主动脉瓣狭窄（aortic stenosis, AS）是先天性因素如瓣叶发育畸形或后天性因素如退行性变、风湿性变诱发的主动脉瓣进行性重塑出现纤维化、钙化，而造成主动脉瓣叶增厚粘连、瓣口狭窄、左心室流出道受阻进而导致左心室不良重塑的疾病[1]。AS 是最常见的心脏瓣膜病，发病率及病死率高，但目前尚无有效的早期干预措施及治疗药物。因此，对 AS 的发病机制进行深入研究，并推动潜在药物治疗靶点的发现显得尤为重要。AS 诱因多样、发病机制复杂。其中，主动脉瓣的主要细胞成分主动脉瓣瓣膜间质细胞（aortic valve interstitial cells, AVIC）发生活化并向成骨分化被认为是 AS 的关键环节[2]。但目前 AVIC 的活化机制尚未阐明。临床前和人体研究数据表明，各种来源的活性氧的不良积累介导了 AS 起始阶段的浸润性脂质的氧化和炎症反应，进而诱导 AVIC 出现肌成纤维细胞样表型活化，且氧化应激水平升高程度与 AS 的严重程度相关[3]。据报道，脂质氧化及其介导的细胞表型转换可受过氧化物酶体增殖物激活受体 γ 共激活因子 1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α, PGC-1α）的调控[4]。PGC-1α 是控制多种核编码的线粒体基因的关键分子，可通过激活多种转录因子调控驱动线粒体呼吸链和脂肪酸氧化酶基因的表达，促使线粒体数目增加、线粒体呼吸能力增强[5]。既往研究表明，PGC-1α 可作为氧化应激的关键抑制因子降低活性氧生成、减少氧化应激及炎症反应[6]。更重要的是，PGC-1α 可通过调控核呼吸因子而调节线粒体转录因子 A、B1、B2 的表达继而调节线粒体基质蛋白的表达发挥活性氧脱毒作用。PGC-1α 包含参与 RNA 调控的蛋白质结构域如丝氨酸/精氨酸和 RNA 识别基序，可直接调控 RNA 的表达，而 AVIC 活化进程中 PGC-1α 是否通过作用于特殊 RNA 而发挥作用仍尚未明确。既往 PGC-1α 免疫共沉淀后的转录组测序结果显示，其可能与钙调蛋白依赖性蛋白激酶 1δ（calcium/calmodulin-dependent protein kinase 1δ, CAMK1δ）、生物钟基因周期蛋白 1（period 1, PER1）、经典瞬时受体电位通道 5（transient receptor potential canonical 5, TRPC5）、叉头框蛋白 O1（fork-head box protein O1, FOXO1）等存在相互作用[7]。目前，PGC-1α 在 AS 关键环节即 AVIC 表型转变中的作用及机制尚未可知。因此，本研究旨在探讨 AVIC 活化进程中 PGC-1α 的表达水平改变情况、作用特点及机制途径。
1 材料与方法
1.1 实验试剂
高糖基础培养基、减血清培养基、0.25% 胰蛋白酶、Lipofectamine RNAiMAX 试剂、Ⅱ型胶原酶、胎牛血清及总 RNA 抽提试剂盒 TRIzol™均购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司；转化生长因子 β1（transforming growth factor β1, TGF-β1）购自北京义翘神州科技股份有限公司；聚偏二氟乙烯膜、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）染液购自美国 Merck 公司；逆转录酶购自日本 Toyobo 公司；实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）荧光染料预混液购自美国 BIO-RAD 公司；Triton®X-100 和 4% 多聚甲醛固定液购自中国 Biosharp 公司；活性氧检测试剂盒（S0033）、细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；小干扰 RNA（small interfering RNA, siRNA）由中国吉玛基因公司合成；辣根酶标记山羊抗兔/小鼠免疫球蛋白 G 购自中国中杉金桥生物公司。抗体信息：Alexa Fluor® 488 Conjugate 荧光二抗和兔抗磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phospho-mammalian target of rapamycin, p-mTOR）抗体购自美国 Cell Signaling Technology 公司；兔抗 β-微管蛋白（β-tubulin）和兔抗 β-肌动蛋白（β-actin）抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；兔 PGC-1α 抗体购自美国 Novus 公司；兔抗骨膜蛋白抗体、兔抗Ⅰ型胶原蛋白抗体、鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）抗体、鼠抗 α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）抗体和兔抗 CAMK1δ 抗体均购自英国 Abcam 公司。
1.2 细胞培养及 AVIC 活化模型构建
用以提取 AVIC 的 6 周龄、体重 200～250 g 的雄性 SD 大鼠购自成都达硕实验动物有限公司（动物操作获四川大学华西医院动物伦理委员会批准，批件号：20230920002）。该研究所使用的主动脉夹层患者来源的主动脉瓣已通过四川大学华西医院生物医学伦理委员会的批准（批准号：201793）。本研究符合赫尔辛基宣言中所述的人体组织使用原则。AVIC 接种于含有 20% 胎牛血清、1% 青霉素-链霉素的高糖培养基中，5% 二氧化碳孵箱中培养，待细胞融合度达 95% 左右进行传代，并将血清减半。
