引用本文： 徐恬, 张昀哲, 雷学忠. 高乙型肝炎病毒前基因组RNA的乙型肝炎病毒感染者临床特征分析. 华西医学, 2024, 39(8): 1184-1187. doi: 10.7507/1002-0179.202305083 复制
乙型病毒性肝炎（乙肝）目前仍是世界性的公共卫生难题，全球有超过 2.5 亿人感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV），每年有超过 78 万人死于乙肝[1]。肝癌是全球癌症相关死亡的第二大原因[2]，而约有 40%的肝细胞癌来源于未得到控制的慢性乙肝（chronic hepatitis B, CHB），我国的这一比例更高，达 70%以上[3]。CHB 患者的全程管理对于减少乙肝相关不良事件的发生非常重要，包括对疾病活动性的长期监测、在合适的时期选择合适的抗病毒治疗方案、治疗效果的评估、预后预测及预防管理。目前，临床上主要基于 HBV 感染患者血清中几种生物标志物的水平，包括丙氨酸转氨酶（alanine transaminase, ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate transaminase, AST）、HBV 表面抗原（HBV surface antigen, HBsAg）和病毒 DNA 等，进行疾病分期和临床管理[4]。肝内 HBV 共价闭合环状 DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA）水平是目前被认为反映病毒活跃程度及抗病毒治疗反应最直接的指标[5]。目前血清学检查无法直接检测 HBV cccDNA，其检查依赖于有创性的肝脏活检，因此，有必要开发无创的替代标志物来监测 ccc DNA 的数量或活性[6]。HBV 前基因组 RNA（pregenomic RNA, pgRNA）是 HBV 复制的中间产物，理论上 HBV pgRNA 的唯一来源为肝内 cccDNA，因此 pgRNA 有望成为替代 cccDNA 的血清学标志物。已有研究表明相比其他血清学标志物，血清 HBV DNA 联合 pg RNA 在核苷类似物（nucleotide analogue, NA）治疗前和治疗期间，与肝内 cccDNA 的相关性更好[7]。临床上通常将功能性治愈作为 CHB 治疗的目标，我国目前治疗 CHB 的主要药物为 NA 及干扰素[8]。而 NA 往往是患者开始抗病毒治疗的第一步，治疗方案的选择及治疗过程中的药效评估均需要更优的血清学标志物提供依据。pgRNA 作为一种新的血清学标志物，有必要进一步研究其在临床实践中的价值。本研究试图通过分析高 HBV pgRNA 人群的临床特征，进一步探索 pgRNA 在 CHB 患者管理中的价值。
1 对象与方法
1.1 研究对象
纳入 2020 年 12 月 1 日－2022 年 4 月 1 日于四川大学华西医院感染性疾病中心肝炎门诊治疗随访的长期使用 NA 治疗的 CHB 患者。纳入标准：① 根据《慢性乙型肝炎防治指南（2019 年版）》[9]确诊的 CHB 患者；② 接受目前常用的 NA 即恩替卡韦、富马酸丙酚替诺福韦或富马酸替诺福韦酯治疗 1 年以上。排除标准：① 年龄<18 岁；② 肝硬化和恶性肿瘤患者；③ 存在免疫缺陷的患者；④ 资料不全的患者。本研究由四川大学华西医院生物医学伦理分委会批准，批件号为 2016 年审（91）号，并获得了所有患者的知情同意。
1.2 研究方法
1.2.1 一般资料收集
收集入组患者的基本信息，包括性别和年龄。
1.2.2 血液指标采集和检测
① 实验室指标：本研究中所有患者的血样采集集中在 2022 年 1 月1日－2022年4月1日，检测的指标主要包括反映肝脏本身炎症程度的指标，包括 ALT、AST、γ-谷氨酰转移酶（γ-glutamyl transferase, GGT）和甲胎蛋白，以及反映 HBV 感染的标志物，包括 HBsAg、HBV e 抗原（HBV e antigen, HBeAg）和 HBV DNA，所有实验室检测项目均在四川大学华西医院检验科进行。
