引用本文： 巫丽娟, 张莉, 赵艺, 黄馨怡, 周娟, 丁柳, 彭武, 庄杰, 周汶静, 陆小军, 陈捷. 血浆EB病毒核酸检测在非高发区鼻咽癌患者中的临床价值探讨. 华西医学, 2021, 36(8): 1032-1036. doi: 10.7507/1002-0179.201909175 复制
鼻咽癌是常见的恶性肿瘤之一，在我国东南沿海及东南亚呈高发趋势，而在我国西南地区鼻咽癌发病趋势明显低于东南沿海，其发生与种族、遗传、EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染、环境和某些化学致癌物等因素有关。由于定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术的发展，定量检测血浆中的游离病毒 DNA 载量逐渐受到学者们的关注[1-3]。已有相关文献报道测定血浆中的 EBV-DNA 载量可作为诊断及监测鼻咽癌患者病情变化的手段之一[4-5]，但在我国西南地区，鼻咽癌患者的发病情况及复发情况等与 EBV 检测阳性之间的临床价值关系尚未见报道。因此，本研究采用实时荧光定量 PCR 技术测定鼻咽癌患者血浆中游离 EBV 的 DNA 拷贝数，来探讨血浆 EBV-DNA 检测情况与非高发区鼻咽癌患者生存及预后之间的关系。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象
回顾性收集 2014 年 1 月—2015 年 12 月在我院确诊的非角化型鼻咽癌患者资料。纳入标准：综合患者的病理、影像学报告等资料，由资深耳鼻喉科临床医生确诊的非角化型鼻咽癌患者。排除标准：① 合并鼻咽部其他疾病的患者；② 无法完成 3 年随访患者。本研究经四川大学华西医院临床试验与生物医学伦理专委会审查通过，审批号：2014 年审（198）。
1.2 EBV 核酸提取及扩增
相关资料均来源于四川大学华西医院的医院信息系统及实验室信息系统，EBV-DNA 载量的检测由实验医学科完成，根据医院的标准操作规程和要求，采集患者全血，离心取血浆进行 EBV-DNA 提取，EBV 核酸提取采用圣湘生物科技股份有限公司 Natch S 全自动核酸提取仪，核酸定量检测采用 PCR-荧光探针法。具体扩增条件根据试剂盒说明书进行。
1.3 观察指标
计算我院总体鼻咽癌患者 EBV-DNA 检测率及治疗前后 EBV-DNA 检测阳性率。其中我院总体鼻咽癌患者 EBV-DNA 检测率=我院治疗前检测 EBV-DNA 的鼻咽癌患者例数/我院鼻咽癌患者例数×100%；EBV-DNA 检测阳性率=EBV-DNA 阳性患者例数/检测 EBV-DNA 的鼻咽癌患者例数×100%，对于治疗后的 EBV-DNA 检测阳性率，本研究只回顾性分析了治疗后半年内进行过 EBV-DNA 检测的患者，治疗后半年内多次检测病毒载量的患者以其病毒载量最高的一次结果为准。
对治疗后半年内至少有过 1 次 EBV-DNA 检测患者的复发、转移及疾病进展等情况与治疗后 EBV-DNA 阳性间的关联进行分析，了解 EBV-DNA 阳性对患者预后及生存期的影响，同时回顾分析一般资料（年龄、性别、疾病分期）与疾病 3 年期预后的关系。由资深耳鼻喉科临床医生综合患者的病理、影像学报告等资料，判断复发与转移情况，疾病有复发或有远处转移之一均定义为疾病有进展。根据以往文献经验，本研究年龄以 45 岁进行分组；TNM 分期中因Ⅰ期和Ⅱ期分化程度高，Ⅲ、Ⅳ期分化程度低，本研究以Ⅰ期+Ⅱ期为早期，以Ⅲ期+Ⅳ期为晚期。
1.4 统计学方法
应用 SPSS 20.0 软件对数据进行统计学处理。正态分布计量资料采用均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验；非正态分布计量资料采用中位数（下四分位数，上四分位数）表示。计数资料采用例数和/或百分比表示，组间率的比较采用 Pearson χ2检验，治疗前后阳性率的比较采用 McNemar 检验；因分析数据时有单元格的理论频数小于 5，而总样本例数大于 40，故用到了χ2检验中的连续修正值。对于随访数据，绘制 Kaplan-Meier 生存曲线并进行对数秩检验。双侧检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 治疗前后 EBV-DNA 检测情况