作为诱导成纤维细胞活化的经典刺激，细胞因子 TGF-β1 目前也被广泛用以刺激 AVIC 以诱导其活化[8]，本实验采用 30 ng/mL 的 TGF-β1 重组蛋白构建大鼠 AVIC 活化模型。实验分组（n=4）：① 未加 TGF-β1 的空白对照组；② 加 TGF-β1 刺激 24 h 组；③ 加 TGF-β1 刺激 48 h 组；④ 加 TGF-β1 刺激 72 h 组。通过检测纤维化标志物结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）[9]、骨膜蛋白[10]或Ⅰ型胶原蛋白[11]、α-SMA[12]的表达水平变化评估模型是否构建成功。
1.3 细胞转染及分组
1.3.1 体外 AVIC 过表达重组腺病毒转染及抑制剂干预
为探讨 PGC-1α 在 AVIC 活化进程中的作用，本研究通过腺病毒转染的方法外源特异性过表达/使用过氧化物酶体增殖物激活受体 γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ）拮抗剂 GW9662 抑制大鼠 AVIC 中 PGC-1α 的表达。
本实验均以 12 孔板细胞培养板 1 mL 体系为例进行干预。因活化标志物均在 TGF-β1 刺激 48 h 时开始显著上调，后续体外实验均采用 TGF-β1 诱导 AVIC 48 h 进行模型构建。转染 PGC-1α 过表达腺病毒（ADPGC-1α）外源性上调 PGC-1α 的表达，预实验结果显示，与空白对照 ADC 组相比，以最佳感染复数为 300 时携带的 PGC-1α 过表达序列的腺病毒（ADPGC-1α 组）转染能使 AVIC 中 PGC-1α 的蛋白和基因表达水平均显著增加，并以该方案下的 PGC-1α 过表达效率用于后续实验。大鼠及人源 AVIC 转染过表达腺病毒的实验分组（n=3）：① 空白对照 ADC 组；② ADC+TGF-β1 组；③ ADPGC-1α 组；④ ADPGC-1α+TGF-β1 组。随后使用 PPARγ 拮抗剂 GW9662 抑制大鼠 AVIC 中 PGC-1α 的生物活性[13]，实验分 4 组（n=3）：① 空白对照二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）组；② DMSO+TGF-β1 组；③ GW9662 组；④ GW9662+TGF-β1 组。随后以 RT-qPCR、蛋白质印迹法、细胞免疫荧光法观察 AVIC 活化程度以及活性氧水平的改变情况。
1.3.2 体外 AVIC 小干扰 RNA 转染
为进一步探索 PGC-1α 调节 AVIC 活化的下游分子和下游信号通路，结合文献报道，以 siRNA 特异性沉默大鼠 AVIC 中 CAMK1δ 的表达，分为 4 组（n=3）：① 空白对照 SiNC 组；② SiNC+TGF-β1 组；③ SiCAMK1δ 组；④ SiCAMK1δ+TGF-β1 组。随后以 RT-qPCR、蛋白质印迹法观察 AVIC 活化程度的改变情况。
1.4 流式细胞术
本研究发现 PGC-1α 可通过下调 CAMK1δ 发挥作用，而 CAMK1δ 的下调与活性氧生成减少密切相关，那么在 AVIC 活化进程中，PGC-1α 是否可通过抑制活性氧生成而发挥作用尚未可知。而活性氧与多种细胞信号通路的激活密切相关，因此，本研究筛选了 PGC-1α 下游可能作用的信号通路激活情况，如活性氧可作用于的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin, mTOR）及可作用于活性氧生成的低氧诱导因子 1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）等。随后以流式细胞实验观察大鼠 AVIC 中活性氧水平的改变情况。
通过 BD FACSCanto™流式分析仪（美国 BD 公司）检测荧光标记的细胞内活性氧及 PGC-1α 分子。将大鼠 AVIC 传代细胞铺于 12 孔细胞培养板内待细胞融合度达 70%，根据实验需求处理细胞。待收样时弃去原培养基，分别加入稀释的荧光探针加载 2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐试剂盒（1∶
1.5 细胞免疫荧光染色实验
根据实验设计，待达到细胞实验时间节点，弃去原培养基，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline, PBS）漂洗 3 次，室温下加入 4% 多聚甲醛固定液固定 15～20 min 后再用 PBS 漂洗 3 次，用胶头滴管吸净 PBS 液，加入含有 0.5% 细胞通透剂 Triton®X-100 和 1% 牛血清蛋白的混合液，室温封闭穿孔 60 min 后用 PBS 漂洗 3 次，3 min/次。随后加入稀释后的 α-SMA 一抗（1∶200），4℃孵育过夜处理。第 2 天回收一抗后用 PBS 漂洗 3 次，3 min/次。加入免疫荧光二抗后室温下避光孵育 1 h 后用 PBS 漂洗 3 次，3 min/次。滴加 DAPI（用 PBS 稀释为 1∶
1.6 RT-qPCR 检测基因的表达变化
