引用本文： 李伟, 张咪娟, 王琰, 王涛, 马敏江, 田春娥, 杨谦, 陈瑞利. 血小板活化因子和血管内皮活性标志物与腔隙性脑梗死的关系. 华西医学, 2019, 34(10): 1143-1147. doi: 10.7507/1002-0179.201908056 复制
腔隙性脑梗死（lacunar infarction，LI）是脑部深穿支动脉的缺血性梗死，其梗死灶直径为 2～20 mm，约占脑梗死的 25%[1-2]。近年来，国外研究表明内皮功能障碍和血小板活化表达增加与 LI 有一定关系[3-4]。关于血小板活化与 LI 关系的研究较少且结论不一致。血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 属于整合素家族受体，激活血小板后，通过 G 蛋白偶联信号途径使血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受体激活，受体结合位点暴露后，与血管性假血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、纤维蛋白原等结合，促使血小板聚集，导致血小板进一步活化[5]。P 选择素是血小板活化后释放的重要物质，可反映血小板活化程度，是血管损伤和血小板活化的标志物[6]。因此，我们可分析血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受体和 P 选择素的变化来了解血小板的活化状况。脑小血管内皮功能障碍可能会导致脑深部小的梗死，原因有血管完整性破坏、脑血流的减少、脑血流自动调节功能障碍或血细胞某些成分的改变[7]。故本研究检测入组时健康对照组和 LI 事件后 1 个月时及 3 个月时患者血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受体、P 选择素、vWF、同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）和高敏 C 反应蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hsCRP）浓度，探讨血小板活化和血管内皮功能与 LI 的关系。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象
经陕西省人民医院医学伦理委员会审批通过，前瞻性纳入 2018 年 3 月—2019 年 2 月在陕西省人民医院神经内科住院治疗行颅脑 MRI 检查确诊为 LI 的患者 100 例（LI 组），其中男 65 例，女 35 例。并收集同一时期在该院体检中心进行体检，与患者年龄（±5 岁）、性别相匹配且颅脑 MRI 检查正常的健康者 100 例作为对照组。
LI 组患者纳入标准：① 年龄≥18 岁；②发病 1 个月以内入院；③ LI 在 MRI 检查上的诊断标准如下：表现为圆或椭圆形，直径 3～15 mm，在 MRI T1 加权像呈边界清楚的低信号灶，T2 加权像高信号，液体衰减反转恢复序列高信号，扩散加权成像上呈高信号[8]；④ 患者在参加研究前签署知情同意书。
对照组纳入标准：① 年龄≥18 岁；② 同一时期在该院体检中心，与患者年龄（±5 岁）、性别相匹配且颅脑 MRI 检查正常者；③ 签署知情同意书。
两组排除标准：① 心源性栓塞、动脉夹层或动脉粥样硬化导致的脑梗死；② 既往有炎症性疾病、甲状腺疾病、自身免疫疾病、血液疾病、恶性肿瘤病史或近期有感染等疾病；③ 既往有脑梗死病史；④ 影像学检查发现蛛网膜下腔出血、脑出血等出血性疾病；⑤ 严重神经系统疾病。
1.2 资料收集
收集所有入组者的资料，包括年龄、性别、既往史（高血压、糖尿病、冠心病、吸烟及饮酒史）、实验室检查、卒中病情严重程度［由经统一培训的神经内科医师采用美国国立卫生研究院卒中量表（National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）评价患者发病 1 个月内和 3 个月时的神经功能缺损程度］、发病至入院时间、头颅 MRI 特征（由 2 位具有高级职称的神经科医师独立分析患者头颅 MRI，如有分歧，由第 3 位神经科医生协商解决）和治疗药物等。
1.3 血液采集
收集 LI 患者发病后 1 个月及 3 个月和对照组入组时的血标本，采集血液标本前需完全禁食 8 h，并于次日清晨由专业的神经内科护士采集肘部静脉血标本，血标本收集并储存在–80℃ 的冰箱内，2 h 内送至实验室。
1.3.1 血小板活化因子
