）和抗 CD4 单克隆抗体预处理，再与 CD45RBhighCD4+细胞共同回输到 CBA Rag-/- 小鼠，1 d 后将 B10 小鼠的皮肤移植到细胞回输的 CBA Rag-/-小鼠的尾部，结果发现这种方式诱导的抗原特异性 Treg 能够预防供者来源皮肤移植排斥的发生，长达 100 d。为了证明 Treg 的抗原特异性，作者将 CBA 小鼠的 Treg 分离后用第三方来源抗原（BALB/c 小鼠血液）和抗 CD4 单克隆抗体预处理，再与 CD45RBhighCD4+细胞共同回输到 CBA Rag-/-小鼠，1 d 后将 B10 小鼠的皮肤移植到细胞回输的 CBA Rag-/-小鼠的尾部，结果发现诱导的第三方抗原特异性 Treg 不能有效地预防供者来源皮肤移植，B10 小鼠的皮肤在 25 d 被完全排斥。此外，作者用抗 CD4 单克隆抗体和 BALB/c 小鼠血液注射到 CBA 小鼠体内，将 Treg 从该小鼠脾脏中分离同时和 CD45RBhighCD4+细胞回输到 CBA Rag-/-小鼠，1 d 后将 BALB/c 小鼠的皮肤移植到细胞回输的 CBA Rag-/-小鼠的尾部，结果发现 Treg 能够有效防止 BALB/c 小鼠的皮肤移植排斥的发生。但是用 BALB/c 小鼠抗原诱导出的 Treg 并不能阻止 B10 小鼠皮肤移植排斥反应的发生。这些结果提示用抗 CD4 单克隆抗体和供者特异性抗原能够在体内和体外诱导出具有抗原特异性的 Treg，并且能够发挥抗原特异性的抑制作用。
3 抗原特异性 Treg 的抑制机制
目前 Treg 机制的研究有很多，而且对 Treg 抑制免疫应答的机制仍然存在很多争论。我们的体外研究表明抗原特异性 Treg 不仅通过细胞与细胞之间的接触来发挥其抑制作用，还通过细胞因子的分泌来发挥其抑制功能[18, 24]。体外扩增的抗原特异性 Treg 比非特异性 Treg 分泌更多的 IL-10、IL-35 和转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），并且表达更多的 CTLA-4 和可诱导共刺激分子（inducible costimulator，ICOS）[18, 24]，提示这些分子可能与 Treg 免疫调节的增强有关。当在体外培养体系中封闭 IL-10 和 IL-35 后，Treg 保持抑制功能但其功能下降。当用 Transwell 小室将 Treg 与反应细胞分开后，再向该培养体系中加入抗体封闭 IL-10 和 IL-35，则能阻断 Treg 的抑制功能。尽管 Treg 依赖于细胞表面分子 Foxp3 和 CTLA-4 以及表面活化因子 ICOS 和 HLA-DR 发挥抑制作用，但依赖细胞因子的抑制作用仍是其发挥功能的重要机制之一。而在体内，Treg 可能不止通过一种机制来发挥抑制作用。Yi 等[39]的体内研究表明 IL-10 在 Treg 介导的异种抗原免疫应答的抑制作用中扮演着重要的角色。不同机制的发挥可能取决于 Treg 是否抑制自身免疫性疾病的起始应答还是对疾病中活化 T 细胞的控制。局部细胞因子环境或疾病病理环境可能都对 Treg 的抑制功能有影响。
为了更好地了解抗原特异性 Treg 在体内的机制，Tang 等[40]使用双光子扫描显微镜观察淋巴结内 Treg 和糖尿病致病 T 细胞以及 DC 之间的动态变化。当胰岛反应性 T 细胞过继到 CD28 缺陷 NOD 小鼠中，这些辅助性 T 细胞（T helper cell，Th）起初在胰腺淋巴结与 DC 短暂性地相互作用，并且在胰腺淋巴结集结成簇[41-43]，Th 细胞识别 DC 呈递的抗原，形成一个比较稳定的结合状态，促使 T 细胞的活化与增殖。