通过 RT-qPCR 对基因转录水平进行检测。将 TRIzol 裂解液加入 12 孔板细胞培养板中裂解细胞，通过氯仿法提取总 RNA。通过与逆转录酶孵育，根据表1 配制逆转录反应体系，本研究中使用的引物序列见表2，将总 RNA 逆转录为单链互补 DNA。根据制造商的说明，使用试剂盒进行 RT-qPCR 检测。在 CFX Connect 机器（美国 BIO-RAD 公司）上检测到信号。GAPDH 或 β-actin 作为内参基因，即相对基因表达归一化为 GAPDH 表达，进行定量分析。
表1
逆转录反应体系
表2
实时定量聚合酶链反应使用的引物序列
1.7 蛋白质印迹法检测蛋白表达
根据实验设计待细胞实验完成后，将培养的细胞直接在放射免疫沉淀缓冲液中裂解，冰上裂解 15 min，4℃，
1.8 统计学方法
使用 GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析，实验结果以均数±标准差表示。两组间比较使用两独立样本 t 检验，多组间比较使用单因素方差分析，组间两两比较使用SNK-q检验。双侧检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 PGC-1α 表达水平在活化的大鼠 AVIC 中下降
2.1.1 TGF-β1 诱导的大鼠 AVIC 活化模型构建成功
实验结果表明，与空白对照组相比，活化标志物骨膜蛋白的 mRNA 表达水平在 TGF-β1 刺激大鼠 AVIC 24、48、72 h 后呈梯度增加现象，CTGF 及Ⅰ型胶原蛋白的 mRNA 表达水平亦在 TGF-β1 作用 48、72 h 后表达增加（图1a～1c），表明 TGF-β1 诱导的大鼠 AVIC 活化模型构建成功。
图1
PGC-1α 在活化的 AVIC 中表达降低
a～d. 大鼠 AVIC 在 TGF-β1 刺激 24、48、72 h 后，各纤维化标志物及 PGC-1α 的 mRNA 表达水平（
2.1.2 PGC-1α 在 TGF-β1 诱导活化的大鼠 AVIC 中表达下调
与空白对照组（1.00±0.18）相比，TGF-β1 刺激大鼠 AVIC 24、48、72 h 后，PGC-1α 的 mRNA 表达水平均出现明显下调（24 h：0.31±0.10；48 h：0.32±0.06；72 h：0.20±0.07），且差异有统计学意义（P<0.05，图1d）。流式细胞术结果显示，TGF-β1 刺激 AVIC 48 h 后，PGC-1α 的蛋白表达水平亦显著下调（图1e、1f）。
2.2 PGC-1α 可缓解大鼠 AVIC 活化程度
2.2.1 过表达 PGC-1α，AVIC 活化程度减轻
与对照组（ADC+TGF-β1 组）相比，过表达 PGC-1α 后（ADPGC-1α+TGF-β1 组），伴随 PGC-1α 的表达明显上调，TGF-β1 诱导的纤维化标志物骨膜蛋白、α-SMA 的基因和蛋白表达均明显降低（骨膜蛋白：3.17±0.64 vs. 1.45±0.54，P<0.05；α-SMA：0.77±0.11 vs. 0.28±0.06，P<0.05），且差异有统计学意义（P<0.05，图2a～2h）。流式细胞术和免疫荧光结果均验证了高表达 PGC-1α 后，TGF-β1 诱导的 α-SMA 表达水平出现明显降低（图2i～2k）。
图2
PGC-1α 可缓解大鼠 AVIC 活化程度
a～d. 转染 ADPGC-1α 前后各组大鼠 AVIC 的 PGC-1α 及纤维化标志物骨膜蛋白、α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白的 mRNA 表达水平（
2.2.2 抑制 PGC-1α 活性，AVIC 活化程度增加
进一步反向验证 PGC-1α 在 AVIC 活化进程中的作用发现，GW9662 抑制 PGC-1α 活性可进一步上调 TGF-β1 所诱导的骨膜蛋白表达水平，差异有统计学意义（2.20±0.68 vs. 7.99±2.50，P<0.05），同时 α-SMA 表达也呈现出上调趋势（1.25±0.18 vs. 1.56±0.07，P=0.067）（图2l～2n）。
2.3 PGC-1α 通过下调 CAMK1δ 的表达发挥作用
过表达 PGC-1α 表达水平后进行下游筛选，鉴定到 PGC-1α 可能通过下调 CAMK1δ 的表达发挥作用（0.97±0.04 vs. 0.74±0.11，P<0.05）（图3a～3g）。随后在 TGF-β1 诱导下，使用 Si CAMK1δ 特异性沉默其表达水平后观察 AVIC 活化程度改变情况，结果显示，沉默 CAMK1δ 表达下调了活化标志物骨膜蛋白的表达（1.76±0.11 vs. 0.99±0.20，P<0.05），表明 AVIC 活化程度缓解（图3h～3j）。
图3
PGC-1α 可通过下调 CAMK1δ 表达水平发挥作用
a～g. 转染 ADPGC-1α 前后各组大鼠 AVIC 的骨膜蛋白及
2.4 PGC-1α 抑制活性氧生成而发挥作用
流式细胞学结果显示，TGF-β1 作用下，与对照组（ADC+TGF-β1 组）相比，ADPGC-1α+TGF-β1 组活性氧活性降低且差异有统计学意义（778.3±139.4 vs. 159.3±43.2，P<0.05）（图4a、4b）。同时，功能抑制实验结果显示，TGF-β1 刺激下，与对照组（DMSO+TGF-β1 组）相比，GW9662 的使用（GW9662+TGF-β1 组）进一步增加了 TGF-β1 诱导的 AVIC 活化进程中的活性氧水平（图4c、4d）。
图4
PGC-1α 抑制活性氧生成而发挥作用
