肺部感染的发病率与病死率在世界感染性疾病中处于高位，快速准确的病原学诊断是进行及时且有效治疗的关键。宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技术突破了传统病原微生物检测方法的局限，提高了病原体的检出率。该文对 mNGS 技术在肺部的细菌、真菌、病毒及混合感染诊断中的应用及优势进行分析，并对其在 RNA 检测、厚壁菌破壁及宿主 DNA 清除等方面面临的挑战和突破进行阐述，以期通过 mNGS 实现靶向、精准的病原学诊断，从而有效治疗肺部感染。
引用本文： 赵泽玉, 王慧. 宏基因组二代测序在肺部感染诊断中的应用与挑战. 华西医学, 2022, 37(8): 1231-1237. doi: 10.7507/1002-0179.202205127 复制
肺部感染是指细菌、病毒及真菌等各类病原体引起的气管、支气管和肺实质的感染。肺部感染在世界范围内仍是高发病率和高病死率的一种感染性疾病[1]，快速准确地检测出病原体对于指导临床用药至关重要。传统病原微生物检测方法在时效性、特异度、灵敏度等方面均不能满足临床需求，而随着基因测序技术和生物信息学方法的进步，宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技术越来越多地应用于肺部感染性疾病的诊治中。1977 年，Sanger 等[2]发明了第一代测序技术，称为 Sanger 测序法，使得基因测序成为可能。2005 年，基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统 Genome Sequencer 20 System 被 Nature 报道，开创了新一代测序的先河[3]。2008 年 Palacios 等[4]利用 mNGS 发现了沙粒病毒，2011 年 Xu 等[5]利用 mNGS 发现了新型布尼亚病毒，开启了 mNGS 技术在临床感染中应用的先例。2014 年，mNGS 应用于一名患有严重联合免疫缺陷的 14 岁男孩，诊断出神经系统钩端螺旋体感染，在予以对应抗菌药物治疗后，患者状态恢复至接近病前；此次应用掀起了 mNGS 技术在病原微生物鉴定领域，尤其是疑难微生物鉴定方面的应用热潮[6]。2018 年，Miao 等[7]回顾性分析了 2017 年 4 月－12 月在复旦大学附属中山医院发生的 561 例疑似急性或慢性感染病例，比较了 mNGS 和传统培养方法在病原体诊断效能方面的差异，结果显示 mNGS 在病原体识别方面具有更高的灵敏度。至此以后，mNGS 在国内的临床应用迅速发展起来。研究显示，mNGS 技术可检出的病原体已覆盖了较大范围的细菌、真菌、病毒、寄生虫等病原微生物，这为肺部感染性疾病的精确诊断作出了重大贡献[8]。但 mNGS 同时存在诸如污染菌干扰、厚壁菌破壁困难、RNA 检测困难及宿主 DNA 干扰等问题。本文将对 mNGS 在肺部感染性疾病诊治方面的应用情况、研究进展，以及面临的挑战进行综述。
1 mNGS 技术的优势
mNGS 即病原宏基因组学技术，它不依赖于传统微生物培养，而是直接提取标本中的全部核酸进行高通量测序，通过对生物信息的分析，去除人源序列后，将筛选出的数据与病原数据库进行比对，获得疑似致病微生物的种属信息。mNGS 具有无偏倚、广覆盖、高灵敏度和速度快的特点[9]。与 mNGS 检测技术相比，微生物培养、镜下涂片、组织病理学等传统检测技术有检测时间久、阳性率低和可检病原体种类有限等局限[10]。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术较传统微生物检测方法更快速、灵敏，但其必须基于已知病原体的基因序列，且假阳性或假阴性概率较高[11]。mNGS 可测出样本中所有微生物，而不似 PCR 只有单一靶标，同时无需提前获悉待测病原体的序列信息。mNGS 可弥补 PCR 的缺点，并能监测病毒传播过程中可能的变异，同时对于部分病毒含量较低的样本，mNGS 可提高检测阳性率[12]。mNGS 也可在病原培养后做深度的二代测序，甚至全基因组分析，为预防以后同类型传染病的暴发积累经验。除了病原体鉴定，mNGS 还可提供额外基因组信息用于呼吸道微生物组分析、人类宿主反应分析和耐药性预测，所有这些都更有利于对患者的临床干预。mNGS 还具有不易受抗生素暴露影响的优势。有研究指出，在未接触抗生素治疗的患者中，mNGS 与培养之间的灵敏度没有显著差异（43.3% vs. 36.7%，P=0.1）；然而，在有抗生素暴露史患者中，mNGS 的灵敏度显著高于培养（52.7% vs. 34.4%，P<0.01）[7]。
2 mNGS 相关肺部感染诊断标本的选择
不同类型的肺部感染性疾病，病原微生物的分布不同。mNGS 相关肺部感染标本的选择具有多样性，如痰液、血液、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）、经支气管镜肺活检术（transbronchial lung biopsy，TBLB）标本、支气管刷检标本等均可作为检测样本[13]。痰标本是肺部感染患者的常规检查项目，但是痰标本需要经呼吸道咳出，这样会带入大量的口腔定植菌，从而干扰检测结果。深部痰可一定程度避免口腔定植菌污染，但仅适用于气管插管的危重患者。BALF、TBLB 及支气管刷检标本等皆经支气管镜获得，尽管上呼吸道定植菌对此类标本的干扰较痰标本小，但仍不能完全避免干扰。为了尽可能减少上呼吸道定植菌的干扰，在开始使用纤维支气管镜之前，患者应在医护人员的指导下先用无菌生理盐水漱口，减少口腔污染菌的数量，如有假牙应先摘掉。