引用本文： 张静, 潘晓华, 刘国荣, 郭立志, 倪朝文, 王越, 于英英. 沉默 NLRP3 基因对促炎剂诱导大鼠脑微血管内皮细胞表达炎症因子的影响研究. 华西医学, 2022, 37(6): 855-862. doi: 10.7507/1002-0179.202205008 复制
NOD 样受体家族含 pyrin 结构域蛋白 3（NOD-like receptor family, pyrin domain containing protein 3，NLRP3）炎症小体是胞浆内模式识别受体[1]，表达于免疫细胞及内皮细胞等非免疫细胞[2]，可因线粒体功能障碍、活性氧产生、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）等触发而激活，并进一步激活下游炎症因子产生炎症反应[3-4]。脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cell，BMEC）表面具有很多独特的蛋白成分，是探索脑卒中发病机制、延缓脑动脉粥样硬化、构建血脑屏障模型等常用的细胞[5]，脑小血管病（cerebral small vessel disease，CSVD）就是一类发生于颅内由微小血管病变引起的综合征[6-7]。由炎性或免疫介导的慢性炎症在 CSVD 的发病机制中发挥着重要作用，然而相关的炎症反应通路证据不足，研究还有待深入。我们在前期临床试验中通过检测 CSVD 患者血清白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-18 的浓度，发现 IL-1β 表达明显升高（P<0.05），推测炎症因子 IL-1β 与 CSVD 的发病有相关性[8]；在细胞学实验中将体外分离培养的 BMEC 分为正常对照组、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激组和 LPS+ATP 共同刺激组，采用酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）对各组细胞进行检测，结果发现两种促炎剂 LPS+ATP 可诱导 BMEC 产生炎症因子 IL-1β 和 IL-18，且与正常对照组及 LPS 单独刺激组相比表达显著升高（P<0.05）[9]。为此我们在已有结论的支持下，并根据相关文献报道中的方法，结合 RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术，进一步研究 NLRP3 炎症小体相关通路在大鼠 BMEC 经促炎剂作用形成的 CSVD 细胞模型中的作用及调控机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物与材料
1.1.1 实验动物
12 只 4 周龄无特定病原体级雄性 Wistar 大鼠，体重（100±10）g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK（京）2019-0010。本研究通过内蒙古科技大学包头医学院动物伦理委员会批准。
1.1.2 药物及试剂
内皮细胞专用培养基套装（美国 ScicenCell 公司）；牛血清白蛋白（北京索莱宝科技有限公司）；鼠尾胶原蛋白Ⅰ型（北京索莱宝科技有限公司）；Ⅱ型胶原酶（美国 Sigma 公司）；胶原酶/分散酶（瑞士 Roche 公司）；DNA 酶Ⅰ（美国 Sigma 公司）；Ⅷ因子相关抗原（von Willebrand factor protein，vWF）抗体（美国 Proteintech 公司）；胶质细胞原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗体（美国 Proteintech 公司）；荧光 647 标记驴抗兔免疫球蛋白 G 抗体（美国 Biolegend 公司）；荧光 488 标记山羊抗兔免疫球蛋白 G（H+L）（北京中杉金桥生物技术有限公司）；兔抗-重组抗-NLRP3 抗体（英国 Abcam 公司）；兔抗-Caspase-1 抗体（美国 Proteintech 公司）；LPS（美国 Sigma 公司）；ATP 二钠盐水合物（美国 Sigma 公司）；Lipofectamine 2000（美国 Invitrogen 公司）；减血清培养基（含酚红）（美国 Invitrogen 公司）。
1.1.3 实验地点及仪器设备
实验地点：包头市中心医院神经内科实验室。以下设备均由该实验室提供：BC-J80S 二氧化碳细胞培养箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；IX73 奥林巴斯显微镜（日本奥林巴斯株式会社）；SCIENTZ-ⅡD 超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Centrifuge 5430R 高速冷冻离心机（德国 Eppendorf 公司）；Model 680 酶标仪（美国 Bio-Rad 公司）； ChemiDoctmXRS+凝胶成像仪（美国 Bio-Rad 公司）；PowerPac Universal 电泳仪（美国 Bio-Rad 公司）。
