引用本文： 孙楠, 韩莉, 沙依拉·海米提, 崔景秋, 王新玲. 显性负效应在不同类型胰岛素病发病机制中的作用. 华西医学, 2018, 33(11): 1406-1410. doi: 10.7507/1002-0179.201809080 复制
胰岛素病是指由胰岛素编码序列中单基因突变所引起的一类常染色体显性遗传性疾病。研究已证实，位于胰岛素基因不同功能位点的突变可导致不同类型的糖尿病和异常胰岛素病[1-3]。不同类型的基因突变导致糖尿病的发病机制不尽相同，部分引起糖尿病的胰岛素基因突变不但会影响突变型胰岛素原的转运和加工，对野生型胰岛素原转运加工为成熟胰岛素的过程也有抑制，即突变型胰岛素原对共存的野生型胰岛素原产生显性负效应，是导致胰岛素缺乏和 β 细胞功能衰竭的原因之一[4-6]。目前尚缺乏胰岛素基因突变导致各种类型糖尿病发病的报道。本研究观察 5 个与人类糖尿病相关的突变型胰岛素原 V（A3）L、C（A7）Y、R（SP6）H、G（B8）S 和 G（C28）R 对共表达的野生型胰岛素原加工分泌的影响，比较显性负效应在不同类型胰岛素病发病中的作用，探讨胰岛素基因突变导致糖尿病的分子机制。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 细胞和重组质粒
293T 细胞由天津市心血管病研究所惠赠，用含 10% 胎牛血清（美国 Gibco 公司）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（高糖）（美国 Gibco 公司）培养。含突变型前胰岛素原的重组质粒 pCMS-EGFP/m-V（A3）L、pCMS-EGFP/m-C（A7）Y、pCMS-EGFP/m-R（SP6）H、pCMS-EGFP/m-G（C28）R、pCMS-EGFP/m-G（B8）S 及含小鼠野生型前胰岛素原互补 DNA（complementary DNA，cDNA）的重组质粒 pCMS-EGFP/m-WT、含人野生型前胰岛素原 cDNA 的重组质粒 pCMS-EGFP/h-WT 均由美国密歇根医学院刘铭教授惠赠。
1.2 主要试剂
脂质体转染试剂盒（美国 Invitrogen 公司）；人胰岛素原放射免疫分析试剂盒（美国 Millipore 公司）；高纯度质粒中量提取试剂盒（德国 Qiagen 公司）；智能放射免疫 γ-测量仪 SN-695 型（上海核所日环光电仪器有限公司）。
1.3 重组质粒转染 293T 细胞
293T 细胞常规培养和传代，采用阳离子脂质体法将含有人野生型前胰岛素原 cDNA 的重组质粒和含有青少年型糖尿病（mutant INS gene-induced diabetes of youth，MIDY）突变型前胰岛素原 cDNA 的重组质粒双质粒共转染转入 293T 细胞，DNA 转染比例均为 1∶2。共设 8 组：① C（A7）Y 组：重组质粒 pCMS-EGFP/m-C（A7）Y 与重组质粒 pCMS-EGFP/h-WT 共转染；② V（A3）L 组：重组质粒 pCMS-EGFP/m-V（A3）L 与重组质粒 pCMS-EGFP/h-WT 共转染；③ G（C28）R 组：重组质粒 pCMS-EGFP/m-G（C28）R 与重组质粒 pCMS-EGFP/h-WT 共转染；④ G（B8）S 组：重组质粒 pCMS-EGFP/m-G（B8）S 与重组质粒 pCMS-EGFP/h-WT 共转染；⑤ R（SP6）H 组：重组质粒 pCMS-EGFP/m-R（SP6）H 与重组质粒 pCMS-EGFP/h-WT 共转染；⑥ 正常对照组（h-WT+m-WT 组）：含有人野生型前胰岛素原 cDNA 的重组质粒 pCMS-EGFP/h-WT 与含有小鼠野生型前胰岛素原 cDNA 的重组质粒 pCMS-EGFP/m-WT 共转染；⑦ 阳性对照组（h-WT+Vector 组）：重组质粒 pCMS-EGFP/h-WT 与 pCMS-EGFP 质粒共转染；⑧ 阴性对照组（m-WT 组）：用重组质粒 pCMS-EGFP/m-WT 转染 293T 细胞作为放射免疫法测定人胰岛素原的阴性对照。