当胰岛抗原特异性 Treg 与胰岛反应性 T 细胞同时过继到 CD28 缺陷 NOD 小鼠中时，在胰腺淋巴结中却表现为不规则和大幅度的运动状态。这表明 Treg 可在胰腺淋巴结内阻止糖尿病致病性 T 细胞与 DC 接触从而抑制其活化。Treg 和 Th 之间的作用不如二者与 DC 之间的作用稳定。虽然 Treg 在胰腺淋巴结内可以部分抑制活化前的 Th 与 DC 的相互作用，但却无法完全阻断这种作用。实际上，在淋巴结内无论是 Treg 还是 Th 都与 DC 间存在着稳固的相互作用，虽然 Treg 与 Th 相互间的接触并不稳定，但由于 DC 的存在，Treg 与 DC 相互作用，使其活化并分泌可溶性细胞因子，从而发挥抑制功能[40]。
4 抗原特异性 Treg 在临床中的应用前景
4.1 抗原特异性 Treg 与自身免疫性疾病
近几年 Treg 在自身免疫疾病中的作用得到了广泛的重视和研究，Treg 数量的缺乏或者功能的缺乏与人器官特异性自身免疫性疾病的发生相关。在 1 型糖尿病患者中发现，Treg 在外周血中的数量减少[44]，而在另一些研究中发现 1 型糖尿病患者中 Treg 在外周血的数量并没有减少，但是其抑制增殖和炎性细胞因子分泌的功能显著下降[45]。Tang 等[46]首次采用有效方法从 NOD 小鼠中扩增出抗原特异性 Treg，并具有抑制效应 T 细胞增殖的作用。将其回输到 NOD 小鼠体内，能有效地阻止糖尿病的发展，逆转糖尿病并长期维持免疫稳定。Masteller 等[47]研究也显示扩增出的胰岛抗原特异性 Treg 具有免疫抑制功能，与多克隆 Treg 相比具有更好控制 NOD 小鼠糖尿病的作用。Tran 等[48]将 CD4+CD25+ Treg 与 IL-4 和表达 IL5Rα 的自身抗原共培养，诱导抗原特异性 Treg。rIL-5 治疗实验性自身免疫性神经炎能够显著减少临床瘫痪，减轻体质量，减少脱髓鞘以及 CD4+、CD8+ T 细胞和巨噬细胞在神经中的浸润。实验中通过 rIL-5 扩增出自身抗原特异性 Treg，而这些细胞能有效控制自身免疫性疾病。最近有研究报道用自身免疫疾病相关肽结合 MHCⅡ类分子包被的纳米颗粒能够诱导出类似抗原特异性 1 型 Treg，将其回输到不同自身免疫疾病的小鼠模型中，能够抑制自身免疫反应[49]。
4.2 抗原特异性 Treg 与 GVHD
异基因造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）已经被广泛用于治疗恶性和非恶性血液系统疾病，但 GVHD 是 HSCT 的主要障碍，也是移植后主要并发症和死亡原因。GVHD 是由供者 T 细胞特异性识别受者异基因抗原后发生的多阶段病理过程而造成。在鼠类 HSCT 模型中，共移植多克隆扩增 Treg 能够有效减少 GVHD 的发生，促进免疫重建，保留抗肿瘤的活性[50-52]。抗原特异性 Treg 可选择性清除对供者有特异性反应的效应 T 细胞，使对宿主的影响减到最小，促进移植后免疫重建，推测其控制 GVHD 更为有效。而多项实验研究证明体外诱导扩增的抗原特异性 Treg 比多克隆扩增 Treg 能更有效地控制 GVHD 的发生，并保留移植物抗肿瘤效应[53]。Trenado 等[54]将异体抗原特异性 Treg 与多克隆 Treg 相比发现，两种 Treg 都能预防 GVHD，但在接受多克隆 Treg 回输小鼠组中，在脾脏、肺和肝脏中出现 GVHD 病理征兆，而在接受异体抗原特异性 Treg 小鼠中未发现 GVHD 的征兆。因此抗原特异性 Treg 可能更有效地改善 GVHD。Veerapathran 等[55]研究发现，异体抗原特异性 Treg 能够选择性地对异基因抗原作出应答，其作用效率是多克隆 Treg 和新鲜分离 Treg 的 100 倍。