引用本文： 丁春晓, 刘小虎, 李淼, 李建华, 范英兰. 慢性阻塞性肺疾病模型鼠中性粒细胞弹性蛋白酶和黏蛋白 5AC 的表达及病理意义. 华西医学, 2021, 36(9): 1227-1231. doi: 10.7507/1002-0179.202103298 复制
慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）以慢性咳嗽、咳痰、气短或呼吸困难为主要临床症状，进展至疾病后期常合并肺源性心脏病、呼吸衰竭甚至危及生命，严重危害人类健康[1-4]。世界范围内慢阻肺患病率为 11.7%，死亡人数约 350 万/年[5]，据世界卫生组织统计，慢阻肺是世界第四大致死疾病，每年近 6 亿患者，且患者数逐年增长[6-7]。在我国，40 岁以上人群患病率为 13.7%，患者数量接近 1 亿，为我国疾病死因的第 3 位[3, 8-9]。既往研究显示慢阻肺与炎症介质和细胞因子、蛋白酶及抗蛋白酶、氧化物与抗氧化物、自身抗体、肺泡隔自身凋亡及基因多态性均有关系，多环节、多元素共同参与了慢阻肺的发生及发展过程[10]。这其中，气道黏液高分泌是慢阻肺的重要病理生理表现，其既是引起患者慢性咳痰的要素，也是造成患者易合并肺部感染的独立危险因素[11]。黏蛋白 5AC（mucin 5AC，MUC5AC）是气道黏液蛋白的主要成分，中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）是中性粒细胞释放的蛋白酶，与炎症损伤及修复相关，二者在气道黏液分泌过程中均发挥重要作用[12]。因此，本研究通过检测 NE 及 MUC5AC 在慢阻肺模型鼠气道上皮细胞中的表达情况，进一步探讨慢阻肺气道黏液高分泌发生机制，旨在为临床治疗提供新思路。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物
选用雄性无特定病原体级 Sprague-Dawley 大鼠 60 只，体重在 180～220 g，平均体重约 205 g，以上大鼠均来自辽宁长生生物技术股份有限公司，合格证编号为 SCXK（辽）2015-0001。本研究已获得辽宁省中医药研究院实验动物伦理委员会审查批准，审批号为 2020-12。
1.2 仪器设备及试剂
仪器设备及试剂包括：TP1020 型自动脱水机及切片机（德国徕卡公司），YG-280KX 型烤片机及摊片机（湖北孝感阳光神琦医用科技公司），JKDP2 型电热恒温培养箱（厦门医疗电子仪器厂），BX53 光电显微镜（日本奥林巴斯株式会社），自制 60 cm×60 cm×70 cm 透明有机玻璃烟熏箱，枸橼酸、多聚甲醛、枸橼酸钠（国药集团化学试剂有限公司），磷酸盐缓冲液、二氨基联苯胺浓缩型试剂盒、爱显蓝-雪夫试剂染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），即用型免疫组织化学超敏试剂盒（福建迈新生物技术开发有限公司），大前门牌香烟（上海卷烟厂），兔抗 NE 抗体（PB1114，武汉博士德生物工程有限公司），鼠抗胃黏液素抗体（sc-21701，上海圣克鲁斯生物技术公司）。
1.3 实验环境
辽宁中医药大学实验动物中心，温度 22～25℃，湿度 55%～60%，许可证号为 SYXK（辽）2012-0010。
1.4 模型制备