② HBV pgRNA：本研究使用 HBV 核酸测定试剂盒（上海仁度生物科技股份有限公司）测定 pgRNA。检测方法包括核酸捕获及实时荧光核酸等温扩增检测。将 250 μL 的待测血清样本与病毒核酸提取液混合后，在 60℃下孵育 10 min，随后进行室温冷却以促进 RNA 捕获探针与靶标 RNA 的结合。通过磁性颗粒捕获靶标 RNA 并使用洗涤液清洗 2 次，最后将纯净的 RNA 复合物加入扩增检测液中。扩增检测液体系由扩增检测液 1、扩增检测液 2 和酶液组成，扩增反应在 42℃下进行 40 min。反应体系中使用了实时荧光核酸等温扩增检测技术，通过荧光探针实时检测 RNA 产物的扩增情况。荧光信号的强度与样本中靶标 RNA 的浓度成比例，最终由检测仪器实时采集荧光信号并进行定量分析。每个检测反应都包含内标以监控样本处理的质量。系统通过校准曲线自动确定样本中的 HBV RNA 浓度，报告的单位为拷贝数/mL。按照 HBV 核酸测定试剂盒说明书中介绍的使用方法，根据检测结果进行数据分析，并结合临床表现进行综合判断。根据 pgRNA 的检测下限值，将 HBV pgRNA≥15 拷贝数/mL 的患者归为高 pgRNA 组，pgRNA 低于检测下限（即＜15 拷贝数/mL）归为低 pgRNA 组。为了进一步探究 pgRNA 在预测CHB安全停药中的应用价值，鉴于有研究显示 HBsAg＜100 U/mL 时停药风险较低[10]，故统计了两组中 HBsAg＜100 U/mL 的患者数量。
1.3 统计学方法
使用 SPSS 27.0 软件进行统计分析。计数资料以频数和/或百分比表示，组间比较采用 χ2 检验。所有计量资料均不符合正态分布，以中位数（下四分位数，上四分位数）描述，组间比较采用 Mann-Whitney U 检验。双侧检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 入组患者的整体情况
排除了有长期激素服用史的患者 9 例，患有肝细胞癌的患者 7 例，临床资料不完整的患者 1 例后，本次研究共纳入了 107 例患者。男性患者占比 66.4%（71/107），平均年龄为 44.02 岁。HBeAg 阳性患者占 76.6%（82/107）。16.8%（18/107）的患者存在 ALT 升高（≥50 U/L），11.2%（12/107）的患者存在 AST 升高（≥40 U/L），HBV DNA 高于检测值上限（5 U/mL）的患者占 62.6%（67/107）。高 pgRNA 组和低 pgRNA 组分别有 45 例（42.1%）和 62 例（57.9%）患者。
2.2 高 pgRNA 组与低 pgRNA 组 CHB 患者的临床特征比较
高 pgRNA 组与低 pgRNA 组的性别、年龄、AST、ALT、GGT、HBsAg、HBeAg≥0.1 U/mL 的患者比例、HBV DNA、甲胎蛋白差异均无统计学意义（P＞0.05）。高 pgRNA 组 HBsAg＜100 U/mL 的患者比例低于低 pgRNA 组（P＜0.05）。见表1。
表1
高 pgRNA 组与低 pgRNA 组 CHB 患者的临床特征比较
3 讨论
目前，CHB 的治疗目标倾向于临床治愈[11]，但由于 HBV cccDNA 作为持久性的病毒储存库持续存在于受感染的肝细胞内[12]，导致部分已经实现临床治愈的患者停药后出现病毒学复发[13]，导致 CHB 完全治愈成为遥不可及的治疗目标。因此，根除 cccDNA 对实现 CHB 治愈具有十分重要的意义。目前有很多治愈类药物研究都以 cccDNA 作为直接或间接的靶点[14]，为了更加经济、无创地评估体内 cccDNA 活动性和/或水平，以更加方便的血清学标志物检测替代肝脏活检必然也是未来探索的方向。
由于肝脏穿刺的有创性，临床医生判断 CHB 患者体内的病毒活跃程度及肝脏炎症反应主要依赖于传统的病毒学指标及血液肝脏相关生化指标[15]。HBV pgRNA 这一新的指标越来越受到关注，它通常被视为具有反映 HBV cccDNA 复制活性、指导停药时间或评估 NA 治疗预后潜力的血清学指标[16]。针对 pgRNA 预测价值的研究也日益增多。有研究表明，HBV pgRNA 可用于区分治疗前慢性感染期和慢性肝炎期，尤其是在 HBeAg 阴性患者中，有助于判断某些患者是否需要早期积极抗病毒治疗[17]。也有研究发现血清 HBV pgRNA 水平与进展为肝硬化和肝细胞癌的风险具有正相关关系[18]。