另外，应采用保护性支气管肺泡灌洗技术，勿从支气管镜的工作腔中吸取灌洗液标本，也能有效避免上呼吸道菌群的污染；标本采集顺序为支气管灌洗液、BALF、毛刷标本和活检标本，应避免带血[14]。BALF 标本位于深部肺组织，人源性核酸含量低，对结果干扰最小，对深部肺部感染有较好的代表性，故其在肺部感染的标本选择中常排在首要位置，研究也显示 BALF 标本的 mNGS 检测效率优于传统培养方法[8, 15-17]。Wang 等[18]使用 mNGS 检测了 39 例疑似感染性外周肺病变患者的 BALF、TBLB 和支气管刷检标本中的病原体，结果显示对于上述 3 类标本中的细菌和真菌检测，mNGS 比传统培养方法更灵敏，但三者之间 mNGS 检测灵敏度没有显著差异。重症肺炎患者常并发血流感染，外周血的采集过程不受口腔定植菌的干扰，且采集方便，故尽管血液标本灵敏度不如 BALF 高，但当存在菌血症或脓毒血症时，血液标本更适用于 mNGS 检测[19-20]。Chen 等[21]对 20 例重症肺炎患者的 BALF 和血液标本进行常规微生物学检查和 mNGS 检测潜在的病原体，结果显示 10 例 mNGS 阳性重症肺炎患者中 BALF 标本和血标本同时检出了病原体，因此对伴有血流感染的重症肺炎患者，可以采用血液标本进行 mNGS 检测；但由于血流感染的异质性较大，目前针对血流感染者尚缺乏大样本 mNGS 诊断效能方面的研究。综上，mNGS 检测可选样本具有多样性，可因病而异选择最佳检测标本。
3 mNGS 在肺部细菌、真菌、病毒及混合感染中的应用
3.1 mNGS 在肺部细菌感染中的应用
细菌是肺部感染中常见的病原体之一。传统的微生物学诊断方法包括痰培养、血培养等，但其检测周期长，阳性率低，灵敏度低[7]。在细菌检测方法的选择上，mNGS 要优于传统微生物培养方法。Liu 等[13]使用 mNGS 技术和传统微生物培养方法，检测了 2019 年 5 月－2021 年 4 月在中南大学湘雅三医院就诊的社区获得性肺炎患者的 BALF 标本中的病原体，结果显示 mNGS 检出病原菌阳性率为 64%，BALF 培养仅为 28%。Xie 等[1]回顾性分析了 140 例疑似肺部感染住院患者的 mNGS 和常规检测结果，结果显示 mNGS 与常规诊断检测的病原体阳性检出率存在显著差异（82.14% vs. 35.71%，P<0.05），mNGS 对肺部感染诊断的灵敏度高于常规检测（89.17% vs. 50.00%，P<0.01），但特异度没有明显差别（75.00% vs. 81.82%，P>0.05）。Qian 等[22]对复旦大学附属华山医院的 100 例患者通过 mNGS 及传统培养检测细菌，结果显示培养检出病原菌 54 份，病原菌共计 70 种，mNGS 共检出病原菌 95 份，病原菌共计 225 种；mNGS 对病原菌的检测比传统培养具有更高的灵敏度（95% vs. 54%，P<0.001）。目前，mNGS 技术常用于混合、罕见、难检出的病原体，如结核分枝杆菌、新生隐球菌等，并在检测时长方面具有明显优势。如 Ma 等[23]报告了 1 例 82 岁老年患者，在经过多次包括支气管镜检查在内的结核相关检查均未发现结核分枝杆菌感染的情况下，对 BALF 行 mNGS 检测检出了结核分枝杆菌和白色假丝酵母菌。Shi 等[24]通过对 110 例疑诊肺结核患者的 BALF 标本进行 mNGS 检测，并与常规微生物检测（结核 X-pert 检测、分枝杆菌培养及抗酸杆菌染色）和最终临床诊断进行了比较，结果显示 mNGS 对结核分枝杆菌的检测显示出 47.92%的灵敏度，这与结核 X-pert 检测（45.83%）和分枝杆菌培养（46.81%）相比无明显差异，但高于抗酸杆菌染色（29.17%）对 BALF 结核病诊断的灵敏度。然而，目前鲜有描述 mNGS 在疑似肺结核患者中应用的研究，还需更多的临床应用来验证其检测效果。
3.2 mNGS 在肺部真菌感染中的应用
传统意义上，真菌感染的实验室诊断依赖于真菌病原体的分离，或在染色剂的帮助下对临床标本进行直接显微镜检查。真菌病原体的培养，特别是丝状真菌，通常需要 1～2 周的孵育时间，而且鉴定时也非常具有挑战性。常用真菌抗原如（1, 3）-β-D 葡聚糖检测和半乳甘露聚糖检测的灵敏度和特异度都较低[25]。mNGS 作为病原体检测的新兴技术，在真菌检测领域逐渐崭露头角。比较有代表性的是 Yang 等[26]回顾性研究了 106 例疑似肺部真菌感染患者，比较了 mNGS 检测与常规测试的诊断性能，结果显示 mNGS 技术对 TBLB、BALF 标本在诊断肺部真菌感染方面的灵敏度显著高于常规检测（常规检测 vs. TBLB-mNGS：44.4% vs. 80.0%，P<0.05；常规检测 vs. BALF-mNGS：44.4% vs. 84.4%，P<0.05），mNGS 与常规检测的特异度无显著差异（常规检测 vs. TBLB-mNGS：88.52% vs. 91.8%；常规检测 vs. BALF-mNGS：88.52% vs. 85.3%）。Li 等[27]利用 mNGS 技术检测出了 1 例由皮炎外瓶霉引起的罕见肺真菌病病例，及时指导临床用药，并最终改善了治疗效果。Lu 等[28]对 4 份非 HIV 感染的肺孢子菌肺炎病例，使用 mNGS 与传统检测方法进行检测结果的比较，结果显示 mNGS 检测出肺孢子菌的时间明显短于传统检测方法。