抗原特异性 Treg 高表达 Foxp3、Bcl-2、CD62L 以及 CCR7，并且迁移到淋巴组织中。与非特异性 Treg 相比，抗原特异性 Treg 分泌更多的 TGF-β 和 IL-10，表达更多的 CTLA-4，提示用 HLA 不匹配的抗原选择性扩增 Treg 能够有效地预防 GVHD 并保留移植物抗肿瘤效应[55]。但是在 Koenecke 等[56]的研究中，他们的观点与上述报道不尽相同。他们通过 DC 诱导的抗原特异性 Foxp3+ Treg 主要表达 CD62L，在体外具有有效的抑制作用。但是与天然调节性 T 细胞（nature Treg, nTreg）相比，抗原特异性 Foxp3+ Treg 过继治疗并不能预防 GVHD。在体内，回输的抗原特异性 Foxp3+CD4+ Treg 很快转变成 Foxp3-CD4+ T 细胞。因此他们提出在 GVHD 治疗中只能采用 nTreg 的过继治疗，而对抗原特异性 Treg 的使用需要谨慎，诱导的抗原特异性 Treg 的调节表型的稳定性值得关注[56]。
4.3 抗原特异性 Treg 与移植耐受
nTreg 可对自身和非自身抗原进行免疫调节，并广泛运用于诱导移植耐受。有研究小组发现在人源化小鼠模型中输注体外多克隆扩增的 Treg 能通过抑制效应 T 细胞的免疫反应，有效预防异种胰岛移植物的排斥和异种 GVHD，诱导移植物耐受[39]。这些数据证实了 Treg 过继治疗的潜在可能，这种免疫疗法可抑制免疫排斥反应，也能减少免疫抑制剂的使用负担。nTreg 和多克隆活化的 Treg 被广泛应用，但同时他们会导致全身性免疫抑制，增加感染和肿瘤发生的风险。抗原特异性 Treg 能达到有效免疫，同时又能减少免疫抑制剂或多克隆 Treg 带来的副作用。多个实验抑制模型证明供者特异性 Treg 比多克隆 Treg 更有效，能延长移植物存活，诱导耐受。Sagoo 等[57]通过 DC 在体外扩增出异基因抗原特异性人 Treg，共表达 CD69 和 CD71 两种活化表型。在人源化小鼠皮肤移植的异基因免疫损伤模型中，与多克隆 Treg 相比，回输异基因抗原特异性 Treg 能显著减少临床相关的皮肤组织损伤指标，能更有效地保护皮肤移植物不受免疫损伤，诱导移植物耐受。在 Treg 过继治疗后 3 d，不管是抗原特异性 Treg 还是多克隆 Treg 都被招募到皮肤移植物处，但抗原特异性 Treg 的数量大于多克隆 Treg，并在移植处与供者细胞相互作用。实验结果提示供者特异性 Treg 介导的抑制作用发生在异体抗原表达的部位和效应细胞的靶组织处，并可能通过早期的相互作用，影响抗原递呈细胞的功能和效应细胞的募集。Takasato 等[58]研究中发现回输体外扩增的抗原特异性 Treg 至心脏移植的小鼠模型中，能预防心脏移植物排斥反应的发生并能延长移植物存活时间，同时他们证明了在临床细胞治疗中回输体外扩增的抗原特异性 Treg 诱导心脏同种异体移植终生免疫耐受的潜在可能。临床预实验显示人或小鼠抗原特异性 Treg 能从多克隆 Treg 中选择性扩增，而这些抗原特异性 Treg 比多克隆 Treg 在预防移植物排斥和诱导耐受中更为有效[59]。
5 对抗原特异性 Treg 治疗疾病的展望
Treg 是一种重要的具有免疫调节功能的细胞，在体内外得到广泛研究并取得较大进展，但其能否在临床中得以应用仍需进一步研究与改善。例如探寻识别鉴定 Treg 更好的方法，建立更有效的方法来扩增抗原特异性 Treg，检测 Treg 在体内功能的方法需要进一步开发。如何在体内诱导 Treg 以及功能的发挥需要进一步研究，而在体内诱导和扩增抗原特异性 Treg 的研究不多。因此，在体内外诱导扩增抗原特异性 Treg 是治疗自身免疫性疾病和诱导移植耐受的重要目标。