采用同轴圆桶剪切仪检测剪切诱导血小板聚集，剪切率为 4 000 s−1。血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受体和 P 选择素的测定使用 FACS Vantage 流式细胞仪进行检测（间接荧光免疫法），试剂盒用美国 B-D 公司提供，原理是荧光标记血小板产生的平均荧光强度与血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受体、P 选择素之间位点数呈正比，单位为%。
1.3.2 血管内皮活性标志物
vWF：采用酶联免疫法检测，试剂盒由福建太阳生物技术公司生产，单位为 ng/mL。hsCRP：采用颗粒增强胶乳免疫比浊法检测，选择申能德赛公司生产的 hsCRP 试剂，单位为 mg/L。HCY：采用循环酶法检测，试剂盒来自北京九强生物技术有限公司，单位为 mmol/L。
1.4 统计学方法
应用 SPSS 25.0 软件进行统计学分析。分类变量使用例数（百分比）表示，组间比较采用 χ2 检验；用均数±标准差表示符合正态分布的连续性变量，组间比较采用两独立样本 t 检验；用中位数（四分位数间距）表示不符合正态分布的连续变量。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 纳入研究对象的主要特点
LI 组和对照组年龄、性别匹配，在高血压、糖尿病和冠心病病史以及吸烟史和饮酒史上差异无统计学意义（P>0.05）。LI 组血脂异常发生率高于对照组（P<0.001）。所有 LI 患者入院后均采用抗血小板药物治疗，81 例患者采用阿司匹林（100 mg/d）治疗，其余 19 例患者采用氯吡格雷（75 mg/d）治疗。LI 发生后 1 个月左右时抽取血液标本（抽血时间为 LI 发生后 26～32 d，中位时间 30 d）。见表1。
表1
纳入研究对象的主要特点（n=100）
2.2 所有LI组患者与对照组各项指标比较
LI 组患者和对照组血小板聚集的差异无统计学意义（P=0.061）。血小板活化因子在 LI 组和对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）。而 LI 组内皮细胞活化标志物均较对照组明显增加（P<0.001）。见表2。
表2
所有LI组患者与对照组各项指标比较（n=100，
±s）
2.3 发病1个月和3个月时LI组患者各项指标比较
3 个月时有 6 例患者失访，我们对余下的 94 例患者再次采集血液标本，采集血液标本的时间为发病后 83～97 d，中位时间 91 d。与发病 1 个月时的 100 例患者比较，发病 3 个月时 94 例患者 vWF 和 hsCRP 水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；而发病 3 个月时 HCY 和血小板活化因子较发病 1 个月时差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。
表3
发病1个月时和3个月时LI组患者各项指标比较（
±s）
3 讨论
本研究探索了血小板活化因子和血管内皮活性标志物与 LI 的关系，排除年龄、性别、高血压、糖尿病和冠心病对研究的影响。结果显示，与对照组相比，LI 组患者血小板活化参数差异无统计学意义，而内皮功能障碍的参数差异有统计学意义，提示内皮损伤可能是 LI 的病理学机制之一。这与国外 Lavallée 等[4]和 Oksala 等[9]的研究结果基本一致。最近的一项研究纳入 2 型糖尿病合并微血管病变的患者和健康对照组，结果显示患者 vWF 表达水平高于对照组［（196.59±80.32）% vs.（148.06±90.34）%，P=0.04］；患者血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受体表达水平明显高于对照组［（3.91±2.91）% vs.（2.79±2.51）%，P=0.002］[10]，表明了 vWF 和血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受体的表达参与血管病变的发生和发展。国内许海霞等[11]研究发现，脑小血管病患者血小板活性因子表达水平较对照组高，提示血小板功能活跃和内皮细胞损伤是导致脑小血管病的病理学机制之一；但将脑小血管病根据影像学分组后发现，分级程度高的患者血小板活性因子表达水平不一定高，两者无明显正相关。其与本研究观察的血小板活化因子不同，可能是两个研究结果差异的原因。