本研究显示，高 pgRNA 组与低 pgRNA 组的 HBsAg 水平差异无统计学意义，可能是由于样本量较小而导致检验效能不足，也可能提示 HBsAg 的产生主要归因于患者体内的整合 HBV DNA 而不是 cccDNA[19]。目前临床上常用的治疗方案包括 NA 和聚乙二醇干扰素，临床治愈往往需要两者联合用药[20]，并且有研究表明，基线 HBsAg<1 500 U/mL 的患者中，NA 联合聚乙二醇干扰素具有更高的 HBsAg 清除率[21]。由于干扰素价格昂贵，且具有相较于 NA 更多的药物副作用，因此要求临床医生对联合治疗方案优势人群的判断更加精确。理论上，pgRNA 可以反映出体内 cccDNA 作为病毒储存库而产生的 HBsAg[22]，这将不受到体内本身存在的不断循环的 HBsAg 的影响，因此将 pgRNA 和 cccDNA 联合使用以发现优势人群或许可以提高联合治疗的成功率。由于表面抗原在感染者中充当抑制性免疫环境中的重要角色[23]，pgRNA 在评估 CHB 免疫治疗疗效中的应用价值值得进一步探索。除此之外，本研究以 100 U/mL 作为临界进行分析后，发现高 pgRNA 组患者的 HBsAg≥100 U/mL的比例更高。有研究发现 NA 巩固治疗 3 年以上且 HBsAg<100 U/mL 的情况下，停药后或可产生持续的病毒学应答[10]。因此，pgRNA 低于检测下限或许提示 NA 停药后复发风险降低。
综上，本研究显示，高 pgRNA 患者 HBsAg≥100 U/mL 的比例更高。本研究通过收集高 pgRNA 患者的临床资料并进行整理分析，以期望总结高 HBV pgRNA 人群的临床特征。因目前临床上 HBV pgRNA 检测的开展相对有限，本研究可能对将来 pgRNA 作为新的血清学标志物的研究方向具有一定的意义。然而，本研究缺乏患者治疗前的相关数据，无法在治疗前后进行比较。并且未对患者是否发生肝脏相关不良事件进行随访。因此，仍需进一步延长随访时间和扩大样本量，帮助进行进一步的研究。
作者贡献：徐恬、张昀哲负责论文撰写和修改；雷学忠负责论文选题和指导撰写文章并最后定稿。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
乙型病毒性肝炎（乙肝）目前仍是世界性的公共卫生难题，全球有超过 2.5 亿人感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV），每年有超过 78 万人死于乙肝[1]。肝癌是全球癌症相关死亡的第二大原因[2]，而约有 40%的肝细胞癌来源于未得到控制的慢性乙肝（chronic hepatitis B, CHB），我国的这一比例更高，达 70%以上[3]。CHB 患者的全程管理对于减少乙肝相关不良事件的发生非常重要，包括对疾病活动性的长期监测、在合适的时期选择合适的抗病毒治疗方案、治疗效果的评估、预后预测及预防管理。目前，临床上主要基于 HBV 感染患者血清中几种生物标志物的水平，包括丙氨酸转氨酶（alanine transaminase, ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate transaminase, AST）、HBV 表面抗原（HBV surface antigen, HBsAg）和病毒 DNA 等，进行疾病分期和临床管理[4]。肝内 HBV 共价闭合环状 DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA）水平是目前被认为反映病毒活跃程度及抗病毒治疗反应最直接的指标[5]。目前血清学检查无法直接检测 HBV cccDNA，其检查依赖于有创性的肝脏活检，因此，有必要开发无创的替代标志物来监测 ccc DNA 的数量或活性[6]。HBV 前基因组 RNA（pregenomic RNA, pgRNA）是 HBV 复制的中间产物，理论上 HBV pgRNA 的唯一来源为肝内 cccDNA，因此 pgRNA 有望成为替代 cccDNA 的血清学标志物。已有研究表明相比其他血清学标志物，血清 HBV DNA 联合 pg RNA 在核苷类似物（nucleotide analogue, NA）治疗前和治疗期间，与肝内 cccDNA 的相关性更好[7]。临床上通常将功能性治愈作为 CHB 治疗的目标，我国目前治疗 CHB 的主要药物为 NA 及干扰素[8]。而 NA 往往是患者开始抗病毒治疗的第一步，治疗方案的选择及治疗过程中的药效评估均需要更优的血清学标志物提供依据。pgRNA 作为一种新的血清学标志物，有必要进一步研究其在临床实践中的价值。本研究试图通过分析高 HBV pgRNA 人群的临床特征，进一步探索 pgRNA 在 CHB 患者管理中的价值。