本研究共纳入 235 例患者，其中 164 例治疗前检测了 EBV-DNA，检测率为 69.79%。164 例患者中，EBV-DNA 阳性 149 例，阳性率为 90.85%；EBV-DNA 载量中位数（下四分位数，上四分位数）为 2850（527，12750）copies/mL。将 164 例患者按性别、年龄、分期分别进行分组，男性与女性患者间［90.91%（100/110）vs. 90.74%（49/54）；χ2=0.000，P=1.000］、年龄≤45 岁与>45 岁患者间［89.19%（66/74）vs. 92.22%（83/90）；χ2=0.450，P=0.503］、早期（Ⅰ期+Ⅱ期）与晚期（Ⅲ期+Ⅳ期）患者间［84.00%（21/25）vs. 92.09%（128/139）；χ2=0.836，P=0.360］阳性率比较，差异均无统计学意义。
治疗后半年内检测 EBV-DNA 的患者共 131 例。其中男 89 例，女 42 例；年龄≤45 岁 53 例，>45 岁 78 例；早期（Ⅰ期+Ⅱ期）25 例，晚期（Ⅲ期+Ⅳ期）106 例；28 例治疗后半年内检测出 EBV-DNA 阳性，阳性率为 21.37%。治疗后半年内 EBV-DNA 检测阳性组和阴性组的性别、年龄、分期差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
表1
治疗后半年内 EBV-DNA 阳性和阴性患者基本资料比较
2.2 治疗前后 EBV-DNA 检测结果比较
治疗后半年内检测 EBV-DNA 的 131 例患者中，治疗前 EBV-DNA 阴性 14 例，阳性 117 例（89.31%）；治疗后 EBV-DNA 阴性 103 例，阳性 28 例（21.37%）；治疗前后的阳性率差异有统计学意义（χ2=85.172，P<0.001），治疗后阳性率明显降低。见表 2。
表2
131 例患者治疗前后 EBV-DNA 检测结果对比（例）
2.3 治疗后半年内 EBV-DNA 阴性和阳性患者的 3 年期预后比较
治疗后半年内 EBV-DNA 阳性组中 9 例患者有疾病进展，其中复发 3 例，转移 6 例；治疗后半年内 EBV-DNA 阴性组中共 7 例有疾病进展，其中复发 2 例，转移 3 例，复发合并转移 2 例。治疗后半年内 EBV-DNA 阳性与阴性患者的复发率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；但其转移率及疾病进展率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 3。
表3
治疗后半年内 EBV-DNA 阳性和阴性患者 3 年期预后比较［例（%）］
2.4 治疗后半年内检测 EBV-DNA 患者的 3 年期生存分析
治疗后半年内 EBV-DNA 检测阳性患者 3 年无进展生存率（67.86%）及无转移生存率（78.57%）均明显低于治疗后半年内 EBV-DNA 检测阴性患者（93.20%、95.15%），差异均有统计学意义（χ2=14.099，P<0.001；χ2=8.170，P=0.004），见图 1。不同性别、年龄及肿瘤分期的鼻咽癌患者的 3 年无进展生存差异无统计学意义（P>0.05），见图 2。
图1
治疗后半年内检测 EBV-DNA 患者的 3 年生存分析
a. 无进展生存分析；b. 无转移生存分析
图2
不同性别、年龄及肿瘤分期的鼻咽癌患者 3 年无进展生存分析
a. 不同性别比较；b. 不同年龄段比较；c. 不同分期间比较
3 讨论
EBV 同鼻咽癌的发生发展关系密切，血浆中的 EBV-DNA 主要源自肿瘤细胞，EBV-DNA 载量能反映体内肿瘤的负荷，是一项能反映鼻咽癌分期、预后及监测鼻咽癌患者治疗疗效的灵敏而又特异的分子生物学指标[6-8]。目前血浆 EBV-DNA 检测已广泛应用于鼻咽癌的筛查、诊断及判断治疗反应[9-10]，而在我院就诊且治疗前检测 EBV-DNA 的 164 例鼻咽癌患者阳性率为 90.85%，治疗后半年内在我院检测 EBV-DNA 的 131 例患者中，EBV-DNA 阳性检出率为 21.37%，治疗后阳性率显著降低，这些数据与其他学者的研究[11]结果一致，再次验证了 EBV-DNA 检测对于鼻咽癌的筛查及诊断具有重要意义。