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）跟踪转染过程，用 Spot 图像处理系统记录图像。转染 32 h 后更换细胞培养液，继续培养 16 h，分别收集细胞和细胞培养液，置于–80℃ 冻存。
1.4 放射免疫法测定细胞内外人胰岛素原水平
酸乙醇裂解法裂解收集 293T 细胞，用放射免疫法测定转染 48 h 后细胞裂解液及细胞培养液中的人胰岛素原水平。
1.5 统计学方法
采用 SPSS 17.0 软件进行统计分析。数据以均数±标准差表示。多组间实验结果比较采用单因素方差分析，两组间比较采用 LSD 检验（方差齐时）或 Dunnett t 检验（方差不齐时）。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 转染 48 h 后各组 293T 细胞的形态比较
将含有人野生型前胰岛素原 cDNA 的重组质粒和小鼠突变型前胰岛素原 cDNA 的重组质粒共转染 293T 细胞。转染 24 h 后细胞内出现 GFP 颗粒，48 h 后细胞中 GFP 表达呈片状，表明转染成功，且各组荧光强度相似，说明各组转染效率和质粒表达接近（图 1）。
图1
各组重组质粒共转染 48 h 后 293T 细胞（荧光显微镜 ×40）
a. C（A7）Y 组，pCMS-EGFP/m-C（A7）Y 与 pCMS-EGFP/h-WT 共转染；b. V（A3）L 组，pCMS-EGFP/m-V（A3）L 与 pCMS-EGFP/h-WT 共转染；c. G（C28）R 组，pCMS-EGFP/m-G（C28）R 与 pCMS-EGFP/h-WT 共转染；d. G（B8）S 组，pCMS-EGFP/m-G（B8）S 与 pCMS-EGFP/h-WT 共转染；e. R（SP6）H 组，pCMS-EGFP/m-R（SP6）H 与 pCMS-EGFP/h-WT 共转染；f. 正常对照组，pCMS-EGFP/h-WT 与 pCMS-EGFP/m-WT 共转染；g. 阳性对照组，pCMS-EGFP/h-WT 与 pCMS-EGFP 共转染；h. 阴性对照组，pCMS-EGFP/m-WT 转染
2.2 各组共转染细胞内人胰岛素原水平
与正常对照组相比，各组间共转染细胞内人胰岛素原水平差异无统计学意义（F=0.39，P>0.05），突变型胰岛素原未抑制共存的野生型胰岛素原的表达。见表 1。
2.3 各组共转染细胞培养液中人胰岛素原水平
与正常对照组相比，C（A7）Y 组和 G（B8）S 组细胞培养液中人胰岛素原水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.01），其余各组培养液中人胰岛素原水平与正常对照组差异无统计学意义（P>0.05）。C（A7）Y 和 G（B8）S 突变抑制了共表达的人野生型胰岛素原的分泌，V（A3）L、R（SP6）H 和 G（C28）R 突变并未影响共存的人野生型胰岛素原的分泌。见表 1。
表1
各组细胞内及培养液中人胰岛素原水平（n=6，pmol/L，
）
3 讨论
