引用本文： 袁余, 王远芳, 舒玲, 刘雅, 康梅, 马莹. 侧向层析法检测隐球菌荚膜多糖抗原在隐球菌感染诊断中的临床价值. 华西医学, 2021, 36(8): 1044-1047. doi: 10.7507/1002-0179.202007025 复制
隐球菌是条件致病性深部真菌，易发于细胞免疫功能受损人群，主要累及中枢神经系统、肺、皮肤、骨骼及淋巴结等脏器，可引起人脑膜炎和肺炎等，其中中枢神经系统隐球菌感染占 80%[1]。新型隐球菌是隐球菌属重要致病菌，属环境腐生菌，可从土壤和鸽粪中分离，是人和动物的主要传染源。近年来，因抗菌药物的滥用以及获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）、恶性肿瘤、器官移植、细胞免疫功能低下、糖尿病等患者增多等因素，隐球菌感染已成为继白色念珠菌后常见的机会感染真菌[2]。隐球菌感染由于其临床表现多样性，缺乏特异性，诊断往往在疾病晚期，导致治疗延误，故对隐球菌感染的早期快速诊断可促进及时有效治疗，降低死亡率[3-5]。本研究以我院隐球菌荚膜多糖抗原侧向层析法在临床应用中的情况及与常规病原学检测方法比较，分析其在临床应用中的价值。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集我院 2018 年 1 月—12 月送检隐球菌荚膜多糖抗原检测患者临床资料，排除同一患者同一样本类型重复送检。本研究已通过四川大学华西医院生物医学伦理分委会审批，审批号：2018 年审（53）号。
1.2 试剂
采用隐球菌荚膜多糖抗原检测试剂（美国 IMMY 生物科技有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 侧向层析法操作流程
隐球菌荚膜多糖抗原侧向层析法可检测脑脊液、血清或血浆样本，取样本处理液 40 μL，再加入等体积的脑脊液或血清、血浆样本，混匀，插入测试条，10 min 后判读结果。按试剂说明书进行操作，仅质量控制（质控）线出现为阴性；质控线和检测线同时出现为阳性；质控条带未出现则检测失败，应重做。
1.3.2 微生物培养
脑脊液标本接种到血液培养基（blood agar plate，BAP）、巧克力培养基（chocolate plate，CA）、沙堡弱葡萄糖琼脂（sabouraud dextrose agar，SDA）培养基；血培养标本接种到 BACT/ALE RT 3D 血培养瓶，阳性再转种到 BAP、CA、SDA 培养基，35℃ 培养 2～5 d，平板有菌生长后做质谱鉴定。该实验所有培养平皿均来自郑州安途生物工程有限公司；质谱仪为德国 Bruker（布鲁克）分析仪器公司。
1.3.3 显微镜检查（镜检）
脑脊液和痰标本墨汁染色法（墨染法）查找隐球菌菌体；革兰染色查找具有无色荚膜的紫色圆形菌体。采用日本奥林巴斯显微镜，镜检倍数：×10、×40、×100。
1.3.4 病理检测
在 CT 或 B 型超声引导下进行肺穿刺活检，经固定、包埋、切片后进行苏木精-伊红染色法和特殊染色。
1.4 观察指标
收集患者姓名、性别、科室、标本类型、病原学和病理学检测结果等，且病原学和病理学检测是临床确诊隐球菌感染疾病的金标准。分析临床送检样本类型、送检科室及病原学检测中墨汁染色、真菌培养、隐球菌荚膜多糖抗原检测等结果。
灵敏度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%，特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×100%，阳性预测值=真阳性例数/（真阳性例数+假阳性例数）×100%，阴性预测值=真阴性例数/（真阴性例数+假阴性例数）×100%，阳性率=阳性例数/（阳性例数+阴性例数）×100%。