血浆 EBV-DNA 的阳性判断标准目前尚存在争议[12-13]，且目前国际上还没有统一的检测标准，无法确立统一的临界值作为阳性参考值，这可能会影响研究中的灵敏度和特异度[14]，根据不同地区的实际情况制定适合自己实验室的阳性报告值是十分必要的。本研究中所有鼻咽癌患者的 EBV-DNA 检测结果都是按照我院的阳性报告标准进行，即报告阳性结果以具体数字为准，未扩增出 EBV-DNA 的检测则报告阴性。本研究治疗前血浆阳性率（90.85%）显著高于高发区鼻咽癌患者[15-17]，EBV-DNA 载量中位数（下四分位数，上四分位数）为 2850（527，12750）copies/mL，病毒载量结果普遍偏低。这种 EBV-DNA 高检出率、低载量值很可能与我院 EBV-DNA 阳性结果的报告方式有关，但也有可能与鼻咽癌低发地区人群所携带的 EBV 载量低于高发地区有关，尚待进一步深入研究。
本研究结果显示，治疗后半年内 EBV-DNA 阳性与 EBV-DNA 阴性者的预后比较，阳性组的 3 年无进展生存率及 3 年无远处转移生存率均低于阴性组，同时治疗后半年内 EBV-DNA 阳性与 EBV-DNA 阴性者的 3 年生存曲线分析结果也表明两组间差异有统计学意义。由于样本量较小，本研究未进行多因素分析，但阳性组与阴性组患者的性别、年龄、肿瘤分期的分布差异无统计学意义，且按上述因素分组时，组间 3 年生存曲线差异均无统计学意义，能够在一定程度上排除这些因素的干扰，可以认为治疗后半年内 EBV-DNA 阴阳性对患者预后及进展有一定影响。坚持监测 EBV-DNA 能为临床后期治疗与监测疾病提供重要的参考价值，若治疗后 EBV-DNA 阳性，则可能预示着疾病预后及进展不理想，提示临床医生需要对该类患者进行更多的关注。
综上，对于非高发区的非角化型鼻咽癌患者，EBV-DNA 检测对于鼻咽癌的筛查及诊断具有重要意义，且治疗后半年内 EBV-DNA 阴阳性可能为患者预后及进展的重要影响因素，治疗前后都应定期监测血浆 EBV-DNA 水平，EBV-DNA 检测有重要的临床价值。
鼻咽癌是常见的恶性肿瘤之一，在我国东南沿海及东南亚呈高发趋势，而在我国西南地区鼻咽癌发病趋势明显低于东南沿海，其发生与种族、遗传、EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染、环境和某些化学致癌物等因素有关。由于定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术的发展，定量检测血浆中的游离病毒 DNA 载量逐渐受到学者们的关注[1-3]。已有相关文献报道测定血浆中的 EBV-DNA 载量可作为诊断及监测鼻咽癌患者病情变化的手段之一[4-5]，但在我国西南地区，鼻咽癌患者的发病情况及复发情况等与 EBV 检测阳性之间的临床价值关系尚未见报道。因此，本研究采用实时荧光定量 PCR 技术测定鼻咽癌患者血浆中游离 EBV 的 DNA 拷贝数，来探讨血浆 EBV-DNA 检测情况与非高发区鼻咽癌患者生存及预后之间的关系。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象
回顾性收集 2014 年 1 月—2015 年 12 月在我院确诊的非角化型鼻咽癌患者资料。纳入标准：综合患者的病理、影像学报告等资料，由资深耳鼻喉科临床医生确诊的非角化型鼻咽癌患者。排除标准：① 合并鼻咽部其他疾病的患者；② 无法完成 3 年随访患者。本研究经四川大学华西医院临床试验与生物医学伦理专委会审查通过，审批号：2014 年审（198）。
1.2 EBV 核酸提取及扩增
相关资料均来源于四川大学华西医院的医院信息系统及实验室信息系统，EBV-DNA 载量的检测由实验医学科完成，根据医院的标准操作规程和要求，采集患者全血，离心取血浆进行 EBV-DNA 提取，EBV 核酸提取采用圣湘生物科技股份有限公司 Natch S 全自动核酸提取仪，核酸定量检测采用 PCR-荧光探针法。具体扩增条件根据试剂盒说明书进行。