胰岛素病又称为异常胰岛素（原）血症，由胰岛素基因编码突变而引起的胰岛 β 细胞合成分泌活性减弱且结构异常的胰岛素或胰岛素原所致，是特殊类型糖尿病的发病原因之一[2, 4, 7-8]。已报道的可引起单基因突变糖尿病的常染色体显性遗传性胰岛素基因突变有 39 个，分别位于胰岛素基因的信号肽、A 链、B 链、C 肽以及信号肽酶和激素原转换酶蛋白水解剪切位点的编码区。胰岛素病分为经典胰岛素病和 MIDY 两类，经典胰岛素病是指由胰岛素基因突变引起的成年发病的糖尿病（因为此类突变已被发现多年而得名），目前已报道的相关突变有 9 个，包括以往已证实的 7 个突变和新近发现的 2 个前胰岛素原信号肽突变[4, 7]。突变会导致大量胰岛素或胰岛素原分泌入血，引起以高胰岛素血症和胰岛素抵抗为特征的迟发型糖尿病。与经典胰岛素病相比，MIDY 是一种新型单基因突变糖尿病，已报道的基因突变有 30 个，虽然以不伴有 β 细胞自身免疫异常的胰岛素缺乏为主要特征，但其临床表现呈现明显的异质性[6, 8]。
由于胰岛素病临床表现谱广泛，从严重的新生儿糖尿病到温和的迟发型糖尿病均有涉及，提示不同的胰岛素基因突变体等位基因表型不同，并通过不同机制引发糖尿病[1, 4, 9-10]。有学者认为，与 MIDY 相关的基因突变会引起严重的胰岛素原错误折叠，从而导致内质网应激及 β 细胞衰竭；引起成年发病的基因突变可能不会显著影响胰岛素原的折叠、转运和分泌，而主要通过影响胰岛素与胰岛素受体的结合、破坏分泌型前体的加工以及改变蛋白在分泌途径中的储存等机制引起糖尿病。目前胰岛素基因突变导致糖尿病的发病机制尚未完全明确。本研究选取了 5 个具有代表性的突变型胰岛素原：与经典胰岛素病相关的 V（A3）L 突变，与 MIDY 相关的 4 个突变 R（SP6）H、C（A7）Y、G（B8）S 和 G（C28）R，突变氨基酸分别位于前胰岛素原信号肽、A 链、B 链和 C 肽等重要区域，具有不同的生物学特征，通过检测突变型胰岛素原对共表达的人野生型胰岛素原分泌的影响，探讨突变型胰岛素原导致 β 细胞功能衰竭及糖尿病的分子机制。
显性负效应是指基因突变后不仅突变型蛋白自身无功能，还抑制或阻断同一细胞内野生型蛋白的功能和作用，其产生的机制可能与突变型蛋白和野生型蛋白形成无功能的二聚体有关。在胰岛素基因突变所致糖尿病中，C（A7）Y 突变是目前研究较多的突变之一。研究发现，不仅含 C（A7）Y 突变的胰岛素原被阻滞在内质网中不能进一步加工为成熟的胰岛素，而且当胰岛素、C 肽水平明显降低时，虽然新合成的胰岛素原并未显著减少，但野生型胰岛素原也不能被有效转运至下游分泌通路，提示突变型胰岛素原抑制了共表达的野生型胰岛素原的转运和分泌，即突变型对野生型产生了显性负效应，这可能是导致胰岛素缺乏、胰岛 β 细胞功能衰竭的原因之一，但突变型与共存的野生型胰岛素原分子间相互作用的方式尚不清楚[5, 10-13]。那么，与人类糖尿病相关的各个突变型胰岛素原对共存的野生型胰岛素原是否都能产生显性负效应？本研究观察了 5 个不同突变型胰岛素原对共表达的人野生型胰岛素原分泌的影响，发现共转染 48 h 后，各组突变细胞内人胰岛素原水平较正常对照组（小鼠野生型胰岛素原）相比无明显差异，表明突变并未抑制共存的野生型胰岛素基因的表达。进一步比较细胞培养液的人胰岛素原水平，与正常对照组相比，C（A7）Y 组和 G（B8）S 组细胞培养液中人胰岛素原均明显降低，提示这 2 种突变对共存的野生型胰岛素原的分泌产生了抑制，即突变型对共表达的野生型产生了显性负效应，显性负效应是 C（A7）Y 和 G（B8）S 突变引起胰岛素缺乏和糖尿病的分子机制之一 。而可致经典胰岛素病的突变 V（A3）L 和另 2 个 MIDY 突变 R（SP6）H、G（C28）R 对共表达的野生型胰岛素原的分泌无显著影响，提示这 3 种基因突变没有对共存的野生型产生显性负效应，不同突变型胰岛素原引起糖尿病的机制各不相同。