1.2 研究方法
1.2.1 大鼠 BMEC 体外分离培养及鉴定
取 12 只 4 周龄雄性 Wistar 大鼠，腹腔注射质量分数为 1% 的水合氯醛（0.5 mL/100 g），无菌条件下断头、取脑、剥离除大脑皮质外的其余组织，并用滤纸粘除软脑膜及大血管，漂洗、剪碎最终获得大小约 1 mm3 的组织。依次加入 0.1% 的Ⅱ型胶原酶、0.1% 的胶原酶/分散酶、2 kU/mL DNA 酶Ⅰ充分混匀并离心即获取脑微血管段，再根据不同种类细胞贴壁时间不同差速培养以去除杂质细胞，最终获得大鼠 BMEC。待细胞培养到第 4 代后进行免疫荧光鉴定。按照预先分组分别加入稀释的 1 mL vWF（1∶200）或 GFAP 溶液（1∶100），置于 4℃冰箱中孵育 8～12 h。再加入稀释的 1 mL 488 荧光染料（1∶300）或 647 荧光染料（1∶300），室温避光孵育 2 h 后染核，相差显微镜下观察。
1.2.2 细胞转染
采用小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）分子对 BMEC 内的特定基因 NLRP3 进行沉默。由于短发卡 RNA（short hairpin RNA，shRNA）分子能够通过质粒载体导入细胞，并利用细胞内的酶切机制得到 siRNA 而最终发挥 RNAi 作用，故我们选取质粒作为载体，借助于转染试剂 Lipofectamine 2000 将载有目的基因序列的 shRNA 分子导入 BMEC 中。为了便于对照，我们同时也对 BMEC 转染了未载有目的基因序列的质粒阴性对照，两种表达载体及基因序列均由苏州吉玛基因股份有限公司设计合成。将加入转染试剂的细胞继续培养 48 h 后给予促炎剂处理并进一步提取蛋白及 mRNA 检测 NLRP3 和 Caspase-1 的表达情况。序列如表1 所示。
表1
shRNA 和 shNC 表达载体基因序列
1.2.3 细胞分组及干预
正常培养的细胞分为空白对照组和 LPS+ATP 组（加入浓度为 1 μg/mL 的 LPS 于细胞培养箱内培养 5.5 h，再加入终浓度达 5 mmol/L 的 ATP 继续培养 0.5 h[10]）；RNAi 技术培养的细胞分为 siNC 组（未沉默目的基因）、siNLRP3 组（沉默目的基因）、siNC+LPS+ATP 组（未沉默目的基因及加促炎剂）和 siNLRP3+LPS+ATP 组（沉默目的基因及加促炎剂）。本研究各组均设置 6 个样本。
1.2.4 蛋白质印迹法检测 BMEC 中 NLRP3、Caspase-1 的蛋白表达水平
向细胞沉淀中加入含有蛋白酶抑制剂苯基甲烷磺酰氟化物的细胞裂解液（比例为 100∶1），经超声波粉碎得到蛋白样品溶液并测定浓度以保证每个泳道加入的体积中均含有 50 μg 蛋白质。采用蛋白质印迹法进行电泳、转模、封闭后敷抗体，其中甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）蛋白抗体稀释浓度为 1∶2000，NLRP3 抗体稀释浓度为 1∶500，Caspase-1 抗体稀释浓度为 1∶1000，辣根过氧化物酶标记的二抗稀释浓度为 1∶2000。将滴有超敏发光液的聚偏氟乙烯膜置于凝胶发光成像仪中曝光，拍照。用 Image J 软件进行灰度值分析。
1.2.5 实时聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）检测 BMEC 中 NLRP3、Caspase-1 的 mRNA 表达水平
根据 RNA 提取试剂盒步骤提取细胞 RNA 并测定浓度，逆转录合成互补 DNA 后通过 RT-PCR 检测各基因的相对表达量。对于获取的数据采用 ΔΔCt 法进行处理。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成，并进行 DNA 质谱检测，DNA 序列正确。各引物序列见表2。
表2
引物序列
1.3 统计学方法
应用 SPSS 25.0 统计软件进行分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两独立样本比较采用 t 检验；4 组样本均数间比较首先进行 Levene 方差齐性检验，若满足 P>0.10 则进行析因设计的方差分析，并采用 LSD 法进行单独效应的分析。不符合正态分布则以中位数（下四分位数，上四分位数）表示，两独立样本比较采用 Wilcoxon 秩和检验。双侧检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 大鼠 BMEC 的形态结构