1.3 观察指标
计算我院总体鼻咽癌患者 EBV-DNA 检测率及治疗前后 EBV-DNA 检测阳性率。其中我院总体鼻咽癌患者 EBV-DNA 检测率=我院治疗前检测 EBV-DNA 的鼻咽癌患者例数/我院鼻咽癌患者例数×100%；EBV-DNA 检测阳性率=EBV-DNA 阳性患者例数/检测 EBV-DNA 的鼻咽癌患者例数×100%，对于治疗后的 EBV-DNA 检测阳性率，本研究只回顾性分析了治疗后半年内进行过 EBV-DNA 检测的患者，治疗后半年内多次检测病毒载量的患者以其病毒载量最高的一次结果为准。
对治疗后半年内至少有过 1 次 EBV-DNA 检测患者的复发、转移及疾病进展等情况与治疗后 EBV-DNA 阳性间的关联进行分析，了解 EBV-DNA 阳性对患者预后及生存期的影响，同时回顾分析一般资料（年龄、性别、疾病分期）与疾病 3 年期预后的关系。由资深耳鼻喉科临床医生综合患者的病理、影像学报告等资料，判断复发与转移情况，疾病有复发或有远处转移之一均定义为疾病有进展。根据以往文献经验，本研究年龄以 45 岁进行分组；TNM 分期中因Ⅰ期和Ⅱ期分化程度高，Ⅲ、Ⅳ期分化程度低，本研究以Ⅰ期+Ⅱ期为早期，以Ⅲ期+Ⅳ期为晚期。
1.4 统计学方法
应用 SPSS 20.0 软件对数据进行统计学处理。正态分布计量资料采用均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验；非正态分布计量资料采用中位数（下四分位数，上四分位数）表示。计数资料采用例数和/或百分比表示，组间率的比较采用 Pearson χ2检验，治疗前后阳性率的比较采用 McNemar 检验；因分析数据时有单元格的理论频数小于 5，而总样本例数大于 40，故用到了χ2检验中的连续修正值。对于随访数据，绘制 Kaplan-Meier 生存曲线并进行对数秩检验。双侧检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 治疗前后 EBV-DNA 检测情况
本研究共纳入 235 例患者，其中 164 例治疗前检测了 EBV-DNA，检测率为 69.79%。164 例患者中，EBV-DNA 阳性 149 例，阳性率为 90.85%；EBV-DNA 载量中位数（下四分位数，上四分位数）为 2850（527，12750）copies/mL。将 164 例患者按性别、年龄、分期分别进行分组，男性与女性患者间［90.91%（100/110）vs. 90.74%（49/54）；χ2=0.000，P=1.000］、年龄≤45 岁与>45 岁患者间［89.19%（66/74）vs. 92.22%（83/90）；χ2=0.450，P=0.503］、早期（Ⅰ期+Ⅱ期）与晚期（Ⅲ期+Ⅳ期）患者间［84.00%（21/25）vs. 92.09%（128/139）；χ2=0.836，P=0.360］阳性率比较，差异均无统计学意义。
治疗后半年内检测 EBV-DNA 的患者共 131 例。其中男 89 例，女 42 例；年龄≤45 岁 53 例，>45 岁 78 例；早期（Ⅰ期+Ⅱ期）25 例，晚期（Ⅲ期+Ⅳ期）106 例；28 例治疗后半年内检测出 EBV-DNA 阳性，阳性率为 21.37%。治疗后半年内 EBV-DNA 检测阳性组和阴性组的性别、年龄、分期差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
表1
治疗后半年内 EBV-DNA 阳性和阴性患者基本资料比较
2.2 治疗前后 EBV-DNA 检测结果比较
治疗后半年内检测 EBV-DNA 的 131 例患者中，治疗前 EBV-DNA 阴性 14 例，阳性 117 例（89.31%）；治疗后 EBV-DNA 阴性 103 例，阳性 28 例（21.37%）；治疗前后的阳性率差异有统计学意义（χ2=85.172，P<0.001），治疗后阳性率明显降低。见表 2。
表2
131 例患者治疗前后 EBV-DNA 检测结果对比（例）
2.3 治疗后半年内 EBV-DNA 阴性和阳性患者的 3 年期预后比较