MIDY 突变 C（A7）Y 与 G（B8）S 均可引起永久性新生儿糖尿病（permanent neonatal diabetes mellitus，PNDM），患儿表现为显著的高血糖、糖尿病酮症酸中毒、胰岛素缺乏及免疫抗体阴性，诊断糖尿病后即开始终身使用胰岛素[3, 14]。目前，胰岛素基因突变已被认为是 PNDM 的第二大病因，对 PNDM 患者应尽早开展基因筛查，以便于明确诊断并制定个体化的治疗方案。本研究中，C（A7）Y 突变与 G（B8）S 突变对共表达的野生型胰岛素原具有很强的显性负效应，与以往结论一致。这 2 种突变产生显性负效应的机制推测可能与它们引起胰岛素原分子构型的改变有关[9-10]。众所周知，新合成的胰岛素原必须在内质网中正确折叠，才能被转运至下游分泌通路进一步加工。以往对胰岛素分子构型的研究已证实，C（A7）Y 和 G（B8）S 突变均会影响突变型胰岛素原分子中二硫键的正确配对而导致胰岛素原错误折叠。错误折叠的胰岛素原堆积在内质网中，是导致胰岛素缺乏和 β 细胞功能衰竭的分子基础。而不能正确配对的半胱氨酸残基游离出来，增加了突变型和野生型胰岛素原形成异常蛋白复合物的可能。蛋白复合物被阻滞在内质网中会进一步加重胰岛素缺乏和分泌减少，这可能是突变型胰岛素原产生显性负效应的分子机制，其具体过程尚待进一步研究证实。
本研究中，另 2 个与 MIDY 相关的基因突变 G（C28）R 和 R（SP6）H 对共表达的野生型胰岛素原未呈现明显的显性负效应，推测与突变发生在胰岛素基因的不同功能位点有关。R（S6）H 突变是一个信号肽突变，初次报道患者于 20 岁发病，最初诊断为青少年的成人起病型糖尿病，表现为不依赖胰岛素治疗的温和的轻型糖尿病[4]。由于信号肽在进入内质网的过程中会经蛋白水解作用切除，已有研究证实该突变对胰岛素原折叠构型影响较小。突变型胰岛素原的正确折叠大大减少了其与野生型胰岛素原生成蛋白复合物的可能，提示 R（S6）H 突变存在其他致病机制。近年有学者报道，R（S6）H 突变会改变信号肽氨基末端的电荷，影响蛋白的定位和转位，但其导致糖尿病的发病机制尚需进一步研究[1]。G（C28）R 突变是位于胰岛素原 C 肽区的一个基因突变，最早在诊断为 1 型糖尿病的患者体内发现[6]。尽管它被归为 MIDY 突变，但研究发现，含 G（C28）R 突变的胰岛素原能被进一步加工生成正常的胰岛素，因此推测它引起糖尿病的原因可能与突变型 C 肽的产生有关。本研究未发现此突变会对共存的野生型胰岛素原产生显性负效应，提示此突变存在其他的机制，尚待进一步明确。
V（A3）L 突变是最早被发现的胰岛素编码序列中 7 个引起成人糖尿病的单基因突变之一。以往研究已证实，V（A3）L 突变型胰岛素的结构与野生型胰岛素相同，突变仅引起轻微的热稳定性降低，未损害胰岛素的折叠过程，致病原因可能主要是由于突变型胰岛素与胰岛素受体的结合被破坏，经胰岛素受体介导的对胰岛素的摄取和降解明显减少，使突变型胰岛素分子清除率降低，导致外周血中突变型胰岛素异常增多，形成迟发型高胰岛素血症[7]。本研究中，V（A3）L 突变未影响共表达的野生型胰岛素原的分泌，提示突变没有对共存的野生型产生显性负作用，其致病原因与显性负效应无关。
比较上述 5 个不同特性的突变型胰岛素原对共表达的野生型胰岛素原的影响，不难看出，对胰岛素原形成正确折叠构型影响较大的突变，会对共存的野生型胰岛素原产生显性负效应，这不但加重了胰岛素缺乏，也是突变引发糖尿病的分子基础。显性负效应的发生可能与胰岛素原分子中二硫键的正确配对有关，其机制尚待进一步研究证实。而对胰岛素原正确折叠影响较小的突变，则未见明显的显性负效应现象，存在其他机制。
糖尿病是一种常见的具有遗传倾向的内分泌、代谢性疾病，其病因和发病机制至今尚未完全阐明，对其发病机制深入研究有助于进行分子学诊断和个体化治疗。根据不同突变位点进行有针对性的药物靶向治疗和分子营养学干预，可望成为未来糖尿病防控的发展趋势[15-17]。