a、b. 存在或不存在 TGF-β1 刺激的情况下，AVIC 转染 ADPGC-1α 后活性氧的流式细胞术结果（
2.5 PGC-1α 负调控 p-mTOR 通路激活而发挥作用
蛋白质印迹法结果显示，TGF-β1 刺激下，与对照组（ADC+TGF-β1）相比，ADPGC-1α+TGF-β1 组 p-mTOR 的表达明显下调（图5a）；相反，使用 GW9662 抑制 PGC-1α 活性后，p-mTOR 通路分子表达上调（图5b）；HIF-1α 则无明显变化。
图5
PGC-1α 可负调控 p-mTOR 通路激活而发挥作用
a. 存在或不存在 TGF-β1 刺激的情况下，AVIC 转染 ADPGC-1α 后通路蛋白分子 p-mTOR、HIF-1α 的蛋白水平（
鉴于 PGC-1α 可下调 CAMK1δ 表达，而文献报道 CAMK1δ 表达的下降与活性氧生成减少相关，随后，我们观察了特异性沉默 CAMK1δ 后 mTOR 通路的激活情况，结果显示，下调 CAMK1δ 表达水平后 mTOR 通路激活程度减轻（图5c）。
2.6 过表达 PGC-1α 缓解 TGF-β1 诱导的人源的 AVIC 活化程度
基于上述结果，通过人来源的 AVIC 进行验证 PGC-1α 发挥作用的物种保守性。蛋白质印迹实验结果显示，与对照组（ADC+TGF-β1 组）相比，ADPGC-1α+TGF-β1 组活化标志物骨膜蛋白、CTGF 蛋白水平表达均明显降低（骨膜蛋白：2.73±0.53 vs. 1.63±0.14，P<0.05；CTGF：1.27±0.04 vs. 0.48±0.09，P<0.05），差异有统计学意义（图6）。
图6
过表达 PGC-1α 可缓解 TGF-β1 诱导的人源的 AVIC 活化程度
a～d. 存在或不存在 TGF-β1 刺激的情况下，人源 AVIC 转染 ADPGC-1α 后骨膜蛋白、α-SMA 的蛋白表达水平（
3 讨论
AS 主要病理表现为主动脉瓣叶体部纤维化钙化增厚、主动脉瓣环狭窄、左心室的机械应力增加引起严重并发症，目前尚无有效缓解药物[14]。经导管主动脉瓣置换术是重度 AS 的成熟治疗手段，但术后传导阻滞、急性肾损伤、卒中等并发症及瓣膜衰败等后续不良后果的出现，使 AS 发病机制的探索及药物治疗靶点的发现变得尤为重要。
AS 诱因多样、发病机制复杂，分子和细胞过程未被清楚表征。现有研究认为，瓣膜内皮功能受损、脂质浸润沉积、炎症细胞渗出、免疫炎症反应以及在此基础上发生的瓣膜纤维化和/或钙化是其主要机制[15]。在此过程中 AVIC 的表型转变包括纤维性活化及向成骨分化（即钙化）是 AS 的关键环节。尽管所有终末期 AS 瓣膜都表现为钙化，但纤维化在 AS 中始终起着重要作用[16]。因此，本研究选择 AVIC 作为靶细胞，研究 AS 早期细胞表型转换（即 AVIC 活化）的生物学机制，以期为轻度 AS 患者进展为重度 AS 患者的中间过程提供潜在阻遏靶点。
如前所述，一项使用硫代巴比妥酸评估全身脂质过氧化和 2,4-二硝基苯肼评估血浆蛋白氧化修饰的队列研究表明，氧化应激水平升高与 AS 的严重程度相关[17]。在分离培养的猪 AVIC 中，TGF-β1 刺激可通过激活促分裂素原活化蛋白激酶信号通路，促进活性氧产生，导致钙结节形成[18]。这表明，氧化应激与 AVIC 表型转换及 AS 进展密切相关，若从抑制活性氧堆积和降低氧化应激水平的角度出发，极有可能探索出可缓解 AVIC 活化乃至 AS 狭窄进程的潜在靶点。另有研究报道，在 AS 患者切除的瓣膜中检测到氧化低密度脂蛋白增加，而 PGC-1α 的表达降低可增加氧化低密度脂蛋白诱导的活性氧堆积及所致的单核细胞炎症反应；反之，PGC-1α 的表达增加则可增强自噬，减轻真皮成纤维细胞向肌成纤维细胞转变[19]。因此，我们推测 PGC-1α 可能与 AVIC 表型转变进程相关，并选择该靶分子进行后续实验。
本研究发现，大鼠 AVIC 活化表型中，伴随活化标志物骨膜蛋白、CTGF 和 α-SMA 表达明显上调，PGC-1α 表达水平发生显著下降。PGC-1α 参与控制多个系统（尤其是心血管系统）的脂质代谢和氧化应激途径[20]。在心脏中，作为氧化代谢的关键调节因子，沉默信息调节因子 1-PGC-1α 轴可通过减少炎症、氧化应激、降低纤维化而发挥心脏保护作用[21]，若抑制 PGC-1α 活性则会加重心功能不全和心力衰竭的临床症状[22]，在 PGC-1α 缺乏的小鼠中，可观察小鼠左心室功能障碍和心率异常[23]；在血管中，在临床标本及实验动物的动脉粥样硬化模型中均表达下调，而激活 PGC-1α 则可发挥抗动脉粥样硬化作用[24]；此外，PGC-1α 参与了多种纤维化疾病的细胞表型转换，如在各种急、慢性肾病及老龄引起的肾纤维化动物模型中，肾组织内 PGC-1α 高表达可缓解肾纤维化，而敲除 PGC-1α 基因的动物出现严重的肾纤维化[25]；在心肌成纤维细胞中特异性敲除 PGC-1α 可诱发心肌重塑，加重血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化，伴随氧化应激反应和炎症反应出现[5]。但是，目前尚无关于 PGC-1α 与 AS 的相关研究。因此我们进行了相关研究，且结果显示，在大鼠和人 AVIC 活化表型中，PGC-1α 的表达增加均发挥了保护性作用，可以缓解 TGF-β1 诱导的 AVIC 活化程度。但是其作用机制是否如前所述与活性氧的生成减少有关及其如何调控活性氧生成均尚未可知。