Sun 等[29]纳入 198 例非 HIV 免疫抑制重症肺炎患者，其中肺孢子菌 77 例，通过使用 mNGS 技术和常规检测方法（血真菌 G 试验/乳酸脱氢酶和 BALF-显微镜）对这些患者的 BALF 标本进行检测，发现 mNGS 检测出的肺孢子菌灵敏度为 97.4%，明显高于常规方法检测结果（血真菌 G 试验/乳酸脱氢酶为 87.01%，BALF-显微镜为 46.75%），特异度居中（BALF-mNGS 为 85.12%，血真菌 G 试验/乳酸脱氢酶为 59.50%，BALF-显微镜为 100%）。Xu 等[30]对 12 例肾移植患者进行 BALF 的 mNGS 检测，结果肺孢子菌检出阳性率达到了 54.5%。以上研究均指出了 mNGS 技术检测肺孢子菌的优势所在。综上，临床中疑似肺部真菌感染的患者，在传统检测方法均未取得指导性检验结果的情况下，建议获取患者 TBLB 或 BALF 标本进行 mNGS 检测，以尽早测出病原菌，指导临床用药。
3.3 mNGS 在肺部病毒感染中的应用
除细菌、真菌等感染外，肺部感染可由病毒引起，如偏肺病毒、鼻病毒、冠状病毒及呼吸道合胞病毒等[12]。传统的病毒检测方法主要包括血清学试验（抗原和抗体检测）和核酸检测等，这些常规检测方法往往需要提前预设病原体的种类，且现有检测方法只能覆盖少部分病毒，而 mNGS 检测几乎可检测样本中所有的病原体，因此在病原检测中具有明显优势。研究表明，严重急性呼吸综合征、中东呼吸综合征以及新型冠状病毒肺炎这三大严重的呼吸系统疾病都与新型冠状病毒密切相关[31]。除新发病原体外，有关研究也提出了 mNGS 能检测出常规方法难以检测到的病毒。van Boheemen 等[12]利用 mNGS 对 25 个呼吸道样本进行了回顾性研究，结果与 PCR 相比，mNGS 的灵敏度为 83%，特异度为 94%，且检测出了传统微生物方法无法检测到的病毒，如丙型流感病毒、KI 多瘤病毒、巨细胞病毒和肠道病毒等。Shi 等[32]的研究指出，mNGS 不仅能检测出新型冠状病毒，同时能检测出传统培养方法无法检测出的呼吸道、血液和胃肠道中潜伏的人类疱疹病毒 1 型。
3.4 mNGS 在混合性肺部感染中的应用
混合性肺部感染患者体内往往存在多种病原体，其临床症状较单一，肺部感染更重，且病情发展快，病死率高，故需要在短时间内准确找到病原体。与传统检测相比，mNGS 的病原体检测范围更广。Wang 等[33]回顾性分析了纳入的 55 例混合性肺部感染病例，结果显示 mNGS 诊断混合性肺部感染的灵敏度远高于常规检测（97.2% vs. 13.9%，P<0.01），但特异度相反（63.2% vs. 94.7%，P=0.07)。Chen 等[34]回顾性研究了 20 例混合感染患者的检测结果，虽然两者均检测出多种病原菌，但 mNGS 技术鉴定出 79 种细菌、4 种真菌和 7 种病毒，而传统培养方法仅仅鉴定出 9 种细菌和 8 种真菌，提示 mNGS 对多重病原体感染诊断有绝对优势。
3.5 mNGS 诊断的特异度问题
综上，mNGS 检测病原体的灵敏度均远高于传统检测方法，正是基于 mNGS 检测技术的无偏性和高度灵敏的特点，mNGS 可能会导致报告出现假阳性结果，未能正确解释检测报告可能会导致错误的疾病诊断，故其特异度较传统检测方法并不突出，甚至更低。要改进 mNGS 检测技术特异度的问题，首先，应该尽量减少环境污染菌、呼吸道定植菌和人类宿主 DNA 的干扰；其次，假阳性结果的出现可能是因为数据库中根据种水平的不同，参考基因组可能由数十至数千临床株系融合而成，同属或同种不同株系微生物在致病力、流行病学方面可能存在较大差异，而 mNGS 技术检测出的病原体可能种水平相同，而株系不同，这就需要重点关注和报告种水平的特异性序列，提高分辨率和特异度。
4 mNGS 技术面临的挑战与突破
4.1 污染菌的干扰
mNGS 技术面临污染菌的干扰，这是目前所面临的重要挑战之一。环境菌的污染包括来源于采集标本时的医院环境污染，运输过程中的样本污染，甚至是实验室的试剂污染和试剂盒污染等。对于避免环境中、试剂中、容器中的病原菌污染，严格遵守检测流程的质量控制程序非常重要。我国已有专家共识对 mNGS 技术进行了样本采集、测序和结果解读的规范[35-38]。为了避免环境菌污染，首先在采集标本时要做到无菌操作，并明确具体的工作流程和人员配备方式；其次，在运输过程中一定要避免样本暴露导致的样本污染；再者，对于 mNGS 实验室操作而言，工作人员应花大量时间进行分子生物学技术培训以熟悉实验操作，因为最关键的往往是重复性工作，如移液器的规范操作，避免反应试剂错加、漏加或工作流程中关键步骤的遗漏等。
4.2 临床解读
与环境污染菌相比，人体定植菌的消除才是更为严峻的挑战。Langelier 等[39]对 20 例下呼吸道感染患者开发了 logistic 回归模型和基于规则的模型来区分可能的病原体和气道微生物，结果显示，所有临床证实的下呼吸道病原体平均占所有样本读数的 99%。准确识别病原体并提供用药指南是微生物检测的最终目标，除参考病原体检测结果外，还需结合患者临床表现、免疫状态和基础疾病进行综合评估，以检出真正的病原体。
4.3 RNA 检测困难