共 60 只雄性 Sprague-Dawley 大鼠，采用完全随机化分组方法，抽样前对每只实验动物进行顺序编号，运用随机号表法分成空白组和模型组，每组各 30 只。空白组大鼠不作处理，模型组大鼠运用气道内滴注脂多糖结合烟熏的方法制备慢阻肺气道黏液高分泌模型[13]。脂多糖的气道内滴注：于实验第 1 天、第 15 天（每隔 2 周 1 次）予 3.5% 水合氯醛腹腔麻醉后，采用一次性气管插管法气道内滴注浓度为 1 mL/mg 的脂多糖溶液 0.2 mL。将麻醉大鼠固定在鼠板上，仰卧位头高尾低呈 45° 角放置，暴露声门，在光源下将 16 号套管针沿气管快速插入气管内，拔出针芯，置一光滑干燥镜面的小镜子于导管针接口处，当观察到镜面随大鼠呼吸而出现水雾时，表示气管插管成功，立即接入 1 mL 注射器，快速注入 0.2 mL 脂多糖溶液。注射完成后，立即将大鼠固定板直立并旋转及左右摇晃，使脂多糖溶液在肺内均匀分布。烟熏：造模大鼠脂多糖注射当天不进行烟熏，第 2～28 天（第 15 天除外）给予烟熏，放入自制的有机玻璃密闭熏烟箱内，每次 10 只，用 8 支香烟，每日烟熏 30 min。烟熏每天 2 次，每次 30 min。整个实验过程中，两组实验动物均给予基础饲料喂养，自由饮水。
1.5 标本采集
实验第 31 天取材，用脊椎脱臼法处死大鼠，打开胸腔，暴露心脏，减掉右心耳，用注射器吸取磷酸盐缓冲液 50 mL，从心尖刺入左心室后进行灌注，再用注射器吸取甲醛固定液 20 mL，仍从心尖刺入左心室后进行灌注（灌注 10 mL），取右肺各叶组织，用 4% 多聚甲醛溶液固定以备检。
1.6 实验方法
1.6.1 苏木精-伊红染色
染色方法：肺组织于 4% 多聚甲醛溶液固定 24 h 后，将其从固定液中取出，全自动脱水机脱水，然后用石蜡包埋，切片用二甲苯透明，梯度乙醇及蒸馏水浸泡，苏木精-伊红染色，水洗、浸泡及透明，中性树胶封片。将切片置于显微镜下，分别用低倍及高倍镜观察肺组织及气道上皮形态。判读标准：采用病理评分分级方法。诊断标准：按照黏膜上皮的损伤与修复、腺体增生肥大及黏液腺化生、支气管壁其他组织的慢性炎性损伤 3 项指标综合进行分级，无以上 3 项者为（−），轻度为（+），中度为（++），重度为（+++），按病理分级计分，（−）为 0 分，（+）为 1 分，（++）为 2 分，（+++）为 3 分。
1.6.2 免疫组织化学染色
染色方法：肺组织石蜡切片，烘烤 4 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇（无水、90%、80%、70%）分别浸泡 5 min，蒸馏水浸泡 5 min。于枸橼酸钠缓冲液（pH 值 6.0）中高压修复 5 min。磷酸盐缓冲液漂洗 3 min，滴加 3% 过氧化氢去离子水孵育 10 min。磷酸盐缓冲液漂洗 3 min。血清封闭 15 min，加入磷酸盐缓冲液稀释的一抗（NE、MUC5AU 均为 1∶200），37℃ 孵育 2 h。磷酸盐缓冲液漂洗 3 min。加入生物素标记的二抗，37℃ 孵育 20 min，磷酸盐缓冲液漂洗 3 min。滴加链霉亲和素-过氧化物酶，37℃ 孵育 30 min。磷酸盐缓冲液漂洗 3 min。滴加二氨基联苯胺显色剂，自来水漂洗，苏木精复染 5 min。自来水漂洗 3 s，1% 盐酸乙醇分化 5 s，自来水漂洗 30 s，再脱水、透明，最后中性树胶封片。阳性程度判读：NE 主要表达于肺组织中单核细胞、中性粒细胞等炎性细胞的细胞质内，呈棕黄色即为阳性[14]。MUC5AC 主要表达于气道上皮细胞的细胞质内，呈棕黄色着色即为阳性。判读标准：细胞无着色为（−），阳性着色细胞数占总细胞数<10% 为（±），11%～50% 为（+），51%～75% 为（++），≥75% 为（+++）。每张切片选取 5 个高倍视野（×200）对免疫组织化学结果进行判读。按阳性细胞数分级计分，（−）为 0 分，（±）为 1 分，（+）为 2 分，（++）为 3 分，（+++）为 4 分[15]。