PGC-1α 基因位于小鼠的 5 号染色体（人类的 4 号染色体）上，编码含有 797 个（小鼠）或 798 个（人类）氨基酸的蛋白质。PGC-1α C 端包含丝氨酸/精氨酸和 RNA 识别基序结构域，可通过识别靶基因上特定序列，与各种转录因子和核受体结合来发挥其转录调节功能[26]。肝细胞中免疫共沉淀后转录组分析报道显示，可被 PGC-1α 潜在结合而调控的 RNA 为编码 FOXO1、PER1、TRPC5 和 CAMK1δ 等[7]。因此，我们通过体外细胞实验进行了筛选验证，结果发现过表达 PGC-1α 能下调 CAMK1δ 的表达水平，而沉默 CAMK1δ 的表达后 AVIC 纤维性活化程度明显减轻，表明 PGC-1α 至少部分通过调控 CAMK1δ 的表达水平发挥 AVIC 活化抑制作用。CAMK1δ 是 CAMK1 家族的成员，CAMK1 亚型包括 CAMK1α、β、γ 和 δ。可被上游 CAMK 激酶磷酸化其苏氨酸残基而激活，介导细胞信号转导[27]。有研究表明，衰老是 AS 的主要危险因素，可通过 NADPH 氧化酶 4-活性氧-CAMK 通路介导心脏重塑[28]。但目前，关于 CAMK1δ 与成纤维样细胞表型转变的研究较少，其细胞内的功能作用尚未完全阐明，后续仍待深入探究。
活性氧是一大类氧化剂的统称，包括源自氧的分子，如超氧化物、过氧化氢、羟基自由基、臭氧和单线态氧等。活性氧在许多心脏病的发病机制中起着关键作用，包括 AS、血管钙化、动脉粥样硬化、心脏纤维化重塑等，并且通常与 TGF-β 信号传导有关[29]。且如前所述，PGC-1α 具有抑制活性氧生成的作用，并且 PGC-1α 可下调 CAMK1δ 表达，而 CAMK1δ 上调与活性氧增加有关[30]。系列证据表明，在 AVIC 活化进程中，PGC-1α 通过下调 CAMK1δ 表达水平抑制活性氧生成而发挥 AVIC 活化抑制作用。因此，我们进行了相关实验，并且验证出 PGC-1α 在 AVIC 活化进程中至少部分通过减少活性氧生成而发挥作用。
mTOR 是一种非典型丝氨酸/苏氨酸激酶，以 mTOR 复合体 1（mTORC1）和 mTOR 复合体 2（mTORC2）的形式存在，属于磷脂酰肌醇激酶家族，在调控细胞凋亡、生长、增殖和自噬中起着至关重要的作用[31]。既往研究报道，在肺纤维化疾病模型中，TGF-β-PI3K-AKT-mTOR 信号通路介导脂多糖诱导的肺成纤维细胞活化[32]。mTOR 被上游调控因子调节，活性氧是其初始调节因子之一[31]。因此，后续我们验证了 PGC-1α 的作用是否通过此通路进行。结果发现，过表达 PGC-1α 后，伴随 AVIC 活化程度缓解、CAMK1δ 表达水平下调、活性氧活性下降的同时，p-mTOR 通路激活受到抑制，提示我们 PGC-1α 至少部分通过抑制 p-mTOR 信号通路激活发挥 AVIC 活化抑制作用。
综上所述，本研究结果表明，过表达 PGC-1α 能通过下调 CAMK1δ 的表达、抑制活性氧活性、负调控 p-mTOR 信号通路激活，进而缓解 TGF-β1 诱导的 AVIC 活化程度，即 PGC-1α 在 AVIC 乃至 AS 进程中发挥保护性作用，有望成为 AS 疾病治疗的靶点。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
主动脉瓣狭窄（aortic stenosis, AS）是先天性因素如瓣叶发育畸形或后天性因素如退行性变、风湿性变诱发的主动脉瓣进行性重塑出现纤维化、钙化，而造成主动脉瓣叶增厚粘连、瓣口狭窄、左心室流出道受阻进而导致左心室不良重塑的疾病[1]。AS 是最常见的心脏瓣膜病，发病率及病死率高，但目前尚无有效的早期干预措施及治疗药物。因此，对 AS 的发病机制进行深入研究，并推动潜在药物治疗靶点的发现显得尤为重要。AS 诱因多样、发病机制复杂。其中，主动脉瓣的主要细胞成分主动脉瓣瓣膜间质细胞（aortic valve interstitial cells, AVIC）发生活化并向成骨分化被认为是 AS 的关键环节[2]。但目前 AVIC 的活化机制尚未阐明。临床前和人体研究数据表明，各种来源的活性氧的不良积累介导了 AS 起始阶段的浸润性脂质的氧化和炎症反应，进而诱导 AVIC 出现肌成纤维细胞样表型活化，且氧化应激水平升高程度与 AS 的严重程度相关[3]。据报道，脂质氧化及其介导的细胞表型转换可受过氧化物酶体增殖物激活受体 γ 共激活因子 1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α, PGC-1α）的调控[4]。PGC-1α 是控制多种核编码的线粒体基因的关键分子，可通过激活多种转录因子调控驱动线粒体呼吸链和脂肪酸氧化酶基因的表达，促使线粒体数目增加、线粒体呼吸能力增强[5]。既往研究表明，PGC-1α 可作为氧化应激的关键抑制因子降低活性氧生成、减少氧化应激及炎症反应[6]。更重要的是，PGC-1α 可通过调控核呼吸因子而调节线粒体转录因子 A、B1、B2 的表达继而调节线粒体基质蛋白的表达发挥活性氧脱毒作用。PGC-1α 包含参与 RNA 调控的蛋白质结构域如丝氨酸/精氨酸和 RNA 识别基序，可直接调控 RNA 的表达，而 AVIC 活化进程中 PGC-1α 是否通过作用于特殊 RNA 而发挥作用仍尚未明确。既往 PGC-1α 免疫共沉淀后的转录组测序结果显示，其可能与钙调蛋白依赖性蛋白激酶 1δ（calcium/calmodulin-dependent protein kinase 1δ, CAMK1δ）、生物钟基因周期蛋白 1（period 1, PER1）、经典瞬时受体电位通道 5（transient receptor potential canonical 5, TRPC5）、叉头框蛋白 O1（fork-head box protein O1, FOXO1）等存在相互作用[7]。目前，PGC-1α 在 AS 关键环节即 AVIC 表型转变中的作用及机制尚未可知。因此，本研究旨在探讨 AVIC 活化进程中 PGC-1α 的表达水平改变情况、作用特点及机制途径。