核酸质量是 mNGS 检测成功的关键因素，人体 RNA 丰度高且复杂，RNA 不如 DNA 稳定，可以被存在于皮肤、血液和组织中的内源性核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）以及外源性 RNase 降解。为了尽可能保持 RNA 完整性，最大程度地避免外源性 RNase 污染和抑制内源性 RNase 的活力，首先应创造无外源性 RNase 的操作环境，目前已有专家共识提出 mNGS 送检标准[37]。外源性 RNase 主要来源于与材料接触的实验器材和操作人员的呼吸、手接触，因此在试验操作之前必须将实验器材进行高温灭菌处理，操作者必须戴帽子、口罩、手套。内源性 RNase 来源于红细胞裂解释放的 RNase 和白细胞中的 RNase，在培养细胞中加入裂解液可使细胞裂解，同时裂解液中的有效成分可以抑制胞内 RNase，进而使 RNA 保持完整。除避免 RNase 的干扰以保持 RNA 完整性外，优化 RNA 流程的核酸提取、建库等方法以提高 RNA 检出效率也同样重要。Deng 等[40]提出的带有加标引物富集的宏基因组测序方法是一种新型 RNA 富集策略，其流程简单，成本较低，保留了 mNGS 的检测广度，同时提高了 RNA 检测效率，使得 RNA 检测向前跨进了一大步，但该研究成果还未广泛应用于临床，还需更多的实验数据予以支撑。He 等[41]对 151 例肺炎患者的痰标本与 BALF 标本使用 TruePrep DNA Library PrepKit V2 for Illumina 进行文库制备，与另外 2 种商业 RNA 文库制备试剂盒（NEB UltraⅡ和 Vazyme TR503）比较，结果表明，使用 TruePrep 技术制备出的文库，能使 mNGS 检测出更多的病原菌，使得 RNA 病毒检测能力有所提高。目前常用的 RNA 测序技术多种多样，但大多数测序技术过程复杂，成本昂贵，且对 RNA 总量和浓度的要求高，在对微量 RNA 病原体检测时常显不足。陆泓雨等[42]建立了一套简便的、对 RNA 样本起始量要求很低的微量 RNA 建库技术，提高了微量 RNA 检出量，尽管该技术未用于微量 RNA 样品的 mNGS 测序，但这对 mNGS 测序技术的发展起到了推动作用。
4.4 厚壁菌破壁困难
胞内寄生菌、真菌（具有复杂的细胞结构且细胞壁外还有一层厚厚的荚膜）、结核分枝杆菌（细胞壁外有分枝菌酸）、布鲁菌、诺卡菌等常见病原体破壁困难，核酸序列丰度低，检出困难，需要提高破壁技术，来提升阳性率。相关研究表明，采用珠子搅拌破坏细胞壁的方案，可以提高马拉色菌科 27 属的 DNA 产量[43]。Angebault 等[44]对法国 Mondor 医院的 6 个痰液标本进行细菌和真菌培养，后将培养过的痰标本移入 PowerLyzer 0.1 mm 玻璃珠管中进行细胞壁的机械裂解，随后使用自动 QIAsymphony 提取和手动 PowerSoil MoBio 提取 2 种方法提取标本中的病原体 DNA，再使用 V1-V2 和 V4-V3 16S 靶向扩增子测序检测细菌多样性和群落结构，最终检测到链球菌等革兰阳性菌。Vesty 等[45]比较了真菌和细菌口腔 16S/ITS 靶向扩增子测序的 4 种提取方案，指出包含酶裂解步骤的方案能增强唾液中 DNA 的提取效率。Huseyin 等[46]比较了 5 种提取肠道菌群病原体 DNA 的方案，提出只有包含珠击步骤的方法才能提取足够数量的病原体 DNA，尽管该研究的致病病原体与肺部感染无关，但使用的破壁技术对肺部感染厚壁菌的 mNGS 检测具有指导意义。随着生物学的发展，难破壁病原体的 mNGS 检测技术有很大突破，但在肺部感染性疾病中，除有细胞结构的病原体外，还存在病毒、寄生虫等病原体感染。Deng 等[40]开发的带有加标引物富集的宏基因组测序技术以平均 10 倍的富集度扩增了指定的病毒基因组，提高了特定病毒病原体的检测灵敏度。此外，除了提高破壁技术和使用加标引物富集的宏基因组测序方法外，在这些低丰度核酸序列病原体的诊断过程中需要结合宿主因素、流行病学史、影像学特征、病理学特征、实验室检查结果及抗生素治疗反应，进行综合评估以检出精确的病原体。
4.5 人类宿主 DNA 的干扰及其他
肺部感染患者的呼吸道样本中含有大量的人类宿主 DNA，95%的原始 mNGS 读数来自鼻咽抽吸物样本中的人类 DNA，这使得 mNGS 检测病原体标本的灵敏度降低[47]。现有的增加微生物核酸提取率的方法包括反向富集方法（过滤法、超速离心法、差异裂解法、去甲基化磁珠等）和正向富集方法（多重 PCR 和探针捕获）。在反向富集方法中，过滤法和超速离心法属于物理分离技术，其基于宿主细胞与微生物大小差异或其他物理差异对宿主细胞进行清除，这种方法简单易操作，但仅可用于去除完整性较好的人源细胞；差异裂解法则利用人源细胞与微生物细胞结构差异，选择性地裂解宿主细胞，利用核酸酶酶解掉释放出来的宿主 DNA，最后进行病原体 DNA 的富集纯化[48-49]；在正向富集方法中，多重 PCR 操作简单，周期短，适用于目标明确、区域不大的应用；而捕获探针试验操作复杂，周期长，适合大范围地寻找可能的致病源，如罕见病原体的检测[50]。相较前几种核酸提取方法，Charalampous 等[51]提出的一种优化的基于皂苷的宿主 DNA 去除方法即纳米孔测序技术，其去除宿主 DNA 的能力更强，该方法可去除呼吸道样本中 99.99%的人类 DNA。但由于使用额外的试剂，外源性背景污染的风险也随之升高。此外，检测周期较长、价格昂贵也限制了 mNGS 成为常规检测项目，如何加速病原体检出时间及降低成本费用，也是推进临床应用和研究的关键。
5 小结与展望