1 对象与方法
1.1 研究对象
纳入 2020 年 12 月 1 日－2022 年 4 月 1 日于四川大学华西医院感染性疾病中心肝炎门诊治疗随访的长期使用 NA 治疗的 CHB 患者。纳入标准：① 根据《慢性乙型肝炎防治指南（2019 年版）》[9]确诊的 CHB 患者；② 接受目前常用的 NA 即恩替卡韦、富马酸丙酚替诺福韦或富马酸替诺福韦酯治疗 1 年以上。排除标准：① 年龄<18 岁；② 肝硬化和恶性肿瘤患者；③ 存在免疫缺陷的患者；④ 资料不全的患者。本研究由四川大学华西医院生物医学伦理分委会批准，批件号为 2016 年审（91）号，并获得了所有患者的知情同意。
1.2 研究方法
1.2.1 一般资料收集
收集入组患者的基本信息，包括性别和年龄。
1.2.2 血液指标采集和检测
① 实验室指标：本研究中所有患者的血样采集集中在 2022 年 1 月1日－2022年4月1日，检测的指标主要包括反映肝脏本身炎症程度的指标，包括 ALT、AST、γ-谷氨酰转移酶（γ-glutamyl transferase, GGT）和甲胎蛋白，以及反映 HBV 感染的标志物，包括 HBsAg、HBV e 抗原（HBV e antigen, HBeAg）和 HBV DNA，所有实验室检测项目均在四川大学华西医院检验科进行。
② HBV pgRNA：本研究使用 HBV 核酸测定试剂盒（上海仁度生物科技股份有限公司）测定 pgRNA。检测方法包括核酸捕获及实时荧光核酸等温扩增检测。将 250 μL 的待测血清样本与病毒核酸提取液混合后，在 60℃下孵育 10 min，随后进行室温冷却以促进 RNA 捕获探针与靶标 RNA 的结合。通过磁性颗粒捕获靶标 RNA 并使用洗涤液清洗 2 次，最后将纯净的 RNA 复合物加入扩增检测液中。扩增检测液体系由扩增检测液 1、扩增检测液 2 和酶液组成，扩增反应在 42℃下进行 40 min。反应体系中使用了实时荧光核酸等温扩增检测技术，通过荧光探针实时检测 RNA 产物的扩增情况。荧光信号的强度与样本中靶标 RNA 的浓度成比例，最终由检测仪器实时采集荧光信号并进行定量分析。每个检测反应都包含内标以监控样本处理的质量。系统通过校准曲线自动确定样本中的 HBV RNA 浓度，报告的单位为拷贝数/mL。按照 HBV 核酸测定试剂盒说明书中介绍的使用方法，根据检测结果进行数据分析，并结合临床表现进行综合判断。根据 pgRNA 的检测下限值，将 HBV pgRNA≥15 拷贝数/mL 的患者归为高 pgRNA 组，pgRNA 低于检测下限（即＜15 拷贝数/mL）归为低 pgRNA 组。为了进一步探究 pgRNA 在预测CHB安全停药中的应用价值，鉴于有研究显示 HBsAg＜100 U/mL 时停药风险较低[10]，故统计了两组中 HBsAg＜100 U/mL 的患者数量。
1.3 统计学方法
使用 SPSS 27.0 软件进行统计分析。计数资料以频数和/或百分比表示，组间比较采用 χ2 检验。所有计量资料均不符合正态分布，以中位数（下四分位数，上四分位数）描述，组间比较采用 Mann-Whitney U 检验。双侧检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 入组患者的整体情况
排除了有长期激素服用史的患者 9 例，患有肝细胞癌的患者 7 例，临床资料不完整的患者 1 例后，本次研究共纳入了 107 例患者。男性患者占比 66.4%（71/107），平均年龄为 44.02 岁。HBeAg 阳性患者占 76.6%（82/107）。16.8%（18/107）的患者存在 ALT 升高（≥50 U/L），11.2%（12/107）的患者存在 AST 升高（≥40 U/L），HBV DNA 高于检测值上限（5 U/mL）的患者占 62.6%（67/107）。高 pgRNA 组和低 pgRNA 组分别有 45 例（42.1%）和 62 例（57.9%）患者。