分离培养 24 h 后可见脑微血管段呈“串珠状”贴壁出芽生长，周围长出内皮细胞（图1a）；48 h 后细胞团呈“岛屿状”，细胞集落扩大成团簇样分布（图1b）；72 h 后脑微血管段塌陷，细胞呈典型的“铺路石”样单层贴壁生长（图1c）；第 4～6 天在脑微血管段周围长出的内皮细胞越来越密集（图1d）；第 8～10 天 BMEC 汇合度达 80%，短缩形或“纺锤形”细胞形态明显，细胞核清晰可见，此为第 1 代 BMEC（图1e），可进行分瓶传代培养。第 1 次传代培养的细胞相互聚集呈“铺路石”或“旋涡状”，仍保持原代细胞的形态结构（图1f）。
图1
相差显微镜下观察细胞形态结构
a. 10 倍镜下观察脑微血管段分离培养 24 h 后呈“串珠状”； b. 10 倍镜下观察 BMEC 培养 48 h 后呈“岛屿状”细胞团；c. 4 倍镜下观察 BMEC 培养 72 h 后呈“铺路石”样单层贴壁生长；d. 4 倍镜下观察 BMEC 培养 4～6 d 后细胞越来越密集；e. 10 倍镜下观察培养 8～10 d 后的第 1 代 BMEC，细胞呈短缩形或“纺锤形”，细胞核清晰可见；f. 4 倍镜下观察第 1 次传代培养的细胞呈“铺路石”或“旋涡状”，仍保持原代细胞的形态结构
2.2 vWF 免疫荧光染色
绿色荧光标记 BMEC 表面 vWF 96% 以上细胞均被标记为绿色，红色荧光标记 GFAP 蛋白表达可见零星几点，本次提取的 BMEC 纯度达 96%，免疫荧光染色后镜下观察细胞形态见图2。
图2
BMEC 经过免疫荧光染色后相差显微镜 10 倍镜下观察细胞形态结构
绿色荧光标记的为 BMEC；红色荧光标记的为星形胶质细胞，可见零星几点
2.3 NLRP3、Caspase-1 的表达水平
2.3.1 正常培养的细胞
NLRP3、Caspase-1 的蛋白及 mRNA 相对表达量在 LPS+ATP 组均较空白对照组升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3、表3。
图3
正常培养大鼠 BMEC NLRP3、Caspase-1 的蛋白表达条带
表3
空白对照组与 LPS+ATP 组 NLRP3、Caspase-1 相对表达水平比较（n=6）
2.3.2 RNAi 技术培养的细胞
对于 NLRP3、Caspase-1 的蛋白和 mRNA 相对表达量，给予转染质粒和促炎剂干预的主效应均有统计学意义（P<0.05）；对于 NLRP3、Caspase-1 的 mRNA 相对表达量，转染质粒和促炎剂干预的交互效应有统计学意义（P<0.05）。NLRP3、Caspase-1 的蛋白及 mRNA 相对表达量两两比较结果显示，siNLRP3 组较 siNC 组、siNLRP3+LPS+ATP 组较 siNC+LPS+ATP 组表达量均降低（P<0.05），siNC+LPS+ATP 组较 siNC 组、siNLRP3+LPS+ATP 组较 siNLRP3 组表达量均升高（P<0.05）。见表4、5，图4。
图4
RNAi 培养大鼠 BMEC NLRP3、Caspase-1 的蛋白表达条带
表4
RNAi 培养的 BMEC 蛋白相对表达水平比较（n=6，
）
表5
RNAi 培养的 BMEC mRNA 相对表达水平比较（n=6，
）
3 讨论
BMEC 处在一个流动性的液体环境中，在脑的代谢及限制血液中物质进出等方面发挥关键作用，近年来越来越多的研究强调了 BMEC 在中枢神经系统中的重要地位。Wang 等[11]研究指出，大脑内血液流动过程中产生的流体剪切应力能够作用于 BMEC 促进其分化并进一步完善脑内的屏障功能，这种生理性的血流动力能够抑制炎症信号的传递和稳定细胞的形态结构，然而对于脑动脉疾病血管搭桥术后的患者，因超出生理范围的流体剪切应力作用而造成 BMEC 的损伤最终导致脑出血。LPS 是革兰阴性细菌细胞壁中的一种成分，可对 BMEC 造成损伤进而促进脑血管炎症的发生及发展，故常用于诱导神经炎症模型[12-13]。有研究指出，处于有氧条件下的液体环境中的 BMEC 其表面具有的药物代谢酶也能发挥和肝细胞类似的代谢能力，是阻止药物在组织间进行转移的重要代谢屏障[14]。由于脑部微小血管病变能够导致 CSVD 的发生，同样的我们的实验提取了大鼠大脑皮质的 BMEC 为研究对象进一步探索 CSVD 基于脑部微血管病变的发病机制。
而对于 BMEC 的体外分离培养方法，近年来在逐步的改进以求获取精细的、杂质含量少的细胞结构。王义宝等[15]对提取 Wistar 胎鼠的脑组织进行玻璃匀浆器捣碎，使用 15% 葡聚糖溶液进行高速梯度离心后再给予胶原酶消化而获得 BMEC，完成了大鼠 BMEC 体外培养的初步探索，并指出随着原代细胞传代次数的增加其屏障特性逐渐减弱。鹿文葆等[16]对于体外提取的大鼠大脑组织首先使用滤纸吸附软脑膜和大血管，后采用机械剪碎法将大脑皮质剪碎成约 1 mm3 大小的组织，再给予Ⅱ型胶原酶、胶原酶/分散酶和 DNA 酶Ⅰ联合消化去除多余的蛋白成分，使用含有机溶剂的 Percoll 细胞分离液连续梯度离心，最终获得了纯度较高的大鼠 BMEC，避免了匀浆捣碎对微血管活力的损伤。同样，徐平湘等[17]对大鼠 BMEC 的分离过程采用了 3 种酶联合消化大脑皮质的方法，并根据不同细胞类型的贴壁时间不同，采用差速贴壁培养法最终获取纯度较高的大鼠 BMEC，替代了以前的匀浆器匀浆及有机溶剂离心的方法，进一步减少对脑微血管段的机械损伤。我们的实验即采用 3 种酶联合消化、差速贴壁培养的方法并最终获得纯度较高的 BMEC。显微镜下所观察到的细胞形态结构与相关文献报道中的细胞特征类似[15-18]，且传代细胞仍然保持原代细胞的特性，BMEC 的成功提取是后续实验的前提和基础。
