引用本文： 王永康, 余玮, 克力木·阿不都热依木, 买买提·依斯热依力. 醛脱氢酶 18 家族成员 A1 在食管癌细胞中结合的靶标及测序分析. 华西医学, 2024, 39(8): 1188-1194. doi: 10.7507/1002-0179.202401287 复制
目前，关于食管癌的发病模式和关键病因尚不清晰[1]。研究表明，当食管细胞的基因表达过程发生变化（突变）时，其有可能发展成食管癌。近年来，RNA 结合蛋白（RNA binding protein, RBP）因在揭示各类疾病机制方面的重要作用而被关注[2-3]。进而，其在肿瘤中的作用也逐渐被重视。RBP 能与双链或单链 RNA 结合，在转录和转录后调控中发挥关键作用。RBP 可以影响 RNA 的整个生命周期，包括剪接、修饰、翻译、细胞内定位和降解等。通过这种机制，RNA 结合蛋白在肿瘤的发展中发挥着重要作用[4]。RBP 在各种人类癌症中失调，对肿瘤的发展和进展有潜在的作用[5]。
醛脱氢酶 18 家族成员 A1（aldehyde dehydrogenase 18 family member A1，ALDH18A1）作为一种 RNA 结合蛋白，其具有结合靶标基因的 RNA 来调控靶标基因一系列生物学过程的能力。在乳腺癌中 ALDH18A1 作为人表皮生长因子受体 2（human epidermal growth factor receptor-2, HER2）特异性 RNA 结合蛋白，它与乳腺癌的侵袭性相关[6-7]。ALDH18A1 能够调控转录因子表达并参与转录调控过程。在神经母细胞瘤的生长中，ALDH18A1 在转录和转录后都能调节原癌基因的表达，从而 ALDH18A1 能够作为神经母细胞瘤细胞增殖、自我更新和引起肿瘤发生的调节剂[8]。同时，ALDH18A1 表达水平上调与肺癌的发生和发展密切相关[9]。而敲低 ALDH18A1 靶向脯氨酸生物合成能显著抑制黑色素瘤细胞和异种肿瘤的生长[10]。因而可推测 ALDH18A1 可能通过与信使 RNA（messenger RNA, mRNA）结合，从而调控食管癌相关基因的表达过程。因此，本文通过 RNA 免疫共沉淀测序（RNA immunoprecipitation sequencing, RIP-seq）技术鉴定食管癌细胞（KYSE150）中 ALDH18A1 结合的 RNA，以探究 ALDH18A1 在 KYSE150 细胞中作用靶标、影响基因表达和食管癌相关的生物学过程，为进一步研究食管癌细胞中 ALDH18A1 相互作用的综合调控提供依据。
1 材料与方法
1.1 主要材料与仪器
RPMI-1640 培养基（北京索莱宝科技有限公司）；胎牛血清、链霉素和青霉素（美国赛默飞世尔科技公司）；无菌 1%磷酸缓冲盐溶液（北京索莱宝科技有限公司）；Lipofectamine 2000 转染试剂（美国赛默飞世尔科技公司）；总 RNA 提取试剂（北京索莱宝科技有限公司）；微球菌核酸酶（美国赛默飞世尔科技公司）；RQⅠ无核糖核酸酶活性 DNA 酶［普洛麦格（北京）生物技术有限公司］；特异性多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；蛋白酶 K（上海罗氏制药有限公司）；Trizol 试剂（美国赛默飞世尔科技公司）；多聚核苷酸激酶缓冲液（美国赛默飞世尔科技公司）；KAPA RNA HyperPrep 试剂盒（上海罗氏制药有限公司）；低温超速离心机［大龙兴创实验仪器（北京）股份公司］；水平离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；NovaSeq 6000 基因测序仪（美国因美纳公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
选用 KYSE150 细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司）在 37°C、5%二氧化碳条件下，培养于含 10%胎牛血清、100 μg/mL 链霉素和 100 U/mL 青霉素的 RPMI-