胰岛素病是指由胰岛素编码序列中单基因突变所引起的一类常染色体显性遗传性疾病。研究已证实，位于胰岛素基因不同功能位点的突变可导致不同类型的糖尿病和异常胰岛素病[1-3]。不同类型的基因突变导致糖尿病的发病机制不尽相同，部分引起糖尿病的胰岛素基因突变不但会影响突变型胰岛素原的转运和加工，对野生型胰岛素原转运加工为成熟胰岛素的过程也有抑制，即突变型胰岛素原对共存的野生型胰岛素原产生显性负效应，是导致胰岛素缺乏和 β 细胞功能衰竭的原因之一[4-6]。目前尚缺乏胰岛素基因突变导致各种类型糖尿病发病的报道。本研究观察 5 个与人类糖尿病相关的突变型胰岛素原 V（A3）L、C（A7）Y、R（SP6）H、G（B8）S 和 G（C28）R 对共表达的野生型胰岛素原加工分泌的影响，比较显性负效应在不同类型胰岛素病发病中的作用，探讨胰岛素基因突变导致糖尿病的分子机制。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 细胞和重组质粒
293T 细胞由天津市心血管病研究所惠赠，用含 10% 胎牛血清（美国 Gibco 公司）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（高糖）（美国 Gibco 公司）培养。含突变型前胰岛素原的重组质粒 pCMS-EGFP/m-V（A3）L、pCMS-EGFP/m-C（A7）Y、pCMS-EGFP/m-R（SP6）H、pCMS-EGFP/m-G（C28）R、pCMS-EGFP/m-G（B8）S 及含小鼠野生型前胰岛素原互补 DNA（complementary DNA，cDNA）的重组质粒 pCMS-EGFP/m-WT、含人野生型前胰岛素原 cDNA 的重组质粒 pCMS-EGFP/h-WT 均由美国密歇根医学院刘铭教授惠赠。
1.2 主要试剂
脂质体转染试剂盒（美国 Invitrogen 公司）；人胰岛素原放射免疫分析试剂盒（美国 Millipore 公司）；高纯度质粒中量提取试剂盒（德国 Qiagen 公司）；智能放射免疫 γ-测量仪 SN-695 型（上海核所日环光电仪器有限公司）。
1.3 重组质粒转染 293T 细胞
293T 细胞常规培养和传代，采用阳离子脂质体法将含有人野生型前胰岛素原 cDNA 的重组质粒和含有青少年型糖尿病（mutant INS gene-induced diabetes of youth，MIDY）突变型前胰岛素原 cDNA 的重组质粒双质粒共转染转入 293T 细胞，DNA 转染比例均为 1∶2。共设 8 组：① C（A7）Y 组：重组质粒 pCMS-EGFP/m-C（A7）Y 与重组质粒 pCMS-EGFP/h-WT 共转染；② V（A3）L 组：重组质粒 pCMS-EGFP/m-V（A3）L 与重组质粒 pCMS-EGFP/h-WT 共转染；③ G（C28）R 组：重组质粒 pCMS-EGFP/m-G（C28）R 与重组质粒 pCMS-EGFP/h-WT 共转染；④ G（B8）S 组：重组质粒 pCMS-EGFP/m-G（B8）S 与重组质粒 pCMS-EGFP/h-WT 共转染；⑤ R（SP6）H 组：重组质粒 pCMS-EGFP/m-R（SP6）H 与重组质粒 pCMS-EGFP/h-WT 共转染；⑥ 正常对照组（h-WT+m-WT 组）：含有人野生型前胰岛素原 cDNA 的重组质粒 pCMS-EGFP/h-WT 与含有小鼠野生型前胰岛素原 cDNA 的重组质粒 pCMS-EGFP/m-WT 共转染；⑦ 阳性对照组（h-WT+Vector 组）：重组质粒 pCMS-EGFP/h-WT 与 pCMS-EGFP 质粒共转染；⑧ 阴性对照组（m-WT 组）：用重组质粒 pCMS-EGFP/m-WT 转染 293T 细胞作为放射免疫法测定人胰岛素原的阴性对照。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）跟踪转染过程，用 Spot 图像处理系统记录图像。转染 32 h 后更换细胞培养液，继续培养 16 h，分别收集细胞和细胞培养液，置于–80℃ 冻存。