我们的研究对提取的 BMEC 给予促炎剂 LPS+ATP 诱导，初步构建了 CSVD 的炎性细胞模型，基于课题小组前期细胞实验初步得出的结论[9]，即两种促炎剂 LPS+ATP 可诱导 BMEC 产生炎症因子 IL-1β 和 IL-18，为了进一步验证 NLRP3 炎症小体也参与促炎剂诱导 BMEC 的炎症反应过程，我们首先采用蛋白质印迹法和 RT-PCR 两种技术，对未经药物干预处理的细胞和经 LPS+ATP 干预处理的细胞分别检测了 NLRP3 和下游炎症因子 Caspase-1 的表达，结果与预期结果相吻合。这与刘蓓桦等[10]通过对小鼠巨噬细胞给予 LPS+ATP 共同刺激后采用 RT-PCR 和 ELISA 技术检测 NLRP3、Caspase-1 及 IL-1β 的结果相一致。卢晓星等[19]使用 LPS 与 ATP 联合诱导小鼠小胶质细胞后，发现细胞存活率明显降低，细胞上清液中乳酸脱氢酶活力显著升高，即 LPS+ATP 可以改变细胞膜的完整性，加重细胞的损伤；采用蛋白质印迹法和 ELISA 技术检测 NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和 IL-18 其表达明显升高。故促炎剂 LPS 和 ATP 联合诱导能够产生 NLRP3 炎症小体，并进一步促进下游炎症因子 Caspase-1 的释放。
在对大鼠 BMEC 给予 siRNA NLRP3 下调 NLRP3 的表达，经促炎剂 LPS+ATP 诱导后发现，siNLRP3+LPS+ATP 组与 siNLRP3 组相比 NLRP3 炎症小体及下游炎症因子 Caspase-1 的表达升高，转染质粒阴性对照的 siNC+LPS+ATP 组与 siNC 组相比 NLRP3 及 Caspase-1 的表达升高，说明促炎剂 LPS+ATP 能够诱导大鼠 BMEC 产生炎症因子，与未经转染的 BMEC 通过蛋白质印迹法和 RT-PCR 技术检测的结果一致。siNLRP3 组与 siNC 组相比 NLRP3 及 Caspase-1 的表达降低，siNLRP3+LPS+ATP 组与 siNC+LPS+ATP 组相比 NLRP3 及 Caspase-1 的表达降低，说明 BMEC 经过 RNAi 技术沉默 NLRP3 基因表达后，给予促炎剂 LPS+ATP 和不给予促炎剂进行干预都能降低 NLRP3 的产生，同时也进一步抑制下游炎症因子 Caspase-1 的释放，符合 NLRP3 炎症小体信号通路参与炎症反应过程的特点。由于我们在转染过程中未检测细胞的存活及凋亡，也不除外转染后一部分新生细胞在经过促炎剂诱导而产生炎症因子，但是对转染后的沉默基因组和质粒阴性对照组再次给予促炎剂诱导后检测 NLRP3、Caspase-1 的表达差异明显，说明了沉默 NLRP3 基因表达进而抑制炎症因子产生的效果显著。
本实验在这一步得出的结论与相关文献报道的相似研究得出的结论类似。李钰婷等[20]对野生型 C57BL/6 小鼠和 NLRP3 基因敲除小鼠先后给予 Triton-WR1339、芹菜素灌胃处理后，发现基因敲除小鼠给予芹菜素后血清生化指标总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白均明显降低，高密度脂蛋白明显升高；而 NLRP3 炎症小体的相关炎性指标 IL-1β、IL-6 也显著降低，说明 NLRP3 炎症小体能够干预芹菜素的降脂疗效。薛鸿等[21]对人肺动脉内皮细胞给予沉默 NLRP3 基因表达后，加用香烟烟雾提取物诱导内皮细胞的凋亡发现，其细胞存活率较未给予沉默基因表达的阴性对照组明显增加；对人肺动脉内皮细胞给予香烟烟雾提取物，再加用乙酰半胱氨酸处理后发现，与未加用乙酰半胱氨酸处理的细胞相比，其炎症因子 NLRP3、Caspase-1 的表达明显下降。即这一提取物能够导致人肺动脉内皮细胞发生凋亡并产生炎症，经过沉默 NLRP3 基因的表达，或是给予乙酰半胱氨酸处理后这种损伤作用可进一步减轻。
总之，我们的实验结果进一步证实促炎剂 LPS+ATP 共同诱导能够促进大鼠 BMEC 中 NLRP3 炎症小体和下游炎症因子 Caspase-1 的释放；沉默 NLRP3 基因表达能够降低大鼠 BMEC 经促炎剂 LPS+ATP 诱导产生 NLRP3 炎症小体及下游炎症因子 Caspase-1。NLRP3 炎症小体信号通路可能在大鼠 BMEC 经促炎剂作用形成的 CSVD 细胞模型中发挥作用。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