1.2.2 细胞裂解和 RNA 片段处理
KYSE150 细胞以 400 mJ/cm2 照射 1 次，并在冰洗缓冲液中裂解。细胞裂解在冷洗缓冲液［1 倍标准浓度×磷酸缓冲盐溶液（0.01 mol/L 浓度），0.1%十二烷基硫酸钠，0.5% 乙基苯基聚乙二醇和 0.5%脱氧胆酸钠］中进行，并添加 200 U/mL RNA 酶（RNase）抑制剂和蛋白酶抑制剂鸡尾酒，并在冰上孵育 30 min。在 4℃条件下，离心半径 8.4 cm，
1.2.3 免疫共沉淀
将上清液的 1%用于 Input（阳性对照组，未免疫沉淀）样本，将上清液加入 10 μL ALDH18A1 抗体进行免疫沉淀，使用免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）G抗体作为阴性对照，4℃孵育过夜。将免疫沉淀物与蛋白 A/G 磁珠在 4℃下孵育 2 h。移除上清液后，依次使用裂解液、高盐缓冲液和多聚核苷酸激酶缓冲液洗涤 2 次。将悬液 70°C 孵育 20 min，释放含有交联 RNA 和免疫沉淀的 RBP。将细胞裂解液转移到一个干净的 1.5 mL 微孔管中。将蛋白酶 K 加入到 Input 组和免疫沉淀的 RBP 与交联 RNA 中，最终浓度为 1.2 mg/mL。在 55°C 下孵育 120 min。用 Trizol 试剂纯化 RNA。
1.2.4 RIP -seq 文库制备和测序
基因文库（cDNA 文库）采用 KAPA RNA HyperPrep 试剂盒，为 RNA 进行高通量测序文库构建，依照说明程序制备 cDNA 文库。对于高通量测序，文库按照说明制备，并应用于 Illumina NovaSeq 测序系统 150 碱基对（base pairs, bp）双端测序。
1.2.5 分析数据
采用快速将测序数据进行快速剪接映射的程序（TopHat 2）将序列比对到参考基因组上，仅使用唯一映射的读段进行后续分析。采用“ABLIRC”策略（用于峰值调用和分析测序数据集的工作流程）鉴定 ALDH18A1 在基因组上的结合区域。通过模体分析软件软件（HOMER）调用免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）蛋白的结合基序。并通过对 RNA 免疫共沉淀组（ALDH18A1 IP 组）和 Input 组分别进行模拟分析，并去除与 Input 组峰重叠的 ALDH18A1 IP 组峰。最终通过峰关联分析 ALDH18A1 的靶基因。
1.2.6 数据筛选
在数据分析过程中，具有至少 1 bp 重叠的读数被聚为峰。对每个基因，计算模拟生成的测序序列，其数量和长度与峰中的测序序列相同。输出序列进一步映射到相同基因，以从重叠的序列中生成随机的最大峰值高度。全过程重复 500 次。选取观测到的峰高高于随机最大值的峰（P<0.05）。
1.2.7 功能富集分析
为了筛选出峰相关基因（靶基因）的功能类别，使用基因功能富集平台 KOBAS 2.0 对其京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析。采用超几何检验和 Benjamini-Hochberg 方法控制错误发现率（false discovery rate, FDR）控制程序来定义各项的富集程度[11]。
1.3 统计学方法
运用 GraphPad Prism9.0 软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用 t 检验。计数资料以频数表示。双侧检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 ALDH18A1 的 RNA 免疫共沉淀实验
蛋白质免疫印迹实验检测免疫共沉淀效率见图1。在 2 次重复实验样本中，目的蛋白被抗体较好富集，免疫共沉淀有效率，且样本具有复现性。
图1
蛋白质免疫印实验检测免疫共沉淀效率