1.4 放射免疫法测定细胞内外人胰岛素原水平
酸乙醇裂解法裂解收集 293T 细胞，用放射免疫法测定转染 48 h 后细胞裂解液及细胞培养液中的人胰岛素原水平。
1.5 统计学方法
采用 SPSS 17.0 软件进行统计分析。数据以均数±标准差表示。多组间实验结果比较采用单因素方差分析，两组间比较采用 LSD 检验（方差齐时）或 Dunnett t 检验（方差不齐时）。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 转染 48 h 后各组 293T 细胞的形态比较
将含有人野生型前胰岛素原 cDNA 的重组质粒和小鼠突变型前胰岛素原 cDNA 的重组质粒共转染 293T 细胞。转染 24 h 后细胞内出现 GFP 颗粒，48 h 后细胞中 GFP 表达呈片状，表明转染成功，且各组荧光强度相似，说明各组转染效率和质粒表达接近（图 1）。
图1
各组重组质粒共转染 48 h 后 293T 细胞（荧光显微镜 ×40）
a. C（A7）Y 组，pCMS-EGFP/m-C（A7）Y 与 pCMS-EGFP/h-WT 共转染；b. V（A3）L 组，pCMS-EGFP/m-V（A3）L 与 pCMS-EGFP/h-WT 共转染；c. G（C28）R 组，pCMS-EGFP/m-G（C28）R 与 pCMS-EGFP/h-WT 共转染；d. G（B8）S 组，pCMS-EGFP/m-G（B8）S 与 pCMS-EGFP/h-WT 共转染；e. R（SP6）H 组，pCMS-EGFP/m-R（SP6）H 与 pCMS-EGFP/h-WT 共转染；f. 正常对照组，pCMS-EGFP/h-WT 与 pCMS-EGFP/m-WT 共转染；g. 阳性对照组，pCMS-EGFP/h-WT 与 pCMS-EGFP 共转染；h. 阴性对照组，pCMS-EGFP/m-WT 转染
2.2 各组共转染细胞内人胰岛素原水平
与正常对照组相比，各组间共转染细胞内人胰岛素原水平差异无统计学意义（F=0.39，P>0.05），突变型胰岛素原未抑制共存的野生型胰岛素原的表达。见表 1。
2.3 各组共转染细胞培养液中人胰岛素原水平
与正常对照组相比，C（A7）Y 组和 G（B8）S 组细胞培养液中人胰岛素原水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.01），其余各组培养液中人胰岛素原水平与正常对照组差异无统计学意义（P>0.05）。C（A7）Y 和 G（B8）S 突变抑制了共表达的人野生型胰岛素原的分泌，V（A3）L、R（SP6）H 和 G（C28）R 突变并未影响共存的人野生型胰岛素原的分泌。见表 1。
表1
各组细胞内及培养液中人胰岛素原水平（n=6，pmol/L，
）
3 讨论