NOD 样受体家族含 pyrin 结构域蛋白 3（NOD-like receptor family, pyrin domain containing protein 3，NLRP3）炎症小体是胞浆内模式识别受体[1]，表达于免疫细胞及内皮细胞等非免疫细胞[2]，可因线粒体功能障碍、活性氧产生、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）等触发而激活，并进一步激活下游炎症因子产生炎症反应[3-4]。脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cell，BMEC）表面具有很多独特的蛋白成分，是探索脑卒中发病机制、延缓脑动脉粥样硬化、构建血脑屏障模型等常用的细胞[5]，脑小血管病（cerebral small vessel disease，CSVD）就是一类发生于颅内由微小血管病变引起的综合征[6-7]。由炎性或免疫介导的慢性炎症在 CSVD 的发病机制中发挥着重要作用，然而相关的炎症反应通路证据不足，研究还有待深入。我们在前期临床试验中通过检测 CSVD 患者血清白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-18 的浓度，发现 IL-1β 表达明显升高（P<0.05），推测炎症因子 IL-1β 与 CSVD 的发病有相关性[8]；在细胞学实验中将体外分离培养的 BMEC 分为正常对照组、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激组和 LPS+ATP 共同刺激组，采用酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）对各组细胞进行检测，结果发现两种促炎剂 LPS+ATP 可诱导 BMEC 产生炎症因子 IL-1β 和 IL-18，且与正常对照组及 LPS 单独刺激组相比表达显著升高（P<0.05）[9]。为此我们在已有结论的支持下，并根据相关文献报道中的方法，结合 RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术，进一步研究 NLRP3 炎症小体相关通路在大鼠 BMEC 经促炎剂作用形成的 CSVD 细胞模型中的作用及调控机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物与材料
1.1.1 实验动物
12 只 4 周龄无特定病原体级雄性 Wistar 大鼠，体重（100±10）g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK（京）2019-0010。本研究通过内蒙古科技大学包头医学院动物伦理委员会批准。
1.1.2 药物及试剂
内皮细胞专用培养基套装（美国 ScicenCell 公司）；牛血清白蛋白（北京索莱宝科技有限公司）；鼠尾胶原蛋白Ⅰ型（北京索莱宝科技有限公司）；Ⅱ型胶原酶（美国 Sigma 公司）；胶原酶/分散酶（瑞士 Roche 公司）；DNA 酶Ⅰ（美国 Sigma 公司）；Ⅷ因子相关抗原（von Willebrand factor protein，vWF）抗体（美国 Proteintech 公司）；胶质细胞原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗体（美国 Proteintech 公司）；荧光 647 标记驴抗兔免疫球蛋白 G 抗体（美国 Biolegend 公司）；荧光 488 标记山羊抗兔免疫球蛋白 G（H+L）（北京中杉金桥生物技术有限公司）；兔抗-重组抗-NLRP3 抗体（英国 Abcam 公司）；兔抗-Caspase-1 抗体（美国 Proteintech 公司）；LPS（美国 Sigma 公司）；ATP 二钠盐水合物（美国 Sigma 公司）；Lipofectamine 2000（美国 Invitrogen 公司）；减血清培养基（含酚红）（美国 Invitrogen 公司）。
1.1.3 实验地点及仪器设备
实验地点：包头市中心医院神经内科实验室。以下设备均由该实验室提供：BC-J80S 二氧化碳细胞培养箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；IX73 奥林巴斯显微镜（日本奥林巴斯株式会社）；SCIENTZ-ⅡD 超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Centrifuge 5430R 高速冷冻离心机（德国 Eppendorf 公司）；Model 680 酶标仪（美国 Bio-Rad 公司）； ChemiDoctmXRS+凝胶成像仪（美国 Bio-Rad 公司）；PowerPac Universal 电泳仪（美国 Bio-Rad 公司）。