Input：阳性对照；ALDH18A1 IP：醛脱氢酶 18 家族成员 A1 免疫共沉淀；IgG：免疫球蛋白G（阴性对照）；ALDH18A1：醛脱氢酶 18 家族成员 A1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶； Marker：标准蛋白分子量
2.2 高通量测序
通过对文库行双端 150 bp 测序，ALDH18A1 IP1、ALDH18A1 IP 2、 ALDH18A1 input 1 和 ALDH18A1 input 2 组得到的原始序列数分别为 54954362、51141638、50138652 和 53333480，而得到的有效序列数及其占原始序列数的比例分别为 49185406（89.50%）、45900183（89.75%）、42278596（84.32%）和 46763964（87.68%）。
同时，使用 TopHat2 软件，比对到参考基因组的有效测序数据，结果显示 ALDH18A1 IP1、ALDH18A1 IP2、ALDH18A1 input1 和 ALDH18A1 input2 组由测序得到的有效序列数能定位到基因组上的序列数及占比分别为 35372992（71.9 2%）、30357175（66.14%）、28459639（67.31%）和 31000823（66.29%），其中比对到有义链上的序列数占比为 89.77%、91.35%、77.82%和 84.08%，而比对到反义链上的序列数占比为 10.23%、8.65%、22.18%和 15.92%。
测序序列在基因组上的分布及占比见图2。RNA 免疫共沉淀实验质量控制较好，样本具备复现性。测序序列在基因组各个分区情况结果显示，相对于 input 组，ALDH18A1-IP 组的测序序列在编码区、内含子和 5’非翻译区区域明显富集，内含子最显著。
图2
测序序列在基因组上的分布及占比
a. ALDH18A1 input 1 在不同区域的比例；b. ALDH18A1 input 2 在不同区域的比例；c. ALDH18A1 IP 1 在不同区域的比例；d. ALDH18A1 IP 2 在不同区域的比例；e. 全基因组的读数分布条形图。ALDH18A1：醛脱氢酶 18 家族成员 A1；Input：阳性对照；ALDH18A1 IP：醛脱氢酶 18 家族成员 A1 免疫共沉淀
2.3 结合峰分析
对 2 次重复实验获得的结合区域进行峰值识别，其结果显示 2 次重复实验获得 8 258 个 ALDH18A1 结合区域（图3a）。基序分析结果显示，2 次重复实验获得的 ALDH18A1 的结合基序一致性较好，ALDH18A1 主要结合在 RNA 的 UGUAAUC 基序（图3b）；且 UGUAAUC 基序也主要分布在内含子和编码区（图4）。
图3
ALDH18A1 结合峰的情况
a. 维恩图显示 2 个实验中得到的 ALDH18A1 结合峰的重叠情况；b. ALDH18A1 的前 5 个峰值首选结合基序。Rank：序列；Motif：基序
图4
结合峰在基因组上的分布及占比
a.
2.4 结合峰相关基因 KEGG Pathway 富集分析
排名前 10 位的代谢通路的结合峰相关基因的功能 KEGG 分析见图5。进一步对实验中重复出现的 ALDH18A1 结合峰关联的基因进行 KEGG 分析的结果表明，ALDH18A1 结合的 mRNA 分子主要参与了在对焦点黏附、癌症的中心碳代谢、细胞周期、剪接体、RNA 运输、泛素介导的蛋白水解等生物学过程高度富集（图5）。
图5
排名前 10 位的代谢通路的结合峰相关基因的功能 KEGG 分析
a. ALDH18A1 IP 1 结合峰相关的基因的 KEGG 分析；b. ALDH18A1 IP 2 结合峰相关的基因的 KEGG 聚类分析。代谢通路所对应的柱体越长说明该条目下基因数越多、富集后越显著
3 讨论