胰岛素病又称为异常胰岛素（原）血症，由胰岛素基因编码突变而引起的胰岛 β 细胞合成分泌活性减弱且结构异常的胰岛素或胰岛素原所致，是特殊类型糖尿病的发病原因之一[2, 4, 7-8]。已报道的可引起单基因突变糖尿病的常染色体显性遗传性胰岛素基因突变有 39 个，分别位于胰岛素基因的信号肽、A 链、B 链、C 肽以及信号肽酶和激素原转换酶蛋白水解剪切位点的编码区。胰岛素病分为经典胰岛素病和 MIDY 两类，经典胰岛素病是指由胰岛素基因突变引起的成年发病的糖尿病（因为此类突变已被发现多年而得名），目前已报道的相关突变有 9 个，包括以往已证实的 7 个突变和新近发现的 2 个前胰岛素原信号肽突变[4, 7]。突变会导致大量胰岛素或胰岛素原分泌入血，引起以高胰岛素血症和胰岛素抵抗为特征的迟发型糖尿病。与经典胰岛素病相比，MIDY 是一种新型单基因突变糖尿病，已报道的基因突变有 30 个，虽然以不伴有 β 细胞自身免疫异常的胰岛素缺乏为主要特征，但其临床表现呈现明显的异质性[6, 8]。
由于胰岛素病临床表现谱广泛，从严重的新生儿糖尿病到温和的迟发型糖尿病均有涉及，提示不同的胰岛素基因突变体等位基因表型不同，并通过不同机制引发糖尿病[1, 4, 9-10]。有学者认为，与 MIDY 相关的基因突变会引起严重的胰岛素原错误折叠，从而导致内质网应激及 β 细胞衰竭；引起成年发病的基因突变可能不会显著影响胰岛素原的折叠、转运和分泌，而主要通过影响胰岛素与胰岛素受体的结合、破坏分泌型前体的加工以及改变蛋白在分泌途径中的储存等机制引起糖尿病。目前胰岛素基因突变导致糖尿病的发病机制尚未完全明确。本研究选取了 5 个具有代表性的突变型胰岛素原：与经典胰岛素病相关的 V（A3）L 突变，与 MIDY 相关的 4 个突变 R（SP6）H、C（A7）Y、G（B8）S 和 G（C28）R，突变氨基酸分别位于前胰岛素原信号肽、A 链、B 链和 C 肽等重要区域，具有不同的生物学特征，通过检测突变型胰岛素原对共表达的人野生型胰岛素原分泌的影响，探讨突变型胰岛素原导致 β 细胞功能衰竭及糖尿病的分子机制。
显性负效应是指基因突变后不仅突变型蛋白自身无功能，还抑制或阻断同一细胞内野生型蛋白的功能和作用，其产生的机制可能与突变型蛋白和野生型蛋白形成无功能的二聚体有关。在胰岛素基因突变所致糖尿病中，C（A7）Y 突变是目前研究较多的突变之一。研究发现，不仅含 C（A7）Y 突变的胰岛素原被阻滞在内质网中不能进一步加工为成熟的胰岛素，而且当胰岛素、C 肽水平明显降低时，虽然新合成的胰岛素原并未显著减少，但野生型胰岛素原也不能被有效转运至下游分泌通路，提示突变型胰岛素原抑制了共表达的野生型胰岛素原的转运和分泌，即突变型对野生型产生了显性负效应，这可能是导致胰岛素缺乏、胰岛 β 细胞功能衰竭的原因之一，但突变型与共存的野生型胰岛素原分子间相互作用的方式尚不清楚[5, 10-13]。那么，与人类糖尿病相关的各个突变型胰岛素原对共存的野生型胰岛素原是否都能产生显性负效应？本研究观察了 5 个不同突变型胰岛素原对共表达的人野生型胰岛素原分泌的影响，发现共转染 48 h 后，各组突变细胞内人胰岛素原水平较正常对照组（小鼠野生型胰岛素原）相比无明显差异，表明突变并未抑制共存的野生型胰岛素基因的表达。进一步比较细胞培养液的人胰岛素原水平，与正常对照组相比，C（A7）Y 组和 G（B8）S 组细胞培养液中人胰岛素原均明显降低，提示这 2 种突变对共存的野生型胰岛素原的分泌产生了抑制，即突变型对共表达的野生型产生了显性负效应，显性负效应是 C（A7）Y 和 G（B8）S 突变引起胰岛素缺乏和糖尿病的分子机制之一 。而可致经典胰岛素病的突变 V（A3）L 和另 2 个 MIDY 突变 R（SP6）H、G（C28）R 对共表达的野生型胰岛素原的分泌无显著影响，提示这 3 种基因突变没有对共存的野生型产生显性负效应，不同突变型胰岛素原引起糖尿病的机制各不相同。