1.2 研究方法
1.2.1 大鼠 BMEC 体外分离培养及鉴定
取 12 只 4 周龄雄性 Wistar 大鼠，腹腔注射质量分数为 1% 的水合氯醛（0.5 mL/100 g），无菌条件下断头、取脑、剥离除大脑皮质外的其余组织，并用滤纸粘除软脑膜及大血管，漂洗、剪碎最终获得大小约 1 mm3 的组织。依次加入 0.1% 的Ⅱ型胶原酶、0.1% 的胶原酶/分散酶、2 kU/mL DNA 酶Ⅰ充分混匀并离心即获取脑微血管段，再根据不同种类细胞贴壁时间不同差速培养以去除杂质细胞，最终获得大鼠 BMEC。待细胞培养到第 4 代后进行免疫荧光鉴定。按照预先分组分别加入稀释的 1 mL vWF（1∶200）或 GFAP 溶液（1∶100），置于 4℃冰箱中孵育 8～12 h。再加入稀释的 1 mL 488 荧光染料（1∶300）或 647 荧光染料（1∶300），室温避光孵育 2 h 后染核，相差显微镜下观察。
1.2.2 细胞转染
采用小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）分子对 BMEC 内的特定基因 NLRP3 进行沉默。由于短发卡 RNA（short hairpin RNA，shRNA）分子能够通过质粒载体导入细胞，并利用细胞内的酶切机制得到 siRNA 而最终发挥 RNAi 作用，故我们选取质粒作为载体，借助于转染试剂 Lipofectamine 2000 将载有目的基因序列的 shRNA 分子导入 BMEC 中。为了便于对照，我们同时也对 BMEC 转染了未载有目的基因序列的质粒阴性对照，两种表达载体及基因序列均由苏州吉玛基因股份有限公司设计合成。将加入转染试剂的细胞继续培养 48 h 后给予促炎剂处理并进一步提取蛋白及 mRNA 检测 NLRP3 和 Caspase-1 的表达情况。序列如表1 所示。
表1
shRNA 和 shNC 表达载体基因序列
1.2.3 细胞分组及干预
正常培养的细胞分为空白对照组和 LPS+ATP 组（加入浓度为 1 μg/mL 的 LPS 于细胞培养箱内培养 5.5 h，再加入终浓度达 5 mmol/L 的 ATP 继续培养 0.5 h[10]）；RNAi 技术培养的细胞分为 siNC 组（未沉默目的基因）、siNLRP3 组（沉默目的基因）、siNC+LPS+ATP 组（未沉默目的基因及加促炎剂）和 siNLRP3+LPS+ATP 组（沉默目的基因及加促炎剂）。本研究各组均设置 6 个样本。
1.2.4 蛋白质印迹法检测 BMEC 中 NLRP3、Caspase-1 的蛋白表达水平
向细胞沉淀中加入含有蛋白酶抑制剂苯基甲烷磺酰氟化物的细胞裂解液（比例为 100∶1），经超声波粉碎得到蛋白样品溶液并测定浓度以保证每个泳道加入的体积中均含有 50 μg 蛋白质。采用蛋白质印迹法进行电泳、转模、封闭后敷抗体，其中甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）蛋白抗体稀释浓度为 1∶2000，NLRP3 抗体稀释浓度为 1∶500，Caspase-1 抗体稀释浓度为 1∶1000，辣根过氧化物酶标记的二抗稀释浓度为 1∶2000。将滴有超敏发光液的聚偏氟乙烯膜置于凝胶发光成像仪中曝光，拍照。用 Image J 软件进行灰度值分析。
1.2.5 实时聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）检测 BMEC 中 NLRP3、Caspase-1 的 mRNA 表达水平
根据 RNA 提取试剂盒步骤提取细胞 RNA 并测定浓度，逆转录合成互补 DNA 后通过 RT-PCR 检测各基因的相对表达量。对于获取的数据采用 ΔΔCt 法进行处理。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成，并进行 DNA 质谱检测，DNA 序列正确。各引物序列见表2。
表2
引物序列
1.3 统计学方法
应用 SPSS 25.0 统计软件进行分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两独立样本比较采用 t 检验；4 组样本均数间比较首先进行 Levene 方差齐性检验，若满足 P>0.10 则进行析因设计的方差分析，并采用 LSD 法进行单独效应的分析。不符合正态分布则以中位数（下四分位数，上四分位数）表示，两独立样本比较采用 Wilcoxon 秩和检验。双侧检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 大鼠 BMEC 的形态结构