本研究发现 LI 组患者血小板活化参数在 1 个月和 3 个月时均无明显改变。而在急性脑卒中的研究中，血小板活性因子不能预测患者长期生存[12]。因此我们认为慢性血小板活化可能在 LI 的发病机制中不发挥核心作用。
血管内皮活性因子 vWF、hsCPR 及 HCY 表达水平在 LI 组患者中升高，而 3 个月时有所下降，但仍高于正常，表明内皮功能的障碍可能与 LI 相关。动物实验发现，C反应蛋白 水平升高与内皮功能障碍有关，主要机制为 C 反应蛋白抑制血管内皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS），而一氧化氮介导的血管舒张需要 eNOS 的参与，故研究者认为 CRP 可能是加重内皮功能障碍的关键分子[13]。一项大型研究发现，对于 LI 患者，hsCRP 水平可预测卒中复发的风险[14]。Woywodt 等[15]发现，与动脉粥样硬化型、心源型脑梗死相似，LI 患者循环内皮细胞增加，推测循环内皮细胞是脑卒中内皮损伤和/或修复的标志物。Fan 等[16]研究发现血清 HCY 可能是急性 LI 患者的独立危险因素，而不是早期预后的预测因素结果。本研究中血清 HCY 在 LI 患者中升高，但在 3 个月时基本恢复正常。一项对 121 例患者进行 TOAST 分型的试验发现，LI 患者 HCY、hsCRP、白细胞介素 6、基质金属蛋白酶 9 水平均升高（P<0.05），提示炎症反应在卒中发病机制中的重要作用[17]。一项 meta 研究纳入 42 篇文献，包括 4 186 例脑梗死，其中有 2 196 例 LI 患者和 2 500 例非卒中对照者，发现了 LI 患者内皮功能障碍标志物（HCY、vWF）明显高于非 LI 者；与其他脑梗死亚型相比，HCY 水平在 LI 中没有差异，而 vWF 在 LI 中显著降低；炎性标志物（C 反应蛋白）在 LI 患者与非 LI 相比更高，而与其他脑梗死亚型相比，则没有差异[18]。该研究表明 LI 患者这些因子升高可能反映卒中的发生过程，而不是 LI 特有的全身性炎症或内皮功能障碍，故炎症过程和内皮功能障碍可能在 LI 发展中有一定的作用，与本研究的结果一致。
综上，与对照组相比，慢性血小板活化可能在 LI 病理生理学中不发挥核心作用，内皮功能障碍可能是 LI 的病理机制之一。下一步还需增加检测的时间点和延长研究的时间跨度，有必要采用多中心、不同种族的合作研究模式，以提供更可靠的 LI 病理学证据。
腔隙性脑梗死（lacunar infarction，LI）是脑部深穿支动脉的缺血性梗死，其梗死灶直径为 2～20 mm，约占脑梗死的 25%[1-2]。近年来，国外研究表明内皮功能障碍和血小板活化表达增加与 LI 有一定关系[3-4]。关于血小板活化与 LI 关系的研究较少且结论不一致。血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 属于整合素家族受体，激活血小板后，通过 G 蛋白偶联信号途径使血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受体激活，受体结合位点暴露后，与血管性假血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、纤维蛋白原等结合，促使血小板聚集，导致血小板进一步活化[5]。P 选择素是血小板活化后释放的重要物质，可反映血小板活化程度，是血管损伤和血小板活化的标志物[6]。因此，我们可分析血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受体和 P 选择素的变化来了解血小板的活化状况。脑小血管内皮功能障碍可能会导致脑深部小的梗死，原因有血管完整性破坏、脑血流的减少、脑血流自动调节功能障碍或血细胞某些成分的改变[7]。故本研究检测入组时健康对照组和 LI 事件后 1 个月时及 3 个月时患者血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受体、P 选择素、vWF、同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）和高敏 C 反应蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hsCRP）浓度，探讨血小板活化和血管内皮功能与 LI 的关系。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象