总之，本文通过阅读国内外大量文献，对 mNGS 的应用进展及面临的挑战进行了综述。mNGS 是一种具有显著优势的病原体新兴检测手段，其在肺部感染的病原体诊断中突破了传统培养方法的局限，扩展了人们对病原体的认识。然而，mNGS 技术在肺部感染诊断中的应用并未普及，如何规范发展 mNGS 技术，使其成为高灵敏度、快速、广谱、无创性且亲民的病原微生物检测技术是我们的前进目标。相信随着相关研究的继续深入，mNGS 将有望成为肺部感染甚至其他感染性疾病诊断的有力工具之一。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
肺部感染是指细菌、病毒及真菌等各类病原体引起的气管、支气管和肺实质的感染。肺部感染在世界范围内仍是高发病率和高病死率的一种感染性疾病[1]，快速准确地检测出病原体对于指导临床用药至关重要。传统病原微生物检测方法在时效性、特异度、灵敏度等方面均不能满足临床需求，而随着基因测序技术和生物信息学方法的进步，宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技术越来越多地应用于肺部感染性疾病的诊治中。1977 年，Sanger 等[2]发明了第一代测序技术，称为 Sanger 测序法，使得基因测序成为可能。2005 年，基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统 Genome Sequencer 20 System 被 Nature 报道，开创了新一代测序的先河[3]。2008 年 Palacios 等[4]利用 mNGS 发现了沙粒病毒，2011 年 Xu 等[5]利用 mNGS 发现了新型布尼亚病毒，开启了 mNGS 技术在临床感染中应用的先例。2014 年，mNGS 应用于一名患有严重联合免疫缺陷的 14 岁男孩，诊断出神经系统钩端螺旋体感染，在予以对应抗菌药物治疗后，患者状态恢复至接近病前；此次应用掀起了 mNGS 技术在病原微生物鉴定领域，尤其是疑难微生物鉴定方面的应用热潮[6]。2018 年，Miao 等[7]回顾性分析了 2017 年 4 月－12 月在复旦大学附属中山医院发生的 561 例疑似急性或慢性感染病例，比较了 mNGS 和传统培养方法在病原体诊断效能方面的差异，结果显示 mNGS 在病原体识别方面具有更高的灵敏度。至此以后，mNGS 在国内的临床应用迅速发展起来。研究显示，mNGS 技术可检出的病原体已覆盖了较大范围的细菌、真菌、病毒、寄生虫等病原微生物，这为肺部感染性疾病的精确诊断作出了重大贡献[8]。但 mNGS 同时存在诸如污染菌干扰、厚壁菌破壁困难、RNA 检测困难及宿主 DNA 干扰等问题。本文将对 mNGS 在肺部感染性疾病诊治方面的应用情况、研究进展，以及面临的挑战进行综述。
1 mNGS 技术的优势
mNGS 即病原宏基因组学技术，它不依赖于传统微生物培养，而是直接提取标本中的全部核酸进行高通量测序，通过对生物信息的分析，去除人源序列后，将筛选出的数据与病原数据库进行比对，获得疑似致病微生物的种属信息。mNGS 具有无偏倚、广覆盖、高灵敏度和速度快的特点[9]。与 mNGS 检测技术相比，微生物培养、镜下涂片、组织病理学等传统检测技术有检测时间久、阳性率低和可检病原体种类有限等局限[10]。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术较传统微生物检测方法更快速、灵敏，但其必须基于已知病原体的基因序列，且假阳性或假阴性概率较高[11]。mNGS 可测出样本中所有微生物，而不似 PCR 只有单一靶标，同时无需提前获悉待测病原体的序列信息。mNGS 可弥补 PCR 的缺点，并能监测病毒传播过程中可能的变异，同时对于部分病毒含量较低的样本，mNGS 可提高检测阳性率[12]。mNGS 也可在病原培养后做深度的二代测序，甚至全基因组分析，为预防以后同类型传染病的暴发积累经验。除了病原体鉴定，mNGS 还可提供额外基因组信息用于呼吸道微生物组分析、人类宿主反应分析和耐药性预测，所有这些都更有利于对患者的临床干预。mNGS 还具有不易受抗生素暴露影响的优势。有研究指出，在未接触抗生素治疗的患者中，mNGS 与培养之间的灵敏度没有显著差异（43.3% vs. 36.7%，P=0.1）；然而，在有抗生素暴露史患者中，mNGS 的灵敏度显著高于培养（52.7% vs. 34.4%，P<0.01）[7]。
2 mNGS 相关肺部感染诊断标本的选择
不同类型的肺部感染性疾病，病原微生物的分布不同。mNGS 相关肺部感染标本的选择具有多样性，如痰液、血液、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）、经支气管镜肺活检术（transbronchial lung biopsy，TBLB）标本、支气管刷检标本等均可作为检测样本[13]。痰标本是肺部感染患者的常规检查项目，但是痰标本需要经呼吸道咳出，这样会带入大量的口腔定植菌，从而干扰检测结果。深部痰可一定程度避免口腔定植菌污染，但仅适用于气管插管的危重患者。BALF、TBLB 及支气管刷检标本等皆经支气管镜获得，尽管上呼吸道定植菌对此类标本的干扰较痰标本小，但仍不能完全避免干扰。为了尽可能减少上呼吸道定植菌的干扰，在开始使用纤维支气管镜之前，患者应在医护人员的指导下先用无菌生理盐水漱口，减少口腔污染菌的数量，如有假牙应先摘掉。另外，应采用保护性支气管肺泡灌洗技术，勿从支气管镜的工作腔中吸取灌洗液标本，也能有效避免上呼吸道菌群的污染；标本采集顺序为支气管灌洗液、BALF、毛刷标本和活检标本，应避免带血[14]。