在哺乳动物体内，RNA 结合蛋白参与调控 mRNA 可变剪接，在肿瘤细胞内，可变剪接的功能紊乱是一种常见特性，其原因主要是 RBP 功能的改变[12]。RBP 也能够调节肿瘤中转录本的多聚腺苷酸化和 mRNA 的稳定性。RBP 通过转录后调节靶 RNA 转录物的表达，在细胞生理学中发挥着关键作用。通过调节癌症相关 mRNA 转录物的加工、稳定性和翻译，大量 RBP 在各种类型的癌症中发挥着重要作用[13-14]。RBP 活性的扰动与癌症发展、肿瘤代谢、耐药性、癌症干细胞自我更新和肿瘤免疫逃避有因果关系。这种机制在建立和维持细胞极性上是非常关键的，而肿瘤细胞中该机制常常被改变[15]。在 mRNA 的翻译过程中，RBP 对于诱导 mRNA 环化和翻译激活是必不可少的，在癌症中几乎所有相关基因信号通路都会发生变化，这一过程与 RBP 调控 mRNA 的翻译密不可分[16]。ALDH18A1 作为一种重要的 RNA 结合蛋白，在推动癌症的发生发展过程中起着重要的作用。多项研究数据表明，ALDH18A1 与癌症发生、发展和预后过程存在相关性[17-18]。鉴于以上基础，本研究小组进行了一些研究以全面了解 ALDH18A1 在食道癌发生发展中的功能。
鉴于 RBP 在转录后调控中的关键作用，癌细胞可以合理地利用 RBP 功能障碍来调节各种癌症相关转录本，从而获得肿瘤发生优势。在 mRNA 生命周期的每个阶段，包括成熟（加帽、剪接和多聚腺苷酸化）、修饰、翻译和衰变，与某些 RBP 的相互作用对细胞来说是极其动态和关键的，随着越来越多的证据表明 RNA 经历了许多修饰，这些修饰在正常和疾病发展中起着关键作用，RBP 的广泛功能使它们在疾病发展过程中（尤其是癌症）在 RBP-RNA 调节网络中发挥着核心作用[19-20]。前体 mRNA 能够通过可变剪接产生多种异构体，以执行相似或不同的生物学功能。可变剪接已被证明与许多疾病的发生有关，包括一些神经性疾病和肿瘤等，研究发现紫杉醇能够促进上皮细胞转化序列 2 发生可变剪接产生更短的剪接变体上皮细胞转化序列 2-S，影响了 Wnt 通路和细胞增殖过程，从而抑制肿瘤进展[21]。可变剪接过程受到多种 RNA 结合蛋白的精密调控。然而，ALDH18A1 被发现作为一种潜在的 RBP，在 Hela 细胞中被发现 ALDH18A1 可作为 RNA 结合蛋白，并在某些情况下可调节其靶 mRNA 的表达从而影响不同的代谢途径[22]。
在本研究中，相对于对照组，ALDH18A1-RNA 免疫共沉淀测序分析结果表明，ALDH 18A1 结合在编码区、内含子和 5’非翻译区的区域显著富集；ALDH18A1 主要结合在 RNA 的 UGUAAUC 基序；结果表明 ALDH18A1 可能具有调控 mRNA 可变剪接功能。RIP-seq 数据综合 KEGG 分析显示，ALDH18A1 结合的 mRNA 分子参与了多种重要途径，包括在对焦点黏附、癌症的中心碳代谢、细胞周期、剪接体、RNA 运输和泛素介导的蛋白水解等生物学过程高度富集。因此，ALDH18A1 可能影响食管癌相关的生物学过程。本研究对于 ALDH18A1 的功能，及其在食管癌细胞中的作用提供了新的数据支持和研究方向。
总的来说，RIP-seq 方法可确定被 RNA 结合蛋白结合的完整的 RNA 生物分子。在此，本研究从 RIP-seq 结果中确定了 ALDH18A1 蛋白的结合峰和基序，分析了结合峰相关基因相关的生物学过程。因此，可推测 ALDH18A1 可调节 KYSE150 细胞的选择性剪接。这些发现支持 ALDH18A1 可能通过影响其蛋白表达水平，从而在食管癌中发挥功能，进一步扩展了对其作为临床治疗靶标的作用机制认识。
综上，本研究采用测序方法揭示 ALDH18A1 结合靶标，结果显示 ALDH18A1 结合的 mRNA 分子主要参与的生物学过程与肿瘤的发生发展密切相关。这为以后研究食管癌细胞中 ALDH18A1 相互作用的综合调控提供了依据。然而，这些功能还未得到进一步验证，为明确 ALDH18A1 在食管癌细胞中的具体作用，本研究小组将进一步通过 CCK-8 实验和CTG实验观察目的基因对细胞的增殖能力和活力产生的影响，下一步将挑选潜在的靶标 RNA 进行互作实验验证。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