1 材料与方法
1.1 实验试剂
高糖基础培养基、减血清培养基、0.25% 胰蛋白酶、Lipofectamine RNAiMAX 试剂、Ⅱ型胶原酶、胎牛血清及总 RNA 抽提试剂盒 TRIzol™均购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司；转化生长因子 β1（transforming growth factor β1, TGF-β1）购自北京义翘神州科技股份有限公司；聚偏二氟乙烯膜、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）染液购自美国 Merck 公司；逆转录酶购自日本 Toyobo 公司；实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）荧光染料预混液购自美国 BIO-RAD 公司；Triton®X-100 和 4% 多聚甲醛固定液购自中国 Biosharp 公司；活性氧检测试剂盒（S0033）、细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；小干扰 RNA（small interfering RNA, siRNA）由中国吉玛基因公司合成；辣根酶标记山羊抗兔/小鼠免疫球蛋白 G 购自中国中杉金桥生物公司。抗体信息：Alexa Fluor® 488 Conjugate 荧光二抗和兔抗磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phospho-mammalian target of rapamycin, p-mTOR）抗体购自美国 Cell Signaling Technology 公司；兔抗 β-微管蛋白（β-tubulin）和兔抗 β-肌动蛋白（β-actin）抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；兔 PGC-1α 抗体购自美国 Novus 公司；兔抗骨膜蛋白抗体、兔抗Ⅰ型胶原蛋白抗体、鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）抗体、鼠抗 α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）抗体和兔抗 CAMK1δ 抗体均购自英国 Abcam 公司。
1.2 细胞培养及 AVIC 活化模型构建
用以提取 AVIC 的 6 周龄、体重 200～250 g 的雄性 SD 大鼠购自成都达硕实验动物有限公司（动物操作获四川大学华西医院动物伦理委员会批准，批件号：20230920002）。该研究所使用的主动脉夹层患者来源的主动脉瓣已通过四川大学华西医院生物医学伦理委员会的批准（批准号：201793）。本研究符合赫尔辛基宣言中所述的人体组织使用原则。AVIC 接种于含有 20% 胎牛血清、1% 青霉素-链霉素的高糖培养基中，5% 二氧化碳孵箱中培养，待细胞融合度达 95% 左右进行传代，并将血清减半。
作为诱导成纤维细胞活化的经典刺激，细胞因子 TGF-β1 目前也被广泛用以刺激 AVIC 以诱导其活化[8]，本实验采用 30 ng/mL 的 TGF-β1 重组蛋白构建大鼠 AVIC 活化模型。实验分组（n=4）：① 未加 TGF-β1 的空白对照组；② 加 TGF-β1 刺激 24 h 组；③ 加 TGF-β1 刺激 48 h 组；④ 加 TGF-β1 刺激 72 h 组。通过检测纤维化标志物结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）[9]、骨膜蛋白[10]或Ⅰ型胶原蛋白[11]、α-SMA[12]的表达水平变化评估模型是否构建成功。
1.3 细胞转染及分组
1.3.1 体外 AVIC 过表达重组腺病毒转染及抑制剂干预
为探讨 PGC-1α 在 AVIC 活化进程中的作用，本研究通过腺病毒转染的方法外源特异性过表达/使用过氧化物酶体增殖物激活受体 γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ）拮抗剂 GW9662 抑制大鼠 AVIC 中 PGC-1α 的表达。
本实验均以 12 孔板细胞培养板 1 mL 体系为例进行干预。因活化标志物均在 TGF-β1 刺激 48 h 时开始显著上调，后续体外实验均采用 TGF-β1 诱导 AVIC 48 h 进行模型构建。转染 PGC-1α 过表达腺病毒（ADPGC-1α）外源性上调 PGC-1α 的表达，预实验结果显示，与空白对照 ADC 组相比，以最佳感染复数为 300 时携带的 PGC-1α 过表达序列的腺病毒（ADPGC-1α 组）转染能使 AVIC 中 PGC-1α 的蛋白和基因表达水平均显著增加，并以该方案下的 PGC-1α 过表达效率用于后续实验。大鼠及人源 AVIC 转染过表达腺病毒的实验分组（n=3）：① 空白对照 ADC 组；② ADC+TGF-β1 组；③ ADPGC-1α 组；④ ADPGC-1α+TGF-β1 组。随后使用 PPARγ 拮抗剂 GW9662 抑制大鼠 AVIC 中 PGC-1α 的生物活性[13]，实验分 4 组（n=3）：① 空白对照二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）组；② DMSO+TGF-β1 组；③ GW9662 组；④ GW9662+TGF-β1 组。随后以 RT-qPCR、蛋白质印迹法、细胞免疫荧光法观察 AVIC 活化程度以及活性氧水平的改变情况。