1.5 统计学方法
采用 SPSS 22.0 软件进行数据统计分析。计量资料采用中位数进行统计描述，计数资料采用例数和百分比进行统计描述。
2 结果
2.1 患者一般资料
2018 年全院送检隐球菌荚膜多糖抗原检测 721 例。送检患者年龄中位数为 48 岁，最小 7 岁，最大 85 岁；男 391 例，女 330 例；常见送检科室有感染科、呼吸内科、传染科、神经内科、急诊科等 5 个科室；标本类型：脑脊液样本 290 例（40.22%），血液样本 431 例（59.78%）。
由于临床送检患者常因头痛、头晕、意识障碍、发热、肺部感染等诊断入院诊治，因病理检测耗时长且需手术或侵袭性操作取材，所以在确诊病例中，仅 4 例患者送检。
2.2 隐球菌荚膜多糖抗原检出结果
721 例患者中，检出隐球菌荚膜多糖抗原阳性 66 例，其中已确诊隐球菌感染 62 例［隐球菌性脑膜炎 45 例（72.58%）、隐球菌肺炎 16 例（25.81%）、骨隐球菌 1 例（1.61%，肝移植术后）］，假阳性 4 例（临床诊断分别为系统性红斑狼疮、双肺结核、脓毒血症、蛋白尿，病理及病原学检测均提示非隐球菌感染）。
侧向层析法检测隐球菌感染的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别是 100.00%（62/62）、99.39%（655/659）、93.93%（62/66）、100.00%（655/655），见表1；墨染法、真菌培养法、侧向层析法检测隐球菌感染的阳性率分别是 63.46%（33/52）、48.00%（24/50）、100.00%（62/62），见表2。
表1
隐球菌荚膜多糖抗原侧向层析法检测结果（n=721，例）
表2
临床确诊隐球菌感染患者的墨染法、真菌培养法及侧向层析法检测结果比较（n=62，例）
3 讨论
隐球菌病患者临床表现及影像学检查因缺乏特异性，易漏诊、误诊、延误治疗，部分患者甚至被当炎症或其他感染性疾病治疗，最后因脑部手术或肺部手术才被确诊[6-7]。目前实验室对隐球菌检测主要包括病原学检测（墨染法、真菌培养法）、免疫学及病理学检测，且病原学和病理学检测是临床确诊隐球菌感染疾病的金标准[8-9]。墨染法方便快捷，但人为因素影响大、阳性率低；真菌培养法及组织病理检测法特异性高，但存在耗时长、侵袭性操作、阳性率低等因素而导致延误诊断和治疗。免疫学方法检测隐球菌荚膜多糖抗原有酶联免疫吸附测定法、乳胶凝集法和侧向层析法，其中侧向层析法为近年来新注册产品，其采用免疫层析技术，以胶体金标记单克隆抗体，可检测隐球菌（A-D）4 种血清型，因其有较高敏感性和特异性，且具有操作简单、快速，结果易判读等特点，被作为隐球菌感染筛查和辅助诊断的有效方法应用于临床[10-11]。
2018 年我院送检隐球菌荚膜多糖抗原检测 721 例，全年送检脑脊液标本 290 例、血液标本 431 例。全年检出隐球菌荚膜多糖抗原阳性样本 66 例，已确诊隐球菌感染 62 例，假阳性 4 例。类风湿因子、二氧化碳噬纤维菌、黏膜口腔球菌、系统性红斑狼疮、白吉利毛孢子菌、巨球蛋白、抗酸杆菌均与新生隐球菌荚膜多糖抗原存在交叉抗原，可引起假阳性。因此若隐球菌抗原检测条带显示较弱，临床隐球菌感染诊断不明，建议重新抽血复查，慎重解释隐球菌感染。有文献指出，体内高载量浓度隐球菌所致沟状现象、感染早期抗原量过低和荚膜过小及体内未知非特异性蛋白对隐球菌抗原的掩盖效应，可引起假阴性[12-13]。在临床研究中若考虑沟状效应，因试剂说明未提及且无临床标准和专家共识说明样本最大稀释倍数，所以一般实验室会进行 10 倍、20 倍稀释后进行报告。本文中的阴性样本为 655 例，未从临床资料和其他检查中发现假阴性病例。