2.2 高 pgRNA 组与低 pgRNA 组 CHB 患者的临床特征比较
高 pgRNA 组与低 pgRNA 组的性别、年龄、AST、ALT、GGT、HBsAg、HBeAg≥0.1 U/mL 的患者比例、HBV DNA、甲胎蛋白差异均无统计学意义（P＞0.05）。高 pgRNA 组 HBsAg＜100 U/mL 的患者比例低于低 pgRNA 组（P＜0.05）。见表1。
表1
高 pgRNA 组与低 pgRNA 组 CHB 患者的临床特征比较
3 讨论
目前，CHB 的治疗目标倾向于临床治愈[11]，但由于 HBV cccDNA 作为持久性的病毒储存库持续存在于受感染的肝细胞内[12]，导致部分已经实现临床治愈的患者停药后出现病毒学复发[13]，导致 CHB 完全治愈成为遥不可及的治疗目标。因此，根除 cccDNA 对实现 CHB 治愈具有十分重要的意义。目前有很多治愈类药物研究都以 cccDNA 作为直接或间接的靶点[14]，为了更加经济、无创地评估体内 cccDNA 活动性和/或水平，以更加方便的血清学标志物检测替代肝脏活检必然也是未来探索的方向。
由于肝脏穿刺的有创性，临床医生判断 CHB 患者体内的病毒活跃程度及肝脏炎症反应主要依赖于传统的病毒学指标及血液肝脏相关生化指标[15]。HBV pgRNA 这一新的指标越来越受到关注，它通常被视为具有反映 HBV cccDNA 复制活性、指导停药时间或评估 NA 治疗预后潜力的血清学指标[16]。针对 pgRNA 预测价值的研究也日益增多。有研究表明，HBV pgRNA 可用于区分治疗前慢性感染期和慢性肝炎期，尤其是在 HBeAg 阴性患者中，有助于判断某些患者是否需要早期积极抗病毒治疗[17]。也有研究发现血清 HBV pgRNA 水平与进展为肝硬化和肝细胞癌的风险具有正相关关系[18]。
本研究显示，高 pgRNA 组与低 pgRNA 组的 HBsAg 水平差异无统计学意义，可能是由于样本量较小而导致检验效能不足，也可能提示 HBsAg 的产生主要归因于患者体内的整合 HBV DNA 而不是 cccDNA[19]。目前临床上常用的治疗方案包括 NA 和聚乙二醇干扰素，临床治愈往往需要两者联合用药[20]，并且有研究表明，基线 HBsAg<1 500 U/mL 的患者中，NA 联合聚乙二醇干扰素具有更高的 HBsAg 清除率[21]。由于干扰素价格昂贵，且具有相较于 NA 更多的药物副作用，因此要求临床医生对联合治疗方案优势人群的判断更加精确。理论上，pgRNA 可以反映出体内 cccDNA 作为病毒储存库而产生的 HBsAg[22]，这将不受到体内本身存在的不断循环的 HBsAg 的影响，因此将 pgRNA 和 cccDNA 联合使用以发现优势人群或许可以提高联合治疗的成功率。由于表面抗原在感染者中充当抑制性免疫环境中的重要角色[23]，pgRNA 在评估 CHB 免疫治疗疗效中的应用价值值得进一步探索。除此之外，本研究以 100 U/mL 作为临界进行分析后，发现高 pgRNA 组患者的 HBsAg≥100 U/mL的比例更高。有研究发现 NA 巩固治疗 3 年以上且 HBsAg<100 U/mL 的情况下，停药后或可产生持续的病毒学应答[10]。因此，pgRNA 低于检测下限或许提示 NA 停药后复发风险降低。
综上，本研究显示，高 pgRNA 患者 HBsAg≥100 U/mL 的比例更高。本研究通过收集高 pgRNA 患者的临床资料并进行整理分析，以期望总结高 HBV pgRNA 人群的临床特征。因目前临床上 HBV pgRNA 检测的开展相对有限，本研究可能对将来 pgRNA 作为新的血清学标志物的研究方向具有一定的意义。然而，本研究缺乏患者治疗前的相关数据，无法在治疗前后进行比较。并且未对患者是否发生肝脏相关不良事件进行随访。因此，仍需进一步延长随访时间和扩大样本量，帮助进行进一步的研究。
作者贡献：徐恬、张昀哲负责论文撰写和修改；雷学忠负责论文选题和指导撰写文章并最后定稿。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