BALF 标本位于深部肺组织，人源性核酸含量低，对结果干扰最小，对深部肺部感染有较好的代表性，故其在肺部感染的标本选择中常排在首要位置，研究也显示 BALF 标本的 mNGS 检测效率优于传统培养方法[8, 15-17]。Wang 等[18]使用 mNGS 检测了 39 例疑似感染性外周肺病变患者的 BALF、TBLB 和支气管刷检标本中的病原体，结果显示对于上述 3 类标本中的细菌和真菌检测，mNGS 比传统培养方法更灵敏，但三者之间 mNGS 检测灵敏度没有显著差异。重症肺炎患者常并发血流感染，外周血的采集过程不受口腔定植菌的干扰，且采集方便，故尽管血液标本灵敏度不如 BALF 高，但当存在菌血症或脓毒血症时，血液标本更适用于 mNGS 检测[19-20]。Chen 等[21]对 20 例重症肺炎患者的 BALF 和血液标本进行常规微生物学检查和 mNGS 检测潜在的病原体，结果显示 10 例 mNGS 阳性重症肺炎患者中 BALF 标本和血标本同时检出了病原体，因此对伴有血流感染的重症肺炎患者，可以采用血液标本进行 mNGS 检测；但由于血流感染的异质性较大，目前针对血流感染者尚缺乏大样本 mNGS 诊断效能方面的研究。综上，mNGS 检测可选样本具有多样性，可因病而异选择最佳检测标本。
3 mNGS 在肺部细菌、真菌、病毒及混合感染中的应用
3.1 mNGS 在肺部细菌感染中的应用
细菌是肺部感染中常见的病原体之一。传统的微生物学诊断方法包括痰培养、血培养等，但其检测周期长，阳性率低，灵敏度低[7]。在细菌检测方法的选择上，mNGS 要优于传统微生物培养方法。Liu 等[13]使用 mNGS 技术和传统微生物培养方法，检测了 2019 年 5 月－2021 年 4 月在中南大学湘雅三医院就诊的社区获得性肺炎患者的 BALF 标本中的病原体，结果显示 mNGS 检出病原菌阳性率为 64%，BALF 培养仅为 28%。Xie 等[1]回顾性分析了 140 例疑似肺部感染住院患者的 mNGS 和常规检测结果，结果显示 mNGS 与常规诊断检测的病原体阳性检出率存在显著差异（82.14% vs. 35.71%，P<0.05），mNGS 对肺部感染诊断的灵敏度高于常规检测（89.17% vs. 50.00%，P<0.01），但特异度没有明显差别（75.00% vs. 81.82%，P>0.05）。Qian 等[22]对复旦大学附属华山医院的 100 例患者通过 mNGS 及传统培养检测细菌，结果显示培养检出病原菌 54 份，病原菌共计 70 种，mNGS 共检出病原菌 95 份，病原菌共计 225 种；mNGS 对病原菌的检测比传统培养具有更高的灵敏度（95% vs. 54%，P<0.001）。目前，mNGS 技术常用于混合、罕见、难检出的病原体，如结核分枝杆菌、新生隐球菌等，并在检测时长方面具有明显优势。如 Ma 等[23]报告了 1 例 82 岁老年患者，在经过多次包括支气管镜检查在内的结核相关检查均未发现结核分枝杆菌感染的情况下，对 BALF 行 mNGS 检测检出了结核分枝杆菌和白色假丝酵母菌。Shi 等[24]通过对 110 例疑诊肺结核患者的 BALF 标本进行 mNGS 检测，并与常规微生物检测（结核 X-pert 检测、分枝杆菌培养及抗酸杆菌染色）和最终临床诊断进行了比较，结果显示 mNGS 对结核分枝杆菌的检测显示出 47.92%的灵敏度，这与结核 X-pert 检测（45.83%）和分枝杆菌培养（46.81%）相比无明显差异，但高于抗酸杆菌染色（29.17%）对 BALF 结核病诊断的灵敏度。然而，目前鲜有描述 mNGS 在疑似肺结核患者中应用的研究，还需更多的临床应用来验证其检测效果。
3.2 mNGS 在肺部真菌感染中的应用
传统意义上，真菌感染的实验室诊断依赖于真菌病原体的分离，或在染色剂的帮助下对临床标本进行直接显微镜检查。真菌病原体的培养，特别是丝状真菌，通常需要 1～2 周的孵育时间，而且鉴定时也非常具有挑战性。常用真菌抗原如（1, 3）-β-D 葡聚糖检测和半乳甘露聚糖检测的灵敏度和特异度都较低[25]。mNGS 作为病原体检测的新兴技术，在真菌检测领域逐渐崭露头角。比较有代表性的是 Yang 等[26]回顾性研究了 106 例疑似肺部真菌感染患者，比较了 mNGS 检测与常规测试的诊断性能，结果显示 mNGS 技术对 TBLB、BALF 标本在诊断肺部真菌感染方面的灵敏度显著高于常规检测（常规检测 vs. TBLB-mNGS：44.4% vs. 80.0%，P<0.05；常规检测 vs. BALF-mNGS：44.4% vs. 84.4%，P<0.05），mNGS 与常规检测的特异度无显著差异（常规检测 vs. TBLB-mNGS：88.52% vs. 91.8%；常规检测 vs. BALF-mNGS：88.52% vs. 85.3%）。Li 等[27]利用 mNGS 技术检测出了 1 例由皮炎外瓶霉引起的罕见肺真菌病病例，及时指导临床用药，并最终改善了治疗效果。Lu 等[28]对 4 份非 HIV 感染的肺孢子菌肺炎病例，使用 mNGS 与传统检测方法进行检测结果的比较，结果显示 mNGS 检测出肺孢子菌的时间明显短于传统检测方法。Sun 等[29]纳入 198 例非 HIV 免疫抑制重症肺炎患者，其中肺孢子菌 77 例，通过使用 mNGS 技术和常规检测方法（血真菌 G 试验/乳酸脱氢酶和 BALF-显微镜）对这些患者的 BALF 标本进行检测，发现 mNGS 检测出的肺孢子菌灵敏度为 97.4%，明显高于常规方法检测结果（血真菌 G 试验/乳酸脱氢酶为 87.01%，BALF-显微镜为 46.75%），特异度居中（BALF-mNGS 为 85.12%，血真菌 G 试验/乳酸脱氢酶为 59.50%，BALF-显微镜为 100%）。Xu 等[30]对 12 例肾移植患者进行 BALF 的 mNGS 检测，结果肺孢子菌检出阳性率达到了 54.5%。以上研究均指出了 mNGS 技术检测肺孢子菌的优势所在。综上，临床中疑似肺部真菌感染的患者，在传统检测方法均未取得指导性检验结果的情况下，建议获取患者 TBLB 或 BALF 标本进行 mNGS 检测，以尽早测出病原菌，指导临床用药。