1.6.3 爱显蓝-雪夫试剂染色
染色方法：将肺组织切片常规脱蜡至水，蒸馏水洗 3 次，3% 乙酸溶液洗 3 min，1% 爱显蓝溶液染色 20 min，过碘酸氧化液氧化 20 min，自来水洗完后蒸馏水冲洗，Schiff 溶液染色 20 min，流水冲洗 5 min，经 95% 乙醇、无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。存在杯状细胞增生时，其细胞质内黏液经爱显蓝-雪夫试剂染色后呈蓝色。结果判读及标准：空白组与模型组每张切片随机选取 5 个高倍视野（×200），用 Image-Pro Plus 6.0 软件计数每个视野下杯状细胞总数。
1.7 统计学方法
数据用 SPSS 17.0 软件统计分析，计量资料若符合正态分布用均数±标准差表示，组间比较用独立样本 t 检验，计量资料若不符合正态分布用中位数（下四分位数，上四分位数）表示，组间比较用 Mann-Whitney U 秩和检验。双侧检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 实验动物一般情况
整个实验过程中两组实验动物进食正常，监测体重无明显变化。无神经异常行为，无意外死亡。
2.2 苏木精-伊红染色结果
空白组肺组织支气管黏膜上皮完整，未见变性、坏死及脱落，支气管黏膜上皮纤毛未见粘连、变短及倒伏，黏膜腺体排列规则，未见增生及肥大，间质未见充血水肿及炎性细胞浸润；管腔内未见明显分泌物；管壁平滑肌连续、完整。与空白组对比，模型组黏膜上皮呈明显损伤性改变，上皮纤毛粘连、变短、倒伏甚至缺失，上皮细胞变性、坏死、脱落；偶见鳞状上皮化生；黏膜下腺体增生、肥大及黏液腺化生，杯状细胞明显增多；支气管壁各层组织充血、水肿，淋巴细胞、浆细胞浸润；严重者可见支气管壁平滑肌束断裂、萎缩。模型组实验鼠肺组织均呈现不同程度的上述损伤性变化，均造模成功。结合苏木精-伊红染色后的形态病理评分分级诊断标准，空白组评分为 0（0，1）分，模型组评分为 2（2，3）分，组间差异有统计学意义（Z=−6.422，P<0.001）。见图 1。
图1
两组大鼠肺组织病理形态（苏木精-伊红染色法）
a. 空白组 ×100；b. 模型组 ×100；c. 空白组 ×200；d. 模型组 ×200
2.3 免疫组织化学染色结果
NE 结果显示，空白组评分为 0（0，0）分，模型组评分为 2（2，3）分，组间差异有统计学意义（Z=−6.883，P<0.001）。MUC5AC 结果显示，空白组评分为 0（0，1）分，模型组评分为 2（2，2）分，组间差异有统计学意义（Z=−6.385，P<0.001）。见图 2、3。
图2
两组大鼠 NE 阳性表达情况（免疫组织化学染色法）
a. 空白组 ×100；b. 模型组 ×100；c. 空白组 ×200；d. 模型组 ×200
图3
两组大鼠 MUC5AC 阳性表达情况（免疫组织化学染色法）
a. 空白组 ×100；b. 模型组 ×100；c. 空白组 ×200；d. 模型组 ×200
2.4 爱显蓝-雪夫试剂染色结果