治疗后半年内 EBV-DNA 阳性组中 9 例患者有疾病进展，其中复发 3 例，转移 6 例；治疗后半年内 EBV-DNA 阴性组中共 7 例有疾病进展，其中复发 2 例，转移 3 例，复发合并转移 2 例。治疗后半年内 EBV-DNA 阳性与阴性患者的复发率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；但其转移率及疾病进展率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 3。
表3
治疗后半年内 EBV-DNA 阳性和阴性患者 3 年期预后比较［例（%）］
2.4 治疗后半年内检测 EBV-DNA 患者的 3 年期生存分析
治疗后半年内 EBV-DNA 检测阳性患者 3 年无进展生存率（67.86%）及无转移生存率（78.57%）均明显低于治疗后半年内 EBV-DNA 检测阴性患者（93.20%、95.15%），差异均有统计学意义（χ2=14.099，P<0.001；χ2=8.170，P=0.004），见图 1。不同性别、年龄及肿瘤分期的鼻咽癌患者的 3 年无进展生存差异无统计学意义（P>0.05），见图 2。
图1
治疗后半年内检测 EBV-DNA 患者的 3 年生存分析
a. 无进展生存分析；b. 无转移生存分析
图2
不同性别、年龄及肿瘤分期的鼻咽癌患者 3 年无进展生存分析
a. 不同性别比较；b. 不同年龄段比较；c. 不同分期间比较
3 讨论
EBV 同鼻咽癌的发生发展关系密切，血浆中的 EBV-DNA 主要源自肿瘤细胞，EBV-DNA 载量能反映体内肿瘤的负荷，是一项能反映鼻咽癌分期、预后及监测鼻咽癌患者治疗疗效的灵敏而又特异的分子生物学指标[6-8]。目前血浆 EBV-DNA 检测已广泛应用于鼻咽癌的筛查、诊断及判断治疗反应[9-10]，而在我院就诊且治疗前检测 EBV-DNA 的 164 例鼻咽癌患者阳性率为 90.85%，治疗后半年内在我院检测 EBV-DNA 的 131 例患者中，EBV-DNA 阳性检出率为 21.37%，治疗后阳性率显著降低，这些数据与其他学者的研究[11]结果一致，再次验证了 EBV-DNA 检测对于鼻咽癌的筛查及诊断具有重要意义。
血浆 EBV-DNA 的阳性判断标准目前尚存在争议[12-13]，且目前国际上还没有统一的检测标准，无法确立统一的临界值作为阳性参考值，这可能会影响研究中的灵敏度和特异度[14]，根据不同地区的实际情况制定适合自己实验室的阳性报告值是十分必要的。本研究中所有鼻咽癌患者的 EBV-DNA 检测结果都是按照我院的阳性报告标准进行，即报告阳性结果以具体数字为准，未扩增出 EBV-DNA 的检测则报告阴性。本研究治疗前血浆阳性率（90.85%）显著高于高发区鼻咽癌患者[15-17]，EBV-DNA 载量中位数（下四分位数，上四分位数）为 2850（527，12750）copies/mL，病毒载量结果普遍偏低。这种 EBV-DNA 高检出率、低载量值很可能与我院 EBV-DNA 阳性结果的报告方式有关，但也有可能与鼻咽癌低发地区人群所携带的 EBV 载量低于高发地区有关，尚待进一步深入研究。
本研究结果显示，治疗后半年内 EBV-DNA 阳性与 EBV-DNA 阴性者的预后比较，阳性组的 3 年无进展生存率及 3 年无远处转移生存率均低于阴性组，同时治疗后半年内 EBV-DNA 阳性与 EBV-DNA 阴性者的 3 年生存曲线分析结果也表明两组间差异有统计学意义。由于样本量较小，本研究未进行多因素分析，但阳性组与阴性组患者的性别、年龄、肿瘤分期的分布差异无统计学意义，且按上述因素分组时，组间 3 年生存曲线差异均无统计学意义，能够在一定程度上排除这些因素的干扰，可以认为治疗后半年内 EBV-DNA 阴阳性对患者预后及进展有一定影响。坚持监测 EBV-DNA 能为临床后期治疗与监测疾病提供重要的参考价值，若治疗后 EBV-DNA 阳性，则可能预示着疾病预后及进展不理想，提示临床医生需要对该类患者进行更多的关注。
综上，对于非高发区的非角化型鼻咽癌患者，EBV-DNA 检测对于鼻咽癌的筛查及诊断具有重要意义，且治疗后半年内 EBV-DNA 阴阳性可能为患者预后及进展的重要影响因素，治疗前后都应定期监测血浆 EBV-DNA 水平，EBV-DNA 检测有重要的临床价值。