经陕西省人民医院医学伦理委员会审批通过，前瞻性纳入 2018 年 3 月—2019 年 2 月在陕西省人民医院神经内科住院治疗行颅脑 MRI 检查确诊为 LI 的患者 100 例（LI 组），其中男 65 例，女 35 例。并收集同一时期在该院体检中心进行体检，与患者年龄（±5 岁）、性别相匹配且颅脑 MRI 检查正常的健康者 100 例作为对照组。
LI 组患者纳入标准：① 年龄≥18 岁；②发病 1 个月以内入院；③ LI 在 MRI 检查上的诊断标准如下：表现为圆或椭圆形，直径 3～15 mm，在 MRI T1 加权像呈边界清楚的低信号灶，T2 加权像高信号，液体衰减反转恢复序列高信号，扩散加权成像上呈高信号[8]；④ 患者在参加研究前签署知情同意书。
对照组纳入标准：① 年龄≥18 岁；② 同一时期在该院体检中心，与患者年龄（±5 岁）、性别相匹配且颅脑 MRI 检查正常者；③ 签署知情同意书。
两组排除标准：① 心源性栓塞、动脉夹层或动脉粥样硬化导致的脑梗死；② 既往有炎症性疾病、甲状腺疾病、自身免疫疾病、血液疾病、恶性肿瘤病史或近期有感染等疾病；③ 既往有脑梗死病史；④ 影像学检查发现蛛网膜下腔出血、脑出血等出血性疾病；⑤ 严重神经系统疾病。
1.2 资料收集
收集所有入组者的资料，包括年龄、性别、既往史（高血压、糖尿病、冠心病、吸烟及饮酒史）、实验室检查、卒中病情严重程度［由经统一培训的神经内科医师采用美国国立卫生研究院卒中量表（National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）评价患者发病 1 个月内和 3 个月时的神经功能缺损程度］、发病至入院时间、头颅 MRI 特征（由 2 位具有高级职称的神经科医师独立分析患者头颅 MRI，如有分歧，由第 3 位神经科医生协商解决）和治疗药物等。
1.3 血液采集
收集 LI 患者发病后 1 个月及 3 个月和对照组入组时的血标本，采集血液标本前需完全禁食 8 h，并于次日清晨由专业的神经内科护士采集肘部静脉血标本，血标本收集并储存在–80℃ 的冰箱内，2 h 内送至实验室。
1.3.1 血小板活化因子
采用同轴圆桶剪切仪检测剪切诱导血小板聚集，剪切率为 4 000 s−1。血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受体和 P 选择素的测定使用 FACS Vantage 流式细胞仪进行检测（间接荧光免疫法），试剂盒用美国 B-D 公司提供，原理是荧光标记血小板产生的平均荧光强度与血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受体、P 选择素之间位点数呈正比，单位为%。
1.3.2 血管内皮活性标志物
vWF：采用酶联免疫法检测，试剂盒由福建太阳生物技术公司生产，单位为 ng/mL。hsCRP：采用颗粒增强胶乳免疫比浊法检测，选择申能德赛公司生产的 hsCRP 试剂，单位为 mg/L。HCY：采用循环酶法检测，试剂盒来自北京九强生物技术有限公司，单位为 mmol/L。
1.4 统计学方法
应用 SPSS 25.0 软件进行统计学分析。分类变量使用例数（百分比）表示，组间比较采用 χ2 检验；用均数±标准差表示符合正态分布的连续性变量，组间比较采用两独立样本 t 检验；用中位数（四分位数间距）表示不符合正态分布的连续变量。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 纳入研究对象的主要特点
LI 组和对照组年龄、性别匹配，在高血压、糖尿病和冠心病病史以及吸烟史和饮酒史上差异无统计学意义（P>0.05）。LI 组血脂异常发生率高于对照组（P<0.001）。所有 LI 患者入院后均采用抗血小板药物治疗，81 例患者采用阿司匹林（100 mg/d）治疗，其余 19 例患者采用氯吡格雷（75 mg/d）治疗。LI 发生后 1 个月左右时抽取血液标本（抽血时间为 LI 发生后 26～32 d，中位时间 30 d）。见表1。
表1
纳入研究对象的主要特点（n=100）
2.2 所有LI组患者与对照组各项指标比较
LI 组患者和对照组血小板聚集的差异无统计学意义（P=0.061）。血小板活化因子在 LI 组和对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）。而 LI 组内皮细胞活化标志物均较对照组明显增加（P<0.001）。见表2。
表2
所有LI组患者与对照组各项指标比较（n=100，±s）
2.3 发病1个月和3个月时LI组患者各项指标比较