目前，关于食管癌的发病模式和关键病因尚不清晰[1]。研究表明，当食管细胞的基因表达过程发生变化（突变）时，其有可能发展成食管癌。近年来，RNA 结合蛋白（RNA binding protein, RBP）因在揭示各类疾病机制方面的重要作用而被关注[2-3]。进而，其在肿瘤中的作用也逐渐被重视。RBP 能与双链或单链 RNA 结合，在转录和转录后调控中发挥关键作用。RBP 可以影响 RNA 的整个生命周期，包括剪接、修饰、翻译、细胞内定位和降解等。通过这种机制，RNA 结合蛋白在肿瘤的发展中发挥着重要作用[4]。RBP 在各种人类癌症中失调，对肿瘤的发展和进展有潜在的作用[5]。
醛脱氢酶 18 家族成员 A1（aldehyde dehydrogenase 18 family member A1，ALDH18A1）作为一种 RNA 结合蛋白，其具有结合靶标基因的 RNA 来调控靶标基因一系列生物学过程的能力。在乳腺癌中 ALDH18A1 作为人表皮生长因子受体 2（human epidermal growth factor receptor-2, HER2）特异性 RNA 结合蛋白，它与乳腺癌的侵袭性相关[6-7]。ALDH18A1 能够调控转录因子表达并参与转录调控过程。在神经母细胞瘤的生长中，ALDH18A1 在转录和转录后都能调节原癌基因的表达，从而 ALDH18A1 能够作为神经母细胞瘤细胞增殖、自我更新和引起肿瘤发生的调节剂[8]。同时，ALDH18A1 表达水平上调与肺癌的发生和发展密切相关[9]。而敲低 ALDH18A1 靶向脯氨酸生物合成能显著抑制黑色素瘤细胞和异种肿瘤的生长[10]。因而可推测 ALDH18A1 可能通过与信使 RNA（messenger RNA, mRNA）结合，从而调控食管癌相关基因的表达过程。因此，本文通过 RNA 免疫共沉淀测序（RNA immunoprecipitation sequencing, RIP-seq）技术鉴定食管癌细胞（KYSE150）中 ALDH18A1 结合的 RNA，以探究 ALDH18A1 在 KYSE150 细胞中作用靶标、影响基因表达和食管癌相关的生物学过程，为进一步研究食管癌细胞中 ALDH18A1 相互作用的综合调控提供依据。
1 材料与方法
1.1 主要材料与仪器
RPMI-1640 培养基（北京索莱宝科技有限公司）；胎牛血清、链霉素和青霉素（美国赛默飞世尔科技公司）；无菌 1%磷酸缓冲盐溶液（北京索莱宝科技有限公司）；Lipofectamine 2000 转染试剂（美国赛默飞世尔科技公司）；总 RNA 提取试剂（北京索莱宝科技有限公司）；微球菌核酸酶（美国赛默飞世尔科技公司）；RQⅠ无核糖核酸酶活性 DNA 酶［普洛麦格（北京）生物技术有限公司］；特异性多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；蛋白酶 K（上海罗氏制药有限公司）；Trizol 试剂（美国赛默飞世尔科技公司）；多聚核苷酸激酶缓冲液（美国赛默飞世尔科技公司）；KAPA RNA HyperPrep 试剂盒（上海罗氏制药有限公司）；低温超速离心机［大龙兴创实验仪器（北京）股份公司］；水平离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；NovaSeq 6000 基因测序仪（美国因美纳公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
选用 KYSE150 细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司）在 37°C、5%二氧化碳条件下，培养于含 10%胎牛血清、100 μg/mL 链霉素和 100 U/mL 青霉素的 RPMI-
1.2.2 细胞裂解和 RNA 片段处理