杯状细胞计数结果显示，空白组平均为（6.80±3.19）个，模型组平均为（57.93±7.79）个，组间差异有统计学意义（t=−44.267，P<0.001）。见图 4。
图4
两组大鼠杯状细胞数量情况（爱显蓝-雪夫试剂染色）
a. 空白组 ×100；b. 模型组 ×100；c. 空白组 ×200；d. 模型组 ×200
3 讨论
慢阻肺作为一种常见和多发的慢性病，以慢性炎症为主要特征，常与其他疾病共存[16-20]。截至目前，慢阻肺的确切病因尚不清楚，一般认为对慢性支气管炎和肺气肿有致病的因素都可能参与慢阻肺的发生发展。刘娅钦等[10]经过研究总结发现，炎症介质与细胞因子、蛋白酶与抗蛋白酶、氧化物与抗氧化物、自身抗体、肺泡隔自身凋亡及基因多态性均参与了慢阻肺的发生与发展，气道慢性炎症是慢阻肺的重要病理特征，而在此过程中，气道内黏液高分泌和中性粒细胞聚集是重要的病理生理基础，并与其结局和预后密切相关[21-22]。
NE 是中性粒细胞释放的炎症介质之一，是一种依赖金属离子才具有活性的降解酶，通过结合底物，进而降解细胞外基质中的各种蛋白[23-24]。血清中的 NE 在各种炎症性疾病条件下会增加[25]。有学者研究发现，在生理情况下，NE 能清除肺部病原菌，保护机体免受感染伤害，并保持肺内微环境的平衡稳定；当炎症发生时，中性粒细胞聚集，大量 NE 释放，其过度降解细胞外胶原及过度水解弹性蛋白，致使气道正常结构及纤毛上皮细胞的功能破坏，并诱导上皮内杯状细胞的化生及黏膜内腺体的增生，进而导致黏液过量分泌，造成气道的阻塞[26]。因此，黏液异常是许多呼吸系统疾病的特征，包括哮喘、囊性纤维化和慢阻肺[27]。而气道黏液是一种黏液弹性凝胶，主要由高分子量的黏液糖蛋白和水组成，对维持肺功能和健康具有重要作用，它主要由上皮内的杯状细胞及固有层的黏液腺分泌。黏蛋白是黏液的主要大分子成分，分为两大类：凝胶形成的分泌黏蛋白（即 MUC5AC）和膜栓系黏蛋白[28]。其中 MUC5AC 为高度糖基化的分泌黏蛋白，凭借其富含半胱氨酸的重复序列，可以形成分子间和分子内的二硫键，从而形成复杂的聚合物，进而在上皮细胞表面形成聚合物黏液凝胶的框架；它是一种具有多种功能的分子，包括对上皮细胞的屏障功能、宿主与病原体的相互作用、免疫细胞对癌前病变或恶性病变部位的吸引以及肿瘤进展等[29]。本研究通过观察实验动物支气管上皮的形态变化，结合爱显蓝-雪夫试剂染色，发现慢阻肺模型鼠杯状细胞数明显增多，同时通过免疫组织化学染色发现 NE 和 MUC5AC 的阳性表达模型组均高于空白组，这些结果与上述研究结果相同，究其原因从病理生理角度考虑，在炎症及其他致病因子的刺激下，中性粒细胞聚集并大量释放 NE，同时机体对其进行适应性改变，导致杯状细胞大量明显化生，进而 MUC5AC 分泌增加，气道黏液增加，阻力增加，这一系列病理过程导致出现呼吸窘迫等症状。此外，在进一步证实了慢阻肺病理性黏液高分泌理论基础的同时，设想如果把 NE 作为调控靶点，进而从机制上游抑制黏液高分泌，或许能更优地调控 MUC5AC。
综上，本研究显示，慢阻肺模型鼠的 NE 阳性表达增高，杯状细胞数量增多，MUC5AC 的阳性表达增加，黏液分泌增加。然而，鉴于本研究的实验对象仅为雄性大鼠，研究结果有一定的局限性，未来会在慢阻肺患者人群中进一步探讨 NE、MUC5AC 对慢阻肺的影响机制。在基因、分子研究日益常态化的今天，MUC5AC 正在成为各种恶性肿瘤的潜在诊断、治疗和预后靶点。在这种趋势下，未来通过分子领域找到突破口，多方位靶向抑制 MUC5AC 的高分泌，进而减轻患者的气道阻塞相关症状，提高患者生存质量，延长生存期，是未来的重要研究方向，并具有重要的临床意义。
慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）以慢性咳嗽、咳痰、气短或呼吸困难为主要临床症状，进展至疾病后期常合并肺源性心脏病、呼吸衰竭甚至危及生命，严重危害人类健康[1-4]。世界范围内慢阻肺患病率为 11.7%，死亡人数约 350 万/年[5]，据世界卫生组织统计，慢阻肺是世界第四大致死疾病，每年近 6 亿患者，且患者数逐年增长[6-7]。在我国，40 岁以上人群患病率为 13.7%，患者数量接近 1 亿，为我国疾病死因的第 3 位[3, 8-9]。既往研究显示慢阻肺与炎症介质和细胞因子、蛋白酶及抗蛋白酶、氧化物与抗氧化物、自身抗体、肺泡隔自身凋亡及基因多态性均有关系，多环节、多元素共同参与了慢阻肺的发生及发展过程[10]。这其中，气道黏液高分泌是慢阻肺的重要病理生理表现，其既是引起患者慢性咳痰的要素，也是造成患者易合并肺部感染的独立危险因素[11]。黏蛋白 5AC（mucin 5AC，MUC5AC）是气道黏液蛋白的主要成分，中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）是中性粒细胞释放的蛋白酶，与炎症损伤及修复相关，二者在气道黏液分泌过程中均发挥重要作用[12]。因此，本研究通过检测 NE 及 MUC5AC 在慢阻肺模型鼠气道上皮细胞中的表达情况，进一步探讨慢阻肺气道黏液高分泌发生机制，旨在为临床治疗提供新思路。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物
选用雄性无特定病原体级 Sprague-Dawley 大鼠 60 只，体重在 180～220 g，平均体重约 205 g，以上大鼠均来自辽宁长生生物技术股份有限公司，合格证编号为 SCXK（辽）2015-0001。本研究已获得辽宁省中医药研究院实验动物伦理委员会审查批准，审批号为 2020-12。
1.2 仪器设备及试剂
仪器设备及试剂包括：TP1020 型自动脱水机及切片机（德国徕卡公司），YG-280KX 型烤片机及摊片机（湖北孝感阳光神琦医用科技公司），JKDP2 型电热恒温培养箱（厦门医疗电子仪器厂），BX53 光电显微镜（日本奥林巴斯株式会社），自制 60 cm×60 cm×70 cm 透明有机玻璃烟熏箱，枸橼酸、多聚甲醛、枸橼酸钠（国药集团化学试剂有限公司），磷酸盐缓冲液、二氨基联苯胺浓缩型试剂盒、爱显蓝-雪夫试剂染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），即用型免疫组织化学超敏试剂盒（福建迈新生物技术开发有限公司），大前门牌香烟（上海卷烟厂），兔抗 NE 抗体（PB1114，武汉博士德生物工程有限公司），鼠抗胃黏液素抗体（sc-21701，上海圣克鲁斯生物技术公司）。
1.3 实验环境
辽宁中医药大学实验动物中心，温度 22～25℃，湿度 55%～60%，许可证号为 SYXK（辽）2012-0010。
1.4 模型制备