3 个月时有 6 例患者失访，我们对余下的 94 例患者再次采集血液标本，采集血液标本的时间为发病后 83～97 d，中位时间 91 d。与发病 1 个月时的 100 例患者比较，发病 3 个月时 94 例患者 vWF 和 hsCRP 水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；而发病 3 个月时 HCY 和血小板活化因子较发病 1 个月时差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。
表3
发病1个月时和3个月时LI组患者各项指标比较（±s）
3 讨论
本研究探索了血小板活化因子和血管内皮活性标志物与 LI 的关系，排除年龄、性别、高血压、糖尿病和冠心病对研究的影响。结果显示，与对照组相比，LI 组患者血小板活化参数差异无统计学意义，而内皮功能障碍的参数差异有统计学意义，提示内皮损伤可能是 LI 的病理学机制之一。这与国外 Lavallée 等[4]和 Oksala 等[9]的研究结果基本一致。最近的一项研究纳入 2 型糖尿病合并微血管病变的患者和健康对照组，结果显示患者 vWF 表达水平高于对照组［（196.59±80.32）% vs.（148.06±90.34）%，P=0.04］；患者血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受体表达水平明显高于对照组［（3.91±2.91）% vs.（2.79±2.51）%，P=0.002］[10]，表明了 vWF 和血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受体的表达参与血管病变的发生和发展。国内许海霞等[11]研究发现，脑小血管病患者血小板活性因子表达水平较对照组高，提示血小板功能活跃和内皮细胞损伤是导致脑小血管病的病理学机制之一；但将脑小血管病根据影像学分组后发现，分级程度高的患者血小板活性因子表达水平不一定高，两者无明显正相关。其与本研究观察的血小板活化因子不同，可能是两个研究结果差异的原因。
本研究发现 LI 组患者血小板活化参数在 1 个月和 3 个月时均无明显改变。而在急性脑卒中的研究中，血小板活性因子不能预测患者长期生存[12]。因此我们认为慢性血小板活化可能在 LI 的发病机制中不发挥核心作用。
血管内皮活性因子 vWF、hsCPR 及 HCY 表达水平在 LI 组患者中升高，而 3 个月时有所下降，但仍高于正常，表明内皮功能的障碍可能与 LI 相关。动物实验发现，C反应蛋白 水平升高与内皮功能障碍有关，主要机制为 C 反应蛋白抑制血管内皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS），而一氧化氮介导的血管舒张需要 eNOS 的参与，故研究者认为 CRP 可能是加重内皮功能障碍的关键分子[13]。一项大型研究发现，对于 LI 患者，hsCRP 水平可预测卒中复发的风险[14]。Woywodt 等[15]发现，与动脉粥样硬化型、心源型脑梗死相似，LI 患者循环内皮细胞增加，推测循环内皮细胞是脑卒中内皮损伤和/或修复的标志物。Fan 等[16]研究发现血清 HCY 可能是急性 LI 患者的独立危险因素，而不是早期预后的预测因素结果。本研究中血清 HCY 在 LI 患者中升高，但在 3 个月时基本恢复正常。一项对 121 例患者进行 TOAST 分型的试验发现，LI 患者 HCY、hsCRP、白细胞介素 6、基质金属蛋白酶 9 水平均升高（P<0.05），提示炎症反应在卒中发病机制中的重要作用[17]。一项 meta 研究纳入 42 篇文献，包括 4 186 例脑梗死，其中有 2 196 例 LI 患者和 2 500 例非卒中对照者，发现了 LI 患者内皮功能障碍标志物（HCY、vWF）明显高于非 LI 者；与其他脑梗死亚型相比，HCY 水平在 LI 中没有差异，而 vWF 在 LI 中显著降低；炎性标志物（C 反应蛋白）在 LI 患者与非 LI 相比更高，而与其他脑梗死亚型相比，则没有差异[18]。该研究表明 LI 患者这些因子升高可能反映卒中的发生过程，而不是 LI 特有的全身性炎症或内皮功能障碍，故炎症过程和内皮功能障碍可能在 LI 发展中有一定的作用，与本研究的结果一致。
综上，与对照组相比，慢性血小板活化可能在 LI 病理生理学中不发挥核心作用，内皮功能障碍可能是 LI 的病理机制之一。下一步还需增加检测的时间点和延长研究的时间跨度，有必要采用多中心、不同种族的合作研究模式，以提供更可靠的 LI 病理学证据。