1.3.2 体外 AVIC 小干扰 RNA 转染
为进一步探索 PGC-1α 调节 AVIC 活化的下游分子和下游信号通路，结合文献报道，以 siRNA 特异性沉默大鼠 AVIC 中 CAMK1δ 的表达，分为 4 组（n=3）：① 空白对照 SiNC 组；② SiNC+TGF-β1 组；③ SiCAMK1δ 组；④ SiCAMK1δ+TGF-β1 组。随后以 RT-qPCR、蛋白质印迹法观察 AVIC 活化程度的改变情况。
1.4 流式细胞术
本研究发现 PGC-1α 可通过下调 CAMK1δ 发挥作用，而 CAMK1δ 的下调与活性氧生成减少密切相关，那么在 AVIC 活化进程中，PGC-1α 是否可通过抑制活性氧生成而发挥作用尚未可知。而活性氧与多种细胞信号通路的激活密切相关，因此，本研究筛选了 PGC-1α 下游可能作用的信号通路激活情况，如活性氧可作用于的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin, mTOR）及可作用于活性氧生成的低氧诱导因子 1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）等。随后以流式细胞实验观察大鼠 AVIC 中活性氧水平的改变情况。
通过 BD FACSCanto™流式分析仪（美国 BD 公司）检测荧光标记的细胞内活性氧及 PGC-1α 分子。将大鼠 AVIC 传代细胞铺于 12 孔细胞培养板内待细胞融合度达 70%，根据实验需求处理细胞。待收样时弃去原培养基，分别加入稀释的荧光探针加载 2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐试剂盒（1∶
1.5 细胞免疫荧光染色实验
根据实验设计，待达到细胞实验时间节点，弃去原培养基，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline, PBS）漂洗 3 次，室温下加入 4% 多聚甲醛固定液固定 15～20 min 后再用 PBS 漂洗 3 次，用胶头滴管吸净 PBS 液，加入含有 0.5% 细胞通透剂 Triton®X-100 和 1% 牛血清蛋白的混合液，室温封闭穿孔 60 min 后用 PBS 漂洗 3 次，3 min/次。随后加入稀释后的 α-SMA 一抗（1∶200），4℃孵育过夜处理。第 2 天回收一抗后用 PBS 漂洗 3 次，3 min/次。加入免疫荧光二抗后室温下避光孵育 1 h 后用 PBS 漂洗 3 次，3 min/次。滴加 DAPI（用 PBS 稀释为 1∶
1.6 RT-qPCR 检测基因的表达变化
通过 RT-qPCR 对基因转录水平进行检测。将 TRIzol 裂解液加入 12 孔板细胞培养板中裂解细胞，通过氯仿法提取总 RNA。通过与逆转录酶孵育，根据表1 配制逆转录反应体系，本研究中使用的引物序列见表2，将总 RNA 逆转录为单链互补 DNA。根据制造商的说明，使用试剂盒进行 RT-qPCR 检测。在 CFX Connect 机器（美国 BIO-RAD 公司）上检测到信号。GAPDH 或 β-actin 作为内参基因，即相对基因表达归一化为 GAPDH 表达，进行定量分析。
表1
逆转录反应体系
表2
实时定量聚合酶链反应使用的引物序列
1.7 蛋白质印迹法检测蛋白表达
根据实验设计待细胞实验完成后，将培养的细胞直接在放射免疫沉淀缓冲液中裂解，冰上裂解 15 min，4℃，
1.8 统计学方法
使用 GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析，实验结果以均数±标准差表示。两组间比较使用两独立样本 t 检验，多组间比较使用单因素方差分析，组间两两比较使用SNK-q检验。双侧检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 PGC-1α 表达水平在活化的大鼠 AVIC 中下降
2.1.1 TGF-β1 诱导的大鼠 AVIC 活化模型构建成功
实验结果表明，与空白对照组相比，活化标志物骨膜蛋白的 mRNA 表达水平在 TGF-β1 刺激大鼠 AVIC 24、48、72 h 后呈梯度增加现象，CTGF 及Ⅰ型胶原蛋白的 mRNA 表达水平亦在 TGF-β1 作用 48、72 h 后表达增加（图1a～1c），表明 TGF-β1 诱导的大鼠 AVIC 活化模型构建成功。
图1
PGC-1α 在活化的 AVIC 中表达降低
a～d. 大鼠 AVIC 在 TGF-β1 刺激 24、48、72 h 后，各纤维化标志物及 PGC-1α 的 mRNA 表达水平（
2.1.2 PGC-1α 在 TGF-β1 诱导活化的大鼠 AVIC 中表达下调
与空白对照组（1.00±0.18）相比，TGF-β1 刺激大鼠 AVIC 24、48、72 h 后，PGC-1α 的 mRNA 表达水平均出现明显下调（24 h：0.31±0.10；48 h：0.32±0.06；72 h：0.20±0.07），且差异有统计学意义（P<0.05，图1d）。流式细胞术结果显示，TGF-β1 刺激 AVIC 48 h 后，PGC-1α 的蛋白表达水平亦显著下调（图1e、1f）。