3.3 mNGS 在肺部病毒感染中的应用
除细菌、真菌等感染外，肺部感染可由病毒引起，如偏肺病毒、鼻病毒、冠状病毒及呼吸道合胞病毒等[12]。传统的病毒检测方法主要包括血清学试验（抗原和抗体检测）和核酸检测等，这些常规检测方法往往需要提前预设病原体的种类，且现有检测方法只能覆盖少部分病毒，而 mNGS 检测几乎可检测样本中所有的病原体，因此在病原检测中具有明显优势。研究表明，严重急性呼吸综合征、中东呼吸综合征以及新型冠状病毒肺炎这三大严重的呼吸系统疾病都与新型冠状病毒密切相关[31]。除新发病原体外，有关研究也提出了 mNGS 能检测出常规方法难以检测到的病毒。van Boheemen 等[12]利用 mNGS 对 25 个呼吸道样本进行了回顾性研究，结果与 PCR 相比，mNGS 的灵敏度为 83%，特异度为 94%，且检测出了传统微生物方法无法检测到的病毒，如丙型流感病毒、KI 多瘤病毒、巨细胞病毒和肠道病毒等。Shi 等[32]的研究指出，mNGS 不仅能检测出新型冠状病毒，同时能检测出传统培养方法无法检测出的呼吸道、血液和胃肠道中潜伏的人类疱疹病毒 1 型。
3.4 mNGS 在混合性肺部感染中的应用
混合性肺部感染患者体内往往存在多种病原体，其临床症状较单一，肺部感染更重，且病情发展快，病死率高，故需要在短时间内准确找到病原体。与传统检测相比，mNGS 的病原体检测范围更广。Wang 等[33]回顾性分析了纳入的 55 例混合性肺部感染病例，结果显示 mNGS 诊断混合性肺部感染的灵敏度远高于常规检测（97.2% vs. 13.9%，P<0.01），但特异度相反（63.2% vs. 94.7%，P=0.07)。Chen 等[34]回顾性研究了 20 例混合感染患者的检测结果，虽然两者均检测出多种病原菌，但 mNGS 技术鉴定出 79 种细菌、4 种真菌和 7 种病毒，而传统培养方法仅仅鉴定出 9 种细菌和 8 种真菌，提示 mNGS 对多重病原体感染诊断有绝对优势。
3.5 mNGS 诊断的特异度问题
综上，mNGS 检测病原体的灵敏度均远高于传统检测方法，正是基于 mNGS 检测技术的无偏性和高度灵敏的特点，mNGS 可能会导致报告出现假阳性结果，未能正确解释检测报告可能会导致错误的疾病诊断，故其特异度较传统检测方法并不突出，甚至更低。要改进 mNGS 检测技术特异度的问题，首先，应该尽量减少环境污染菌、呼吸道定植菌和人类宿主 DNA 的干扰；其次，假阳性结果的出现可能是因为数据库中根据种水平的不同，参考基因组可能由数十至数千临床株系融合而成，同属或同种不同株系微生物在致病力、流行病学方面可能存在较大差异，而 mNGS 技术检测出的病原体可能种水平相同，而株系不同，这就需要重点关注和报告种水平的特异性序列，提高分辨率和特异度。
4 mNGS 技术面临的挑战与突破
4.1 污染菌的干扰
mNGS 技术面临污染菌的干扰，这是目前所面临的重要挑战之一。环境菌的污染包括来源于采集标本时的医院环境污染，运输过程中的样本污染，甚至是实验室的试剂污染和试剂盒污染等。对于避免环境中、试剂中、容器中的病原菌污染，严格遵守检测流程的质量控制程序非常重要。我国已有专家共识对 mNGS 技术进行了样本采集、测序和结果解读的规范[35-38]。为了避免环境菌污染，首先在采集标本时要做到无菌操作，并明确具体的工作流程和人员配备方式；其次，在运输过程中一定要避免样本暴露导致的样本污染；再者，对于 mNGS 实验室操作而言，工作人员应花大量时间进行分子生物学技术培训以熟悉实验操作，因为最关键的往往是重复性工作，如移液器的规范操作，避免反应试剂错加、漏加或工作流程中关键步骤的遗漏等。
4.2 临床解读
与环境污染菌相比，人体定植菌的消除才是更为严峻的挑战。Langelier 等[39]对 20 例下呼吸道感染患者开发了 logistic 回归模型和基于规则的模型来区分可能的病原体和气道微生物，结果显示，所有临床证实的下呼吸道病原体平均占所有样本读数的 99%。准确识别病原体并提供用药指南是微生物检测的最终目标，除参考病原体检测结果外，还需结合患者临床表现、免疫状态和基础疾病进行综合评估，以检出真正的病原体。
4.3 RNA 检测困难
核酸质量是 mNGS 检测成功的关键因素，人体 RNA 丰度高且复杂，RNA 不如 DNA 稳定，可以被存在于皮肤、血液和组织中的内源性核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）以及外源性 RNase 降解。为了尽可能保持 RNA 完整性，最大程度地避免外源性 RNase 污染和抑制内源性 RNase 的活力，首先应创造无外源性 RNase 的操作环境，目前已有专家共识提出 mNGS 送检标准[37]。外源性 RNase 主要来源于与材料接触的实验器材和操作人员的呼吸、手接触，因此在试验操作之前必须将实验器材进行高温灭菌处理，操作者必须戴帽子、口罩、手套。