KYSE150 细胞以 400 mJ/cm2 照射 1 次，并在冰洗缓冲液中裂解。细胞裂解在冷洗缓冲液［1 倍标准浓度×磷酸缓冲盐溶液（0.01 mol/L 浓度），0.1%十二烷基硫酸钠，0.5% 乙基苯基聚乙二醇和 0.5%脱氧胆酸钠］中进行，并添加 200 U/mL RNA 酶（RNase）抑制剂和蛋白酶抑制剂鸡尾酒，并在冰上孵育 30 min。在 4℃条件下，离心半径 8.4 cm，
1.2.3 免疫共沉淀
将上清液的 1%用于 Input（阳性对照组，未免疫沉淀）样本，将上清液加入 10 μL ALDH18A1 抗体进行免疫沉淀，使用免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）G抗体作为阴性对照，4℃孵育过夜。将免疫沉淀物与蛋白 A/G 磁珠在 4℃下孵育 2 h。移除上清液后，依次使用裂解液、高盐缓冲液和多聚核苷酸激酶缓冲液洗涤 2 次。将悬液 70°C 孵育 20 min，释放含有交联 RNA 和免疫沉淀的 RBP。将细胞裂解液转移到一个干净的 1.5 mL 微孔管中。将蛋白酶 K 加入到 Input 组和免疫沉淀的 RBP 与交联 RNA 中，最终浓度为 1.2 mg/mL。在 55°C 下孵育 120 min。用 Trizol 试剂纯化 RNA。
1.2.4 RIP -seq 文库制备和测序
基因文库（cDNA 文库）采用 KAPA RNA HyperPrep 试剂盒，为 RNA 进行高通量测序文库构建，依照说明程序制备 cDNA 文库。对于高通量测序，文库按照说明制备，并应用于 Illumina NovaSeq 测序系统 150 碱基对（base pairs, bp）双端测序。
1.2.5 分析数据
采用快速将测序数据进行快速剪接映射的程序（TopHat 2）将序列比对到参考基因组上，仅使用唯一映射的读段进行后续分析。采用“ABLIRC”策略（用于峰值调用和分析测序数据集的工作流程）鉴定 ALDH18A1 在基因组上的结合区域。通过模体分析软件软件（HOMER）调用免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）蛋白的结合基序。并通过对 RNA 免疫共沉淀组（ALDH18A1 IP 组）和 Input 组分别进行模拟分析，并去除与 Input 组峰重叠的 ALDH18A1 IP 组峰。最终通过峰关联分析 ALDH18A1 的靶基因。
1.2.6 数据筛选
在数据分析过程中，具有至少 1 bp 重叠的读数被聚为峰。对每个基因，计算模拟生成的测序序列，其数量和长度与峰中的测序序列相同。输出序列进一步映射到相同基因，以从重叠的序列中生成随机的最大峰值高度。全过程重复 500 次。选取观测到的峰高高于随机最大值的峰（P<0.05）。
1.2.7 功能富集分析
为了筛选出峰相关基因（靶基因）的功能类别，使用基因功能富集平台 KOBAS 2.0 对其京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析。采用超几何检验和 Benjamini-Hochberg 方法控制错误发现率（false discovery rate, FDR）控制程序来定义各项的富集程度[11]。
1.3 统计学方法
运用 GraphPad Prism9.0 软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用 t 检验。计数资料以频数表示。双侧检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 ALDH18A1 的 RNA 免疫共沉淀实验
蛋白质免疫印迹实验检测免疫共沉淀效率见图1。在 2 次重复实验样本中，目的蛋白被抗体较好富集，免疫共沉淀有效率，且样本具有复现性。
图1
蛋白质免疫印实验检测免疫共沉淀效率