目前病原学及病理学检测是隐球菌感染的“金标准”，62 例有临床明确诊断的隐球菌抗原阳性患者中，侧向层析法检测阳性率 100.00%，墨染法检测阳性率 63.46%，真菌培养法检测阳性率 48.00%。可见侧向层析法检测隐球菌感染的阳性率高于墨染法和真菌培养法。且墨染法和真菌培养法一次检出率较低，需离心和多次反复送检可提高阳性检出率。有文献报道真菌培养检出阳性率仅 25%～46%[14]，我院真菌培养法阳性率 48.00% 与其较一致。62 例已确诊隐球菌感染患者中，45 例为隐球菌性脑膜炎（72.58%）、隐球菌肺炎 16 例（25.81%）、骨隐球菌感染 1 例（1.61%）。目前，隐球菌性脑膜炎仍是隐球菌感染所致疾病第 1 位，国外隐球菌性脑膜炎研究主要针对 AIDS 患者，而我国隐球菌性脑膜炎患者较多仍是非 AIDS 患者，但在人口增长速度较快的城市 AIDS 患者合并隐球菌性脑膜炎有增多趋势。肺隐球菌感染常见于免疫力低下人群，可引起急性、亚急性、慢性深部真菌感染。近年来肺隐球菌感染不断增多，部分患者无临床表现，部分表现为慢性隐匿起病，病情发展严重时可因呼吸衰竭而死。骨隐球菌感染引起的骨髓炎在临床较为少见，因其影像学特点非特异性，常与结核、恶性肿瘤混淆，所以一般骨隐球菌感染需病理检测或真菌培养才可确诊。骨隐球菌感染一般很少发生在免疫功能正常患者中，我院检出的该例骨隐球菌病例是 1 例肝移植术后患者，因术后半年出现髋部疼痛不适，伴活动受限，先经隐球菌侧向层析法检测阳性，后进行穿刺活检查见肉芽肿性炎症，组织形态学显示为新型隐球菌感染，所以早期识别和合理选择抗真菌药物治疗对隐球菌感染愈后影响极大。
近年来，隐球菌荚膜多糖抗原检测作为隐球菌感染的辅助诊断不断应用于临床，本文研究结果表明侧向层析法检测荚膜多糖抗原对隐球菌感染的诊断有较好敏感性和特异性，与已有文献报道[15-16]一致。基于该检测方法的高敏感性及特异性，其在敏感性上优于传统方法，且该检测方法对实验室要求不高，标本用量较少、操作简单、易判读、用时短等特点，可在不同等级医院开展用以临床对隐球菌的早期快速筛查和辅助诊断。
隐球菌是条件致病性深部真菌，易发于细胞免疫功能受损人群，主要累及中枢神经系统、肺、皮肤、骨骼及淋巴结等脏器，可引起人脑膜炎和肺炎等，其中中枢神经系统隐球菌感染占 80%[1]。新型隐球菌是隐球菌属重要致病菌，属环境腐生菌，可从土壤和鸽粪中分离，是人和动物的主要传染源。近年来，因抗菌药物的滥用以及获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）、恶性肿瘤、器官移植、细胞免疫功能低下、糖尿病等患者增多等因素，隐球菌感染已成为继白色念珠菌后常见的机会感染真菌[2]。隐球菌感染由于其临床表现多样性，缺乏特异性，诊断往往在疾病晚期，导致治疗延误，故对隐球菌感染的早期快速诊断可促进及时有效治疗，降低死亡率[3-5]。本研究以我院隐球菌荚膜多糖抗原侧向层析法在临床应用中的情况及与常规病原学检测方法比较，分析其在临床应用中的价值。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集我院 2018 年 1 月—12 月送检隐球菌荚膜多糖抗原检测患者临床资料，排除同一患者同一样本类型重复送检。本研究已通过四川大学华西医院生物医学伦理分委会审批，审批号：2018 年审（53）号。
1.2 试剂
采用隐球菌荚膜多糖抗原检测试剂（美国 IMMY 生物科技有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 侧向层析法操作流程
隐球菌荚膜多糖抗原侧向层析法可检测脑脊液、血清或血浆样本，取样本处理液 40 μL，再加入等体积的脑脊液或血清、血浆样本，混匀，插入测试条，10 min 后判读结果。按试剂说明书进行操作，仅质量控制（质控）线出现为阴性；质控线和检测线同时出现为阳性；质控条带未出现则检测失败，应重做。