内源性 RNase 来源于红细胞裂解释放的 RNase 和白细胞中的 RNase，在培养细胞中加入裂解液可使细胞裂解，同时裂解液中的有效成分可以抑制胞内 RNase，进而使 RNA 保持完整。除避免 RNase 的干扰以保持 RNA 完整性外，优化 RNA 流程的核酸提取、建库等方法以提高 RNA 检出效率也同样重要。Deng 等[40]提出的带有加标引物富集的宏基因组测序方法是一种新型 RNA 富集策略，其流程简单，成本较低，保留了 mNGS 的检测广度，同时提高了 RNA 检测效率，使得 RNA 检测向前跨进了一大步，但该研究成果还未广泛应用于临床，还需更多的实验数据予以支撑。He 等[41]对 151 例肺炎患者的痰标本与 BALF 标本使用 TruePrep DNA Library PrepKit V2 for Illumina 进行文库制备，与另外 2 种商业 RNA 文库制备试剂盒（NEB UltraⅡ和 Vazyme TR503）比较，结果表明，使用 TruePrep 技术制备出的文库，能使 mNGS 检测出更多的病原菌，使得 RNA 病毒检测能力有所提高。目前常用的 RNA 测序技术多种多样，但大多数测序技术过程复杂，成本昂贵，且对 RNA 总量和浓度的要求高，在对微量 RNA 病原体检测时常显不足。陆泓雨等[42]建立了一套简便的、对 RNA 样本起始量要求很低的微量 RNA 建库技术，提高了微量 RNA 检出量，尽管该技术未用于微量 RNA 样品的 mNGS 测序，但这对 mNGS 测序技术的发展起到了推动作用。
4.4 厚壁菌破壁困难
胞内寄生菌、真菌（具有复杂的细胞结构且细胞壁外还有一层厚厚的荚膜）、结核分枝杆菌（细胞壁外有分枝菌酸）、布鲁菌、诺卡菌等常见病原体破壁困难，核酸序列丰度低，检出困难，需要提高破壁技术，来提升阳性率。相关研究表明，采用珠子搅拌破坏细胞壁的方案，可以提高马拉色菌科 27 属的 DNA 产量[43]。Angebault 等[44]对法国 Mondor 医院的 6 个痰液标本进行细菌和真菌培养，后将培养过的痰标本移入 PowerLyzer 0.1 mm 玻璃珠管中进行细胞壁的机械裂解，随后使用自动 QIAsymphony 提取和手动 PowerSoil MoBio 提取 2 种方法提取标本中的病原体 DNA，再使用 V1-V2 和 V4-V3 16S 靶向扩增子测序检测细菌多样性和群落结构，最终检测到链球菌等革兰阳性菌。Vesty 等[45]比较了真菌和细菌口腔 16S/ITS 靶向扩增子测序的 4 种提取方案，指出包含酶裂解步骤的方案能增强唾液中 DNA 的提取效率。Huseyin 等[46]比较了 5 种提取肠道菌群病原体 DNA 的方案，提出只有包含珠击步骤的方法才能提取足够数量的病原体 DNA，尽管该研究的致病病原体与肺部感染无关，但使用的破壁技术对肺部感染厚壁菌的 mNGS 检测具有指导意义。随着生物学的发展，难破壁病原体的 mNGS 检测技术有很大突破，但在肺部感染性疾病中，除有细胞结构的病原体外，还存在病毒、寄生虫等病原体感染。Deng 等[40]开发的带有加标引物富集的宏基因组测序技术以平均 10 倍的富集度扩增了指定的病毒基因组，提高了特定病毒病原体的检测灵敏度。此外，除了提高破壁技术和使用加标引物富集的宏基因组测序方法外，在这些低丰度核酸序列病原体的诊断过程中需要结合宿主因素、流行病学史、影像学特征、病理学特征、实验室检查结果及抗生素治疗反应，进行综合评估以检出精确的病原体。
4.5 人类宿主 DNA 的干扰及其他
肺部感染患者的呼吸道样本中含有大量的人类宿主 DNA，95%的原始 mNGS 读数来自鼻咽抽吸物样本中的人类 DNA，这使得 mNGS 检测病原体标本的灵敏度降低[47]。现有的增加微生物核酸提取率的方法包括反向富集方法（过滤法、超速离心法、差异裂解法、去甲基化磁珠等）和正向富集方法（多重 PCR 和探针捕获）。在反向富集方法中，过滤法和超速离心法属于物理分离技术，其基于宿主细胞与微生物大小差异或其他物理差异对宿主细胞进行清除，这种方法简单易操作，但仅可用于去除完整性较好的人源细胞；差异裂解法则利用人源细胞与微生物细胞结构差异，选择性地裂解宿主细胞，利用核酸酶酶解掉释放出来的宿主 DNA，最后进行病原体 DNA 的富集纯化[48-49]；在正向富集方法中，多重 PCR 操作简单，周期短，适用于目标明确、区域不大的应用；而捕获探针试验操作复杂，周期长，适合大范围地寻找可能的致病源，如罕见病原体的检测[50]。相较前几种核酸提取方法，Charalampous 等[51]提出的一种优化的基于皂苷的宿主 DNA 去除方法即纳米孔测序技术，其去除宿主 DNA 的能力更强，该方法可去除呼吸道样本中 99.99%的人类 DNA。但由于使用额外的试剂，外源性背景污染的风险也随之升高。此外，检测周期较长、价格昂贵也限制了 mNGS 成为常规检测项目，如何加速病原体检出时间及降低成本费用，也是推进临床应用和研究的关键。
5 小结与展望
总之，本文通过阅读国内外大量文献，对 mNGS 的应用进展及面临的挑战进行了综述。mNGS 是一种具有显著优势的病原体新兴检测手段，其在肺部感染的病原体诊断中突破了传统培养方法的局限，扩展了人们对病原体的认识。然而，mNGS 技术在肺部感染诊断中的应用并未普及，如何规范发展 mNGS 技术，使其成为高灵敏度、快速、广谱、无创性且亲民的病原微生物检测技术是我们的前进目标。相信随着相关研究的继续深入，mNGS 将有望成为肺部感染甚至其他感染性疾病诊断的有力工具之一。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。