分离培养 24 h 后可见脑微血管段呈“串珠状”贴壁出芽生长，周围长出内皮细胞（图1a）；48 h 后细胞团呈“岛屿状”，细胞集落扩大成团簇样分布（图1b）；72 h 后脑微血管段塌陷，细胞呈典型的“铺路石”样单层贴壁生长（图1c）；第 4～6 天在脑微血管段周围长出的内皮细胞越来越密集（图1d）；第 8～10 天 BMEC 汇合度达 80%，短缩形或“纺锤形”细胞形态明显，细胞核清晰可见，此为第 1 代 BMEC（图1e），可进行分瓶传代培养。第 1 次传代培养的细胞相互聚集呈“铺路石”或“旋涡状”，仍保持原代细胞的形态结构（图1f）。
图1
相差显微镜下观察细胞形态结构
a. 10 倍镜下观察脑微血管段分离培养 24 h 后呈“串珠状”； b. 10 倍镜下观察 BMEC 培养 48 h 后呈“岛屿状”细胞团；c. 4 倍镜下观察 BMEC 培养 72 h 后呈“铺路石”样单层贴壁生长；d. 4 倍镜下观察 BMEC 培养 4～6 d 后细胞越来越密集；e. 10 倍镜下观察培养 8～10 d 后的第 1 代 BMEC，细胞呈短缩形或“纺锤形”，细胞核清晰可见；f. 4 倍镜下观察第 1 次传代培养的细胞呈“铺路石”或“旋涡状”，仍保持原代细胞的形态结构
2.2 vWF 免疫荧光染色
绿色荧光标记 BMEC 表面 vWF 96% 以上细胞均被标记为绿色，红色荧光标记 GFAP 蛋白表达可见零星几点，本次提取的 BMEC 纯度达 96%，免疫荧光染色后镜下观察细胞形态见图2。
图2
BMEC 经过免疫荧光染色后相差显微镜 10 倍镜下观察细胞形态结构
绿色荧光标记的为 BMEC；红色荧光标记的为星形胶质细胞，可见零星几点
2.3 NLRP3、Caspase-1 的表达水平
2.3.1 正常培养的细胞
NLRP3、Caspase-1 的蛋白及 mRNA 相对表达量在 LPS+ATP 组均较空白对照组升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3、表3。
图3
正常培养大鼠 BMEC NLRP3、Caspase-1 的蛋白表达条带
表3
空白对照组与 LPS+ATP 组 NLRP3、Caspase-1 相对表达水平比较（n=6）
2.3.2 RNAi 技术培养的细胞
对于 NLRP3、Caspase-1 的蛋白和 mRNA 相对表达量，给予转染质粒和促炎剂干预的主效应均有统计学意义（P<0.05）；对于 NLRP3、Caspase-1 的 mRNA 相对表达量，转染质粒和促炎剂干预的交互效应有统计学意义（P<0.05）。NLRP3、Caspase-1 的蛋白及 mRNA 相对表达量两两比较结果显示，siNLRP3 组较 siNC 组、siNLRP3+LPS+ATP 组较 siNC+LPS+ATP 组表达量均降低（P<0.05），siNC+LPS+ATP 组较 siNC 组、siNLRP3+LPS+ATP 组较 siNLRP3 组表达量均升高（P<0.05）。见表4、5，图4。
图4
RNAi 培养大鼠 BMEC NLRP3、Caspase-1 的蛋白表达条带
表4
RNAi 培养的 BMEC 蛋白相对表达水平比较（n=6，）
表5
RNAi 培养的 BMEC mRNA 相对表达水平比较（n=6，）
3 讨论
BMEC 处在一个流动性的液体环境中，在脑的代谢及限制血液中物质进出等方面发挥关键作用，近年来越来越多的研究强调了 BMEC 在中枢神经系统中的重要地位。Wang 等[11]研究指出，大脑内血液流动过程中产生的流体剪切应力能够作用于 BMEC 促进其分化并进一步完善脑内的屏障功能，这种生理性的血流动力能够抑制炎症信号的传递和稳定细胞的形态结构，然而对于脑动脉疾病血管搭桥术后的患者，因超出生理范围的流体剪切应力作用而造成 BMEC 的损伤最终导致脑出血。LPS 是革兰阴性细菌细胞壁中的一种成分，可对 BMEC 造成损伤进而促进脑血管炎症的发生及发展，故常用于诱导神经炎症模型[12-13]。有研究指出，处于有氧条件下的液体环境中的 BMEC 其表面具有的药物代谢酶也能发挥和肝细胞类似的代谢能力，是阻止药物在组织间进行转移的重要代谢屏障[14]。由于脑部微小血管病变能够导致 CSVD 的发生，同样的我们的实验提取了大鼠大脑皮质的 BMEC 为研究对象进一步探索 CSVD 基于脑部微血管病变的发病机制。
而对于 BMEC 的体外分离培养方法，近年来在逐步的改进以求获取精细的、杂质含量少的细胞结构。王义宝等[15]对提取 Wistar 胎鼠的脑组织进行玻璃匀浆器捣碎，使用 15% 葡聚糖溶液进行高速梯度离心后再给予胶原酶消化而获得 BMEC，完成了大鼠 BMEC 体外培养的初步探索，并指出随着原代细胞传代次数的增加其屏障特性逐渐减弱。鹿文葆等[16]对于体外提取的大鼠大脑组织首先使用滤纸吸附软脑膜和大血管，后采用机械剪碎法将大脑皮质剪碎成约 1 mm3 大小的组织，再给予Ⅱ型胶原酶、胶原酶/分散酶和 DNA 酶Ⅰ联合消化去除多余的蛋白成分，使用含有机溶剂的 Percoll 细胞分离液连续梯度离心，最终获得了纯度较高的大鼠 BMEC，避免了匀浆捣碎对微血管活力的损伤。同样，徐平湘等[17]对大鼠 BMEC 的分离过程采用了 3 种酶联合消化大脑皮质的方法，并根据不同细胞类型的贴壁时间不同，采用差速贴壁培养法最终获取纯度较高的大鼠 BMEC，替代了以前的匀浆器匀浆及有机溶剂离心的方法，进一步减少对脑微血管段的机械损伤。我们的实验即采用 3 种酶联合消化、差速贴壁培养的方法并最终获得纯度较高的 BMEC。显微镜下所观察到的细胞形态结构与相关文献报道中的细胞特征类似[15-18]，且传代细胞仍然保持原代细胞的特性，BMEC 的成功提取是后续实验的前提和基础。