1.3.2 微生物培养
脑脊液标本接种到血液培养基（blood agar plate，BAP）、巧克力培养基（chocolate plate，CA）、沙堡弱葡萄糖琼脂（sabouraud dextrose agar，SDA）培养基；血培养标本接种到 BACT/ALE RT 3D 血培养瓶，阳性再转种到 BAP、CA、SDA 培养基，35℃ 培养 2～5 d，平板有菌生长后做质谱鉴定。该实验所有培养平皿均来自郑州安途生物工程有限公司；质谱仪为德国 Bruker（布鲁克）分析仪器公司。
1.3.3 显微镜检查（镜检）
脑脊液和痰标本墨汁染色法（墨染法）查找隐球菌菌体；革兰染色查找具有无色荚膜的紫色圆形菌体。采用日本奥林巴斯显微镜，镜检倍数：×10、×40、×100。
1.3.4 病理检测
在 CT 或 B 型超声引导下进行肺穿刺活检，经固定、包埋、切片后进行苏木精-伊红染色法和特殊染色。
1.4 观察指标
收集患者姓名、性别、科室、标本类型、病原学和病理学检测结果等，且病原学和病理学检测是临床确诊隐球菌感染疾病的金标准。分析临床送检样本类型、送检科室及病原学检测中墨汁染色、真菌培养、隐球菌荚膜多糖抗原检测等结果。
灵敏度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%，特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×100%，阳性预测值=真阳性例数/（真阳性例数+假阳性例数）×100%，阴性预测值=真阴性例数/（真阴性例数+假阴性例数）×100%，阳性率=阳性例数/（阳性例数+阴性例数）×100%。
1.5 统计学方法
采用 SPSS 22.0 软件进行数据统计分析。计量资料采用中位数进行统计描述，计数资料采用例数和百分比进行统计描述。
2 结果
2.1 患者一般资料
2018 年全院送检隐球菌荚膜多糖抗原检测 721 例。送检患者年龄中位数为 48 岁，最小 7 岁，最大 85 岁；男 391 例，女 330 例；常见送检科室有感染科、呼吸内科、传染科、神经内科、急诊科等 5 个科室；标本类型：脑脊液样本 290 例（40.22%），血液样本 431 例（59.78%）。
由于临床送检患者常因头痛、头晕、意识障碍、发热、肺部感染等诊断入院诊治，因病理检测耗时长且需手术或侵袭性操作取材，所以在确诊病例中，仅 4 例患者送检。
2.2 隐球菌荚膜多糖抗原检出结果
721 例患者中，检出隐球菌荚膜多糖抗原阳性 66 例，其中已确诊隐球菌感染 62 例［隐球菌性脑膜炎 45 例（72.58%）、隐球菌肺炎 16 例（25.81%）、骨隐球菌 1 例（1.61%，肝移植术后）］，假阳性 4 例（临床诊断分别为系统性红斑狼疮、双肺结核、脓毒血症、蛋白尿，病理及病原学检测均提示非隐球菌感染）。
侧向层析法检测隐球菌感染的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别是 100.00%（62/62）、99.39%（655/659）、93.93%（62/66）、100.00%（655/655），见表1；墨染法、真菌培养法、侧向层析法检测隐球菌感染的阳性率分别是 63.46%（33/52）、48.00%（24/50）、100.00%（62/62），见表2。
表1
隐球菌荚膜多糖抗原侧向层析法检测结果（n=721，例）
表2
临床确诊隐球菌感染患者的墨染法、真菌培养法及侧向层析法检测结果比较（n=62，例）
3 讨论