共 60 只雄性 Sprague-Dawley 大鼠，采用完全随机化分组方法，抽样前对每只实验动物进行顺序编号，运用随机号表法分成空白组和模型组，每组各 30 只。空白组大鼠不作处理，模型组大鼠运用气道内滴注脂多糖结合烟熏的方法制备慢阻肺气道黏液高分泌模型[13]。脂多糖的气道内滴注：于实验第 1 天、第 15 天（每隔 2 周 1 次）予 3.5% 水合氯醛腹腔麻醉后，采用一次性气管插管法气道内滴注浓度为 1 mL/mg 的脂多糖溶液 0.2 mL。将麻醉大鼠固定在鼠板上，仰卧位头高尾低呈 45° 角放置，暴露声门，在光源下将 16 号套管针沿气管快速插入气管内，拔出针芯，置一光滑干燥镜面的小镜子于导管针接口处，当观察到镜面随大鼠呼吸而出现水雾时，表示气管插管成功，立即接入 1 mL 注射器，快速注入 0.2 mL 脂多糖溶液。注射完成后，立即将大鼠固定板直立并旋转及左右摇晃，使脂多糖溶液在肺内均匀分布。烟熏：造模大鼠脂多糖注射当天不进行烟熏，第 2～28 天（第 15 天除外）给予烟熏，放入自制的有机玻璃密闭熏烟箱内，每次 10 只，用 8 支香烟，每日烟熏 30 min。烟熏每天 2 次，每次 30 min。整个实验过程中，两组实验动物均给予基础饲料喂养，自由饮水。
1.5 标本采集
实验第 31 天取材，用脊椎脱臼法处死大鼠，打开胸腔，暴露心脏，减掉右心耳，用注射器吸取磷酸盐缓冲液 50 mL，从心尖刺入左心室后进行灌注，再用注射器吸取甲醛固定液 20 mL，仍从心尖刺入左心室后进行灌注（灌注 10 mL），取右肺各叶组织，用 4% 多聚甲醛溶液固定以备检。
1.6 实验方法
1.6.1 苏木精-伊红染色
染色方法：肺组织于 4% 多聚甲醛溶液固定 24 h 后，将其从固定液中取出，全自动脱水机脱水，然后用石蜡包埋，切片用二甲苯透明，梯度乙醇及蒸馏水浸泡，苏木精-伊红染色，水洗、浸泡及透明，中性树胶封片。将切片置于显微镜下，分别用低倍及高倍镜观察肺组织及气道上皮形态。判读标准：采用病理评分分级方法。诊断标准：按照黏膜上皮的损伤与修复、腺体增生肥大及黏液腺化生、支气管壁其他组织的慢性炎性损伤 3 项指标综合进行分级，无以上 3 项者为（−），轻度为（+），中度为（++），重度为（+++），按病理分级计分，（−）为 0 分，（+）为 1 分，（++）为 2 分，（+++）为 3 分。
1.6.2 免疫组织化学染色
染色方法：肺组织石蜡切片，烘烤 4 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇（无水、90%、80%、70%）分别浸泡 5 min，蒸馏水浸泡 5 min。于枸橼酸钠缓冲液（pH 值 6.0）中高压修复 5 min。磷酸盐缓冲液漂洗 3 min，滴加 3% 过氧化氢去离子水孵育 10 min。磷酸盐缓冲液漂洗 3 min。血清封闭 15 min，加入磷酸盐缓冲液稀释的一抗（NE、MUC5AU 均为 1∶200），37℃ 孵育 2 h。磷酸盐缓冲液漂洗 3 min。加入生物素标记的二抗，37℃ 孵育 20 min，磷酸盐缓冲液漂洗 3 min。滴加链霉亲和素-过氧化物酶，37℃ 孵育 30 min。磷酸盐缓冲液漂洗 3 min。滴加二氨基联苯胺显色剂，自来水漂洗，苏木精复染 5 min。自来水漂洗 3 s，1% 盐酸乙醇分化 5 s，自来水漂洗 30 s，再脱水、透明，最后中性树胶封片。阳性程度判读：NE 主要表达于肺组织中单核细胞、中性粒细胞等炎性细胞的细胞质内，呈棕黄色即为阳性[14]。MUC5AC 主要表达于气道上皮细胞的细胞质内，呈棕黄色着色即为阳性。判读标准：细胞无着色为（−），阳性着色细胞数占总细胞数<10% 为（±），11%～50% 为（+），51%～75% 为（++），≥75% 为（+++）。每张切片选取 5 个高倍视野（×200）对免疫组织化学结果进行判读。按阳性细胞数分级计分，（−）为 0 分，（±）为 1 分，（+）为 2 分，（++）为 3 分，（+++）为 4 分[15]。