我们的研究对提取的 BMEC 给予促炎剂 LPS+ATP 诱导，初步构建了 CSVD 的炎性细胞模型，基于课题小组前期细胞实验初步得出的结论[9]，即两种促炎剂 LPS+ATP 可诱导 BMEC 产生炎症因子 IL-1β 和 IL-18，为了进一步验证 NLRP3 炎症小体也参与促炎剂诱导 BMEC 的炎症反应过程，我们首先采用蛋白质印迹法和 RT-PCR 两种技术，对未经药物干预处理的细胞和经 LPS+ATP 干预处理的细胞分别检测了 NLRP3 和下游炎症因子 Caspase-1 的表达，结果与预期结果相吻合。这与刘蓓桦等[10]通过对小鼠巨噬细胞给予 LPS+ATP 共同刺激后采用 RT-PCR 和 ELISA 技术检测 NLRP3、Caspase-1 及 IL-1β 的结果相一致。卢晓星等[19]使用 LPS 与 ATP 联合诱导小鼠小胶质细胞后，发现细胞存活率明显降低，细胞上清液中乳酸脱氢酶活力显著升高，即 LPS+ATP 可以改变细胞膜的完整性，加重细胞的损伤；采用蛋白质印迹法和 ELISA 技术检测 NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和 IL-18 其表达明显升高。故促炎剂 LPS 和 ATP 联合诱导能够产生 NLRP3 炎症小体，并进一步促进下游炎症因子 Caspase-1 的释放。
在对大鼠 BMEC 给予 siRNA NLRP3 下调 NLRP3 的表达，经促炎剂 LPS+ATP 诱导后发现，siNLRP3+LPS+ATP 组与 siNLRP3 组相比 NLRP3 炎症小体及下游炎症因子 Caspase-1 的表达升高，转染质粒阴性对照的 siNC+LPS+ATP 组与 siNC 组相比 NLRP3 及 Caspase-1 的表达升高，说明促炎剂 LPS+ATP 能够诱导大鼠 BMEC 产生炎症因子，与未经转染的 BMEC 通过蛋白质印迹法和 RT-PCR 技术检测的结果一致。siNLRP3 组与 siNC 组相比 NLRP3 及 Caspase-1 的表达降低，siNLRP3+LPS+ATP 组与 siNC+LPS+ATP 组相比 NLRP3 及 Caspase-1 的表达降低，说明 BMEC 经过 RNAi 技术沉默 NLRP3 基因表达后，给予促炎剂 LPS+ATP 和不给予促炎剂进行干预都能降低 NLRP3 的产生，同时也进一步抑制下游炎症因子 Caspase-1 的释放，符合 NLRP3 炎症小体信号通路参与炎症反应过程的特点。由于我们在转染过程中未检测细胞的存活及凋亡，也不除外转染后一部分新生细胞在经过促炎剂诱导而产生炎症因子，但是对转染后的沉默基因组和质粒阴性对照组再次给予促炎剂诱导后检测 NLRP3、Caspase-1 的表达差异明显，说明了沉默 NLRP3 基因表达进而抑制炎症因子产生的效果显著。
本实验在这一步得出的结论与相关文献报道的相似研究得出的结论类似。李钰婷等[20]对野生型 C57BL/6 小鼠和 NLRP3 基因敲除小鼠先后给予 Triton-WR1339、芹菜素灌胃处理后，发现基因敲除小鼠给予芹菜素后血清生化指标总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白均明显降低，高密度脂蛋白明显升高；而 NLRP3 炎症小体的相关炎性指标 IL-1β、IL-6 也显著降低，说明 NLRP3 炎症小体能够干预芹菜素的降脂疗效。薛鸿等[21]对人肺动脉内皮细胞给予沉默 NLRP3 基因表达后，加用香烟烟雾提取物诱导内皮细胞的凋亡发现，其细胞存活率较未给予沉默基因表达的阴性对照组明显增加；对人肺动脉内皮细胞给予香烟烟雾提取物，再加用乙酰半胱氨酸处理后发现，与未加用乙酰半胱氨酸处理的细胞相比，其炎症因子 NLRP3、Caspase-1 的表达明显下降。即这一提取物能够导致人肺动脉内皮细胞发生凋亡并产生炎症，经过沉默 NLRP3 基因的表达，或是给予乙酰半胱氨酸处理后这种损伤作用可进一步减轻。
总之，我们的实验结果进一步证实促炎剂 LPS+ATP 共同诱导能够促进大鼠 BMEC 中 NLRP3 炎症小体和下游炎症因子 Caspase-1 的释放；沉默 NLRP3 基因表达能够降低大鼠 BMEC 经促炎剂 LPS+ATP 诱导产生 NLRP3 炎症小体及下游炎症因子 Caspase-1。NLRP3 炎症小体信号通路可能在大鼠 BMEC 经促炎剂作用形成的 CSVD 细胞模型中发挥作用。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