隐球菌病患者临床表现及影像学检查因缺乏特异性，易漏诊、误诊、延误治疗，部分患者甚至被当炎症或其他感染性疾病治疗，最后因脑部手术或肺部手术才被确诊[6-7]。目前实验室对隐球菌检测主要包括病原学检测（墨染法、真菌培养法）、免疫学及病理学检测，且病原学和病理学检测是临床确诊隐球菌感染疾病的金标准[8-9]。墨染法方便快捷，但人为因素影响大、阳性率低；真菌培养法及组织病理检测法特异性高，但存在耗时长、侵袭性操作、阳性率低等因素而导致延误诊断和治疗。免疫学方法检测隐球菌荚膜多糖抗原有酶联免疫吸附测定法、乳胶凝集法和侧向层析法，其中侧向层析法为近年来新注册产品，其采用免疫层析技术，以胶体金标记单克隆抗体，可检测隐球菌（A-D）4 种血清型，因其有较高敏感性和特异性，且具有操作简单、快速，结果易判读等特点，被作为隐球菌感染筛查和辅助诊断的有效方法应用于临床[10-11]。
2018 年我院送检隐球菌荚膜多糖抗原检测 721 例，全年送检脑脊液标本 290 例、血液标本 431 例。全年检出隐球菌荚膜多糖抗原阳性样本 66 例，已确诊隐球菌感染 62 例，假阳性 4 例。类风湿因子、二氧化碳噬纤维菌、黏膜口腔球菌、系统性红斑狼疮、白吉利毛孢子菌、巨球蛋白、抗酸杆菌均与新生隐球菌荚膜多糖抗原存在交叉抗原，可引起假阳性。因此若隐球菌抗原检测条带显示较弱，临床隐球菌感染诊断不明，建议重新抽血复查，慎重解释隐球菌感染。有文献指出，体内高载量浓度隐球菌所致沟状现象、感染早期抗原量过低和荚膜过小及体内未知非特异性蛋白对隐球菌抗原的掩盖效应，可引起假阴性[12-13]。在临床研究中若考虑沟状效应，因试剂说明未提及且无临床标准和专家共识说明样本最大稀释倍数，所以一般实验室会进行 10 倍、20 倍稀释后进行报告。本文中的阴性样本为 655 例，未从临床资料和其他检查中发现假阴性病例。
目前病原学及病理学检测是隐球菌感染的“金标准”，62 例有临床明确诊断的隐球菌抗原阳性患者中，侧向层析法检测阳性率 100.00%，墨染法检测阳性率 63.46%，真菌培养法检测阳性率 48.00%。可见侧向层析法检测隐球菌感染的阳性率高于墨染法和真菌培养法。且墨染法和真菌培养法一次检出率较低，需离心和多次反复送检可提高阳性检出率。有文献报道真菌培养检出阳性率仅 25%～46%[14]，我院真菌培养法阳性率 48.00% 与其较一致。62 例已确诊隐球菌感染患者中，45 例为隐球菌性脑膜炎（72.58%）、隐球菌肺炎 16 例（25.81%）、骨隐球菌感染 1 例（1.61%）。目前，隐球菌性脑膜炎仍是隐球菌感染所致疾病第 1 位，国外隐球菌性脑膜炎研究主要针对 AIDS 患者，而我国隐球菌性脑膜炎患者较多仍是非 AIDS 患者，但在人口增长速度较快的城市 AIDS 患者合并隐球菌性脑膜炎有增多趋势。肺隐球菌感染常见于免疫力低下人群，可引起急性、亚急性、慢性深部真菌感染。近年来肺隐球菌感染不断增多，部分患者无临床表现，部分表现为慢性隐匿起病，病情发展严重时可因呼吸衰竭而死。骨隐球菌感染引起的骨髓炎在临床较为少见，因其影像学特点非特异性，常与结核、恶性肿瘤混淆，所以一般骨隐球菌感染需病理检测或真菌培养才可确诊。骨隐球菌感染一般很少发生在免疫功能正常患者中，我院检出的该例骨隐球菌病例是 1 例肝移植术后患者，因术后半年出现髋部疼痛不适，伴活动受限，先经隐球菌侧向层析法检测阳性，后进行穿刺活检查见肉芽肿性炎症，组织形态学显示为新型隐球菌感染，所以早期识别和合理选择抗真菌药物治疗对隐球菌感染愈后影响极大。
近年来，隐球菌荚膜多糖抗原检测作为隐球菌感染的辅助诊断不断应用于临床，本文研究结果表明侧向层析法检测荚膜多糖抗原对隐球菌感染的诊断有较好敏感性和特异性，与已有文献报道[15-16]一致。基于该检测方法的高敏感性及特异性，其在敏感性上优于传统方法，且该检测方法对实验室要求不高，标本用量较少、操作简单、易判读、用时短等特点，可在不同等级医院开展用以临床对隐球菌的早期快速筛查和辅助诊断。