1.6.3 爱显蓝-雪夫试剂染色
染色方法：将肺组织切片常规脱蜡至水，蒸馏水洗 3 次，3% 乙酸溶液洗 3 min，1% 爱显蓝溶液染色 20 min，过碘酸氧化液氧化 20 min，自来水洗完后蒸馏水冲洗，Schiff 溶液染色 20 min，流水冲洗 5 min，经 95% 乙醇、无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。存在杯状细胞增生时，其细胞质内黏液经爱显蓝-雪夫试剂染色后呈蓝色。结果判读及标准：空白组与模型组每张切片随机选取 5 个高倍视野（×200），用 Image-Pro Plus 6.0 软件计数每个视野下杯状细胞总数。
1.7 统计学方法
数据用 SPSS 17.0 软件统计分析，计量资料若符合正态分布用均数±标准差表示，组间比较用独立样本 t 检验，计量资料若不符合正态分布用中位数（下四分位数，上四分位数）表示，组间比较用 Mann-Whitney U 秩和检验。双侧检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 实验动物一般情况
整个实验过程中两组实验动物进食正常，监测体重无明显变化。无神经异常行为，无意外死亡。
2.2 苏木精-伊红染色结果
空白组肺组织支气管黏膜上皮完整，未见变性、坏死及脱落，支气管黏膜上皮纤毛未见粘连、变短及倒伏，黏膜腺体排列规则，未见增生及肥大，间质未见充血水肿及炎性细胞浸润；管腔内未见明显分泌物；管壁平滑肌连续、完整。与空白组对比，模型组黏膜上皮呈明显损伤性改变，上皮纤毛粘连、变短、倒伏甚至缺失，上皮细胞变性、坏死、脱落；偶见鳞状上皮化生；黏膜下腺体增生、肥大及黏液腺化生，杯状细胞明显增多；支气管壁各层组织充血、水肿，淋巴细胞、浆细胞浸润；严重者可见支气管壁平滑肌束断裂、萎缩。模型组实验鼠肺组织均呈现不同程度的上述损伤性变化，均造模成功。结合苏木精-伊红染色后的形态病理评分分级诊断标准，空白组评分为 0（0，1）分，模型组评分为 2（2，3）分，组间差异有统计学意义（Z=−6.422，P<0.001）。见图 1。
图1
两组大鼠肺组织病理形态（苏木精-伊红染色法）
a. 空白组 ×100；b. 模型组 ×100；c. 空白组 ×200；d. 模型组 ×200
2.3 免疫组织化学染色结果
NE 结果显示，空白组评分为 0（0，0）分，模型组评分为 2（2，3）分，组间差异有统计学意义（Z=−6.883，P<0.001）。MUC5AC 结果显示，空白组评分为 0（0，1）分，模型组评分为 2（2，2）分，组间差异有统计学意义（Z=−6.385，P<0.001）。见图 2、3。
图2
两组大鼠 NE 阳性表达情况（免疫组织化学染色法）
a. 空白组 ×100；b. 模型组 ×100；c. 空白组 ×200；d. 模型组 ×200
图3
两组大鼠 MUC5AC 阳性表达情况（免疫组织化学染色法）
a. 空白组 ×100；b. 模型组 ×100；c. 空白组 ×200；d. 模型组 ×200
2.4 爱显蓝-雪夫试剂染色结果
杯状细胞计数结果显示，空白组平均为（6.80±3.19）个，模型组平均为（57.93±7.79）个，组间差异有统计学意义（t=−44.267，P<0.001）。见图 4。