Input：阳性对照；ALDH18A1 IP：醛脱氢酶 18 家族成员 A1 免疫共沉淀；IgG：免疫球蛋白G（阴性对照）；ALDH18A1：醛脱氢酶 18 家族成员 A1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶； Marker：标准蛋白分子量
2.2 高通量测序
通过对文库行双端 150 bp 测序，ALDH18A1 IP1、ALDH18A1 IP 2、 ALDH18A1 input 1 和 ALDH18A1 input 2 组得到的原始序列数分别为 54954362、51141638、50138652 和 53333480，而得到的有效序列数及其占原始序列数的比例分别为 49185406（89.50%）、45900183（89.75%）、42278596（84.32%）和 46763964（87.68%）。
同时，使用 TopHat2 软件，比对到参考基因组的有效测序数据，结果显示 ALDH18A1 IP1、ALDH18A1 IP2、ALDH18A1 input1 和 ALDH18A1 input2 组由测序得到的有效序列数能定位到基因组上的序列数及占比分别为 35372992（71.9 2%）、30357175（66.14%）、28459639（67.31%）和 31000823（66.29%），其中比对到有义链上的序列数占比为 89.77%、91.35%、77.82%和 84.08%，而比对到反义链上的序列数占比为 10.23%、8.65%、22.18%和 15.92%。
测序序列在基因组上的分布及占比见图2。RNA 免疫共沉淀实验质量控制较好，样本具备复现性。测序序列在基因组各个分区情况结果显示，相对于 input 组，ALDH18A1-IP 组的测序序列在编码区、内含子和 5’非翻译区区域明显富集，内含子最显著。
图2
测序序列在基因组上的分布及占比
a. ALDH18A1 input 1 在不同区域的比例；b. ALDH18A1 input 2 在不同区域的比例；c. ALDH18A1 IP 1 在不同区域的比例；d. ALDH18A1 IP 2 在不同区域的比例；e. 全基因组的读数分布条形图。ALDH18A1：醛脱氢酶 18 家族成员 A1；Input：阳性对照；ALDH18A1 IP：醛脱氢酶 18 家族成员 A1 免疫共沉淀
2.3 结合峰分析
对 2 次重复实验获得的结合区域进行峰值识别，其结果显示 2 次重复实验获得 8 258 个 ALDH18A1 结合区域（图3a）。基序分析结果显示，2 次重复实验获得的 ALDH18A1 的结合基序一致性较好，ALDH18A1 主要结合在 RNA 的 UGUAAUC 基序（图3b）；且 UGUAAUC 基序也主要分布在内含子和编码区（图4）。
图3
ALDH18A1 结合峰的情况
a. 维恩图显示 2 个实验中得到的 ALDH18A1 结合峰的重叠情况；b. ALDH18A1 的前 5 个峰值首选结合基序。Rank：序列；Motif：基序
图4
结合峰在基因组上的分布及占比
a.
2.4 结合峰相关基因 KEGG Pathway 富集分析
排名前 10 位的代谢通路的结合峰相关基因的功能 KEGG 分析见图5。进一步对实验中重复出现的 ALDH18A1 结合峰关联的基因进行 KEGG 分析的结果表明，ALDH18A1 结合的 mRNA 分子主要参与了在对焦点黏附、癌症的中心碳代谢、细胞周期、剪接体、RNA 运输、泛素介导的蛋白水解等生物学过程高度富集（图5）。
图5
排名前 10 位的代谢通路的结合峰相关基因的功能 KEGG 分析
a. ALDH18A1 IP 1 结合峰相关的基因的 KEGG 分析；b. ALDH18A1 IP 2 结合峰相关的基因的 KEGG 聚类分析。代谢通路所对应的柱体越长说明该条目下基因数越多、富集后越显著
3 讨论