MIDY 突变 C（A7）Y 与 G（B8）S 均可引起永久性新生儿糖尿病（permanent neonatal diabetes mellitus，PNDM），患儿表现为显著的高血糖、糖尿病酮症酸中毒、胰岛素缺乏及免疫抗体阴性，诊断糖尿病后即开始终身使用胰岛素[3, 14]。目前，胰岛素基因突变已被认为是 PNDM 的第二大病因，对 PNDM 患者应尽早开展基因筛查，以便于明确诊断并制定个体化的治疗方案。本研究中，C（A7）Y 突变与 G（B8）S 突变对共表达的野生型胰岛素原具有很强的显性负效应，与以往结论一致。这 2 种突变产生显性负效应的机制推测可能与它们引起胰岛素原分子构型的改变有关[9-10]。众所周知，新合成的胰岛素原必须在内质网中正确折叠，才能被转运至下游分泌通路进一步加工。以往对胰岛素分子构型的研究已证实，C（A7）Y 和 G（B8）S 突变均会影响突变型胰岛素原分子中二硫键的正确配对而导致胰岛素原错误折叠。错误折叠的胰岛素原堆积在内质网中，是导致胰岛素缺乏和 β 细胞功能衰竭的分子基础。而不能正确配对的半胱氨酸残基游离出来，增加了突变型和野生型胰岛素原形成异常蛋白复合物的可能。蛋白复合物被阻滞在内质网中会进一步加重胰岛素缺乏和分泌减少，这可能是突变型胰岛素原产生显性负效应的分子机制，其具体过程尚待进一步研究证实。
本研究中，另 2 个与 MIDY 相关的基因突变 G（C28）R 和 R（SP6）H 对共表达的野生型胰岛素原未呈现明显的显性负效应，推测与突变发生在胰岛素基因的不同功能位点有关。R（S6）H 突变是一个信号肽突变，初次报道患者于 20 岁发病，最初诊断为青少年的成人起病型糖尿病，表现为不依赖胰岛素治疗的温和的轻型糖尿病[4]。由于信号肽在进入内质网的过程中会经蛋白水解作用切除，已有研究证实该突变对胰岛素原折叠构型影响较小。突变型胰岛素原的正确折叠大大减少了其与野生型胰岛素原生成蛋白复合物的可能，提示 R（S6）H 突变存在其他致病机制。近年有学者报道，R（S6）H 突变会改变信号肽氨基末端的电荷，影响蛋白的定位和转位，但其导致糖尿病的发病机制尚需进一步研究[1]。G（C28）R 突变是位于胰岛素原 C 肽区的一个基因突变，最早在诊断为 1 型糖尿病的患者体内发现[6]。尽管它被归为 MIDY 突变，但研究发现，含 G（C28）R 突变的胰岛素原能被进一步加工生成正常的胰岛素，因此推测它引起糖尿病的原因可能与突变型 C 肽的产生有关。本研究未发现此突变会对共存的野生型胰岛素原产生显性负效应，提示此突变存在其他的机制，尚待进一步明确。
V（A3）L 突变是最早被发现的胰岛素编码序列中 7 个引起成人糖尿病的单基因突变之一。以往研究已证实，V（A3）L 突变型胰岛素的结构与野生型胰岛素相同，突变仅引起轻微的热稳定性降低，未损害胰岛素的折叠过程，致病原因可能主要是由于突变型胰岛素与胰岛素受体的结合被破坏，经胰岛素受体介导的对胰岛素的摄取和降解明显减少，使突变型胰岛素分子清除率降低，导致外周血中突变型胰岛素异常增多，形成迟发型高胰岛素血症[7]。本研究中，V（A3）L 突变未影响共表达的野生型胰岛素原的分泌，提示突变没有对共存的野生型产生显性负作用，其致病原因与显性负效应无关。
比较上述 5 个不同特性的突变型胰岛素原对共表达的野生型胰岛素原的影响，不难看出，对胰岛素原形成正确折叠构型影响较大的突变，会对共存的野生型胰岛素原产生显性负效应，这不但加重了胰岛素缺乏，也是突变引发糖尿病的分子基础。显性负效应的发生可能与胰岛素原分子中二硫键的正确配对有关，其机制尚待进一步研究证实。而对胰岛素原正确折叠影响较小的突变，则未见明显的显性负效应现象，存在其他机制。
糖尿病是一种常见的具有遗传倾向的内分泌、代谢性疾病，其病因和发病机制至今尚未完全阐明，对其发病机制深入研究有助于进行分子学诊断和个体化治疗。根据不同突变位点进行有针对性的药物靶向治疗和分子营养学干预，可望成为未来糖尿病防控的发展趋势[15-17]。