图4
两组大鼠杯状细胞数量情况（爱显蓝-雪夫试剂染色）
a. 空白组 ×100；b. 模型组 ×100；c. 空白组 ×200；d. 模型组 ×200
3 讨论
慢阻肺作为一种常见和多发的慢性病，以慢性炎症为主要特征，常与其他疾病共存[16-20]。截至目前，慢阻肺的确切病因尚不清楚，一般认为对慢性支气管炎和肺气肿有致病的因素都可能参与慢阻肺的发生发展。刘娅钦等[10]经过研究总结发现，炎症介质与细胞因子、蛋白酶与抗蛋白酶、氧化物与抗氧化物、自身抗体、肺泡隔自身凋亡及基因多态性均参与了慢阻肺的发生与发展，气道慢性炎症是慢阻肺的重要病理特征，而在此过程中，气道内黏液高分泌和中性粒细胞聚集是重要的病理生理基础，并与其结局和预后密切相关[21-22]。
NE 是中性粒细胞释放的炎症介质之一，是一种依赖金属离子才具有活性的降解酶，通过结合底物，进而降解细胞外基质中的各种蛋白[23-24]。血清中的 NE 在各种炎症性疾病条件下会增加[25]。有学者研究发现，在生理情况下，NE 能清除肺部病原菌，保护机体免受感染伤害，并保持肺内微环境的平衡稳定；当炎症发生时，中性粒细胞聚集，大量 NE 释放，其过度降解细胞外胶原及过度水解弹性蛋白，致使气道正常结构及纤毛上皮细胞的功能破坏，并诱导上皮内杯状细胞的化生及黏膜内腺体的增生，进而导致黏液过量分泌，造成气道的阻塞[26]。因此，黏液异常是许多呼吸系统疾病的特征，包括哮喘、囊性纤维化和慢阻肺[27]。而气道黏液是一种黏液弹性凝胶，主要由高分子量的黏液糖蛋白和水组成，对维持肺功能和健康具有重要作用，它主要由上皮内的杯状细胞及固有层的黏液腺分泌。黏蛋白是黏液的主要大分子成分，分为两大类：凝胶形成的分泌黏蛋白（即 MUC5AC）和膜栓系黏蛋白[28]。其中 MUC5AC 为高度糖基化的分泌黏蛋白，凭借其富含半胱氨酸的重复序列，可以形成分子间和分子内的二硫键，从而形成复杂的聚合物，进而在上皮细胞表面形成聚合物黏液凝胶的框架；它是一种具有多种功能的分子，包括对上皮细胞的屏障功能、宿主与病原体的相互作用、免疫细胞对癌前病变或恶性病变部位的吸引以及肿瘤进展等[29]。本研究通过观察实验动物支气管上皮的形态变化，结合爱显蓝-雪夫试剂染色，发现慢阻肺模型鼠杯状细胞数明显增多，同时通过免疫组织化学染色发现 NE 和 MUC5AC 的阳性表达模型组均高于空白组，这些结果与上述研究结果相同，究其原因从病理生理角度考虑，在炎症及其他致病因子的刺激下，中性粒细胞聚集并大量释放 NE，同时机体对其进行适应性改变，导致杯状细胞大量明显化生，进而 MUC5AC 分泌增加，气道黏液增加，阻力增加，这一系列病理过程导致出现呼吸窘迫等症状。此外，在进一步证实了慢阻肺病理性黏液高分泌理论基础的同时，设想如果把 NE 作为调控靶点，进而从机制上游抑制黏液高分泌，或许能更优地调控 MUC5AC。
综上，本研究显示，慢阻肺模型鼠的 NE 阳性表达增高，杯状细胞数量增多，MUC5AC 的阳性表达增加，黏液分泌增加。然而，鉴于本研究的实验对象仅为雄性大鼠，研究结果有一定的局限性，未来会在慢阻肺患者人群中进一步探讨 NE、MUC5AC 对慢阻肺的影响机制。在基因、分子研究日益常态化的今天，MUC5AC 正在成为各种恶性肿瘤的潜在诊断、治疗和预后靶点。在这种趋势下，未来通过分子领域找到突破口，多方位靶向抑制 MUC5AC 的高分泌，进而减轻患者的气道阻塞相关症状，提高患者生存质量，延长生存期，是未来的重要研究方向，并具有重要的临床意义。