在哺乳动物体内，RNA 结合蛋白参与调控 mRNA 可变剪接，在肿瘤细胞内，可变剪接的功能紊乱是一种常见特性，其原因主要是 RBP 功能的改变[12]。RBP 也能够调节肿瘤中转录本的多聚腺苷酸化和 mRNA 的稳定性。RBP 通过转录后调节靶 RNA 转录物的表达，在细胞生理学中发挥着关键作用。通过调节癌症相关 mRNA 转录物的加工、稳定性和翻译，大量 RBP 在各种类型的癌症中发挥着重要作用[13-14]。RBP 活性的扰动与癌症发展、肿瘤代谢、耐药性、癌症干细胞自我更新和肿瘤免疫逃避有因果关系。这种机制在建立和维持细胞极性上是非常关键的，而肿瘤细胞中该机制常常被改变[15]。在 mRNA 的翻译过程中，RBP 对于诱导 mRNA 环化和翻译激活是必不可少的，在癌症中几乎所有相关基因信号通路都会发生变化，这一过程与 RBP 调控 mRNA 的翻译密不可分[16]。ALDH18A1 作为一种重要的 RNA 结合蛋白，在推动癌症的发生发展过程中起着重要的作用。多项研究数据表明，ALDH18A1 与癌症发生、发展和预后过程存在相关性[17-18]。鉴于以上基础，本研究小组进行了一些研究以全面了解 ALDH18A1 在食道癌发生发展中的功能。
鉴于 RBP 在转录后调控中的关键作用，癌细胞可以合理地利用 RBP 功能障碍来调节各种癌症相关转录本，从而获得肿瘤发生优势。在 mRNA 生命周期的每个阶段，包括成熟（加帽、剪接和多聚腺苷酸化）、修饰、翻译和衰变，与某些 RBP 的相互作用对细胞来说是极其动态和关键的，随着越来越多的证据表明 RNA 经历了许多修饰，这些修饰在正常和疾病发展中起着关键作用，RBP 的广泛功能使它们在疾病发展过程中（尤其是癌症）在 RBP-RNA 调节网络中发挥着核心作用[19-20]。前体 mRNA 能够通过可变剪接产生多种异构体，以执行相似或不同的生物学功能。可变剪接已被证明与许多疾病的发生有关，包括一些神经性疾病和肿瘤等，研究发现紫杉醇能够促进上皮细胞转化序列 2 发生可变剪接产生更短的剪接变体上皮细胞转化序列 2-S，影响了 Wnt 通路和细胞增殖过程，从而抑制肿瘤进展[21]。可变剪接过程受到多种 RNA 结合蛋白的精密调控。然而，ALDH18A1 被发现作为一种潜在的 RBP，在 Hela 细胞中被发现 ALDH18A1 可作为 RNA 结合蛋白，并在某些情况下可调节其靶 mRNA 的表达从而影响不同的代谢途径[22]。
在本研究中，相对于对照组，ALDH18A1-RNA 免疫共沉淀测序分析结果表明，ALDH 18A1 结合在编码区、内含子和 5’非翻译区的区域显著富集；ALDH18A1 主要结合在 RNA 的 UGUAAUC 基序；结果表明 ALDH18A1 可能具有调控 mRNA 可变剪接功能。RIP-seq 数据综合 KEGG 分析显示，ALDH18A1 结合的 mRNA 分子参与了多种重要途径，包括在对焦点黏附、癌症的中心碳代谢、细胞周期、剪接体、RNA 运输和泛素介导的蛋白水解等生物学过程高度富集。因此，ALDH18A1 可能影响食管癌相关的生物学过程。本研究对于 ALDH18A1 的功能，及其在食管癌细胞中的作用提供了新的数据支持和研究方向。
总的来说，RIP-seq 方法可确定被 RNA 结合蛋白结合的完整的 RNA 生物分子。在此，本研究从 RIP-seq 结果中确定了 ALDH18A1 蛋白的结合峰和基序，分析了结合峰相关基因相关的生物学过程。因此，可推测 ALDH18A1 可调节 KYSE150 细胞的选择性剪接。这些发现支持 ALDH18A1 可能通过影响其蛋白表达水平，从而在食管癌中发挥功能，进一步扩展了对其作为临床治疗靶标的作用机制认识。
综上，本研究采用测序方法揭示 ALDH18A1 结合靶标，结果显示 ALDH18A1 结合的 mRNA 分子主要参与的生物学过程与肿瘤的发生发展密切相关。这为以后研究食管癌细胞中 ALDH18A1 相互作用的综合调控提供了依据。然而，这些功能还未得到进一步验证，为明确 ALDH18A1 在食管癌细胞中的具体作用，本研究小组将进一步通过 CCK-8 实验和CTG实验观察目的基因对细胞的增殖能力和活力产生的影响，下一步将挑选潜在的靶标 RNA 进行互作实验验证。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