2.2 PGC-1α 可缓解大鼠 AVIC 活化程度
2.2.1 过表达 PGC-1α，AVIC 活化程度减轻
与对照组（ADC+TGF-β1 组）相比，过表达 PGC-1α 后（ADPGC-1α+TGF-β1 组），伴随 PGC-1α 的表达明显上调，TGF-β1 诱导的纤维化标志物骨膜蛋白、α-SMA 的基因和蛋白表达均明显降低（骨膜蛋白：3.17±0.64 vs. 1.45±0.54，P<0.05；α-SMA：0.77±0.11 vs. 0.28±0.06，P<0.05），且差异有统计学意义（P<0.05，图2a～2h）。流式细胞术和免疫荧光结果均验证了高表达 PGC-1α 后，TGF-β1 诱导的 α-SMA 表达水平出现明显降低（图2i～2k）。
图2
PGC-1α 可缓解大鼠 AVIC 活化程度
a～d. 转染 ADPGC-1α 前后各组大鼠 AVIC 的 PGC-1α 及纤维化标志物骨膜蛋白、α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白的 mRNA 表达水平（
2.2.2 抑制 PGC-1α 活性，AVIC 活化程度增加
进一步反向验证 PGC-1α 在 AVIC 活化进程中的作用发现，GW9662 抑制 PGC-1α 活性可进一步上调 TGF-β1 所诱导的骨膜蛋白表达水平，差异有统计学意义（2.20±0.68 vs. 7.99±2.50，P<0.05），同时 α-SMA 表达也呈现出上调趋势（1.25±0.18 vs. 1.56±0.07，P=0.067）（图2l～2n）。
2.3 PGC-1α 通过下调 CAMK1δ 的表达发挥作用
过表达 PGC-1α 表达水平后进行下游筛选，鉴定到 PGC-1α 可能通过下调 CAMK1δ 的表达发挥作用（0.97±0.04 vs. 0.74±0.11，P<0.05）（图3a～3g）。随后在 TGF-β1 诱导下，使用 Si CAMK1δ 特异性沉默其表达水平后观察 AVIC 活化程度改变情况，结果显示，沉默 CAMK1δ 表达下调了活化标志物骨膜蛋白的表达（1.76±0.11 vs. 0.99±0.20，P<0.05），表明 AVIC 活化程度缓解（图3h～3j）。
图3
PGC-1α 可通过下调 CAMK1δ 表达水平发挥作用
a～g. 转染 ADPGC-1α 前后各组大鼠 AVIC 的骨膜蛋白及
2.4 PGC-1α 抑制活性氧生成而发挥作用
流式细胞学结果显示，TGF-β1 作用下，与对照组（ADC+TGF-β1 组）相比，ADPGC-1α+TGF-β1 组活性氧活性降低且差异有统计学意义（778.3±139.4 vs. 159.3±43.2，P<0.05）（图4a、4b）。同时，功能抑制实验结果显示，TGF-β1 刺激下，与对照组（DMSO+TGF-β1 组）相比，GW9662 的使用（GW9662+TGF-β1 组）进一步增加了 TGF-β1 诱导的 AVIC 活化进程中的活性氧水平（图4c、4d）。
图4
PGC-1α 抑制活性氧生成而发挥作用
a、b. 存在或不存在 TGF-β1 刺激的情况下，AVIC 转染 ADPGC-1α 后活性氧的流式细胞术结果（
2.5 PGC-1α 负调控 p-mTOR 通路激活而发挥作用
蛋白质印迹法结果显示，TGF-β1 刺激下，与对照组（ADC+TGF-β1）相比，ADPGC-1α+TGF-β1 组 p-mTOR 的表达明显下调（图5a）；相反，使用 GW9662 抑制 PGC-1α 活性后，p-mTOR 通路分子表达上调（图5b）；HIF-1α 则无明显变化。
图5
PGC-1α 可负调控 p-mTOR 通路激活而发挥作用
a. 存在或不存在 TGF-β1 刺激的情况下，AVIC 转染 ADPGC-1α 后通路蛋白分子 p-mTOR、HIF-1α 的蛋白水平（
鉴于 PGC-1α 可下调 CAMK1δ 表达，而文献报道 CAMK1δ 表达的下降与活性氧生成减少相关，随后，我们观察了特异性沉默 CAMK1δ 后 mTOR 通路的激活情况，结果显示，下调 CAMK1δ 表达水平后 mTOR 通路激活程度减轻（图5c）。
2.6 过表达 PGC-1α 缓解 TGF-β1 诱导的人源的 AVIC 活化程度
基于上述结果，通过人来源的 AVIC 进行验证 PGC-1α 发挥作用的物种保守性。蛋白质印迹实验结果显示，与对照组（ADC+TGF-β1 组）相比，ADPGC-1α+TGF-β1 组活化标志物骨膜蛋白、CTGF 蛋白水平表达均明显降低（骨膜蛋白：2.73±0.53 vs. 1.63±0.14，P<0.05；CTGF：1.27±0.04 vs. 0.48±0.09，P<0.05），差异有统计学意义（图6）。
图6
过表达 PGC-1α 可缓解 TGF-β1 诱导的人源的 AVIC 活化程度
a～d. 存在或不存在 TGF-β1 刺激的情况下，人源 AVIC 转染 ADPGC-1α 后骨膜蛋白、α-SMA 的蛋白表达水平（
3 讨论
AS 主要病理表现为主动脉瓣叶体部纤维化钙化增厚、主动脉瓣环狭窄、左心室的机械应力增加引起严重并发症，目前尚无有效缓解药物[14]。经导管主动脉瓣置换术是重度 AS 的成熟治疗手段，但术后传导阻滞、急性肾损伤、卒中等并发症及瓣膜衰败等后续不良后果的出现，使 AS 发病机制的探索及药物治疗靶点的发现变得尤为重要。
AS 诱因多样、发病机制复杂，分子和细胞过程未被清楚表征。现有研究认为，瓣膜内皮功能受损、脂质浸润沉积、炎症细胞渗出、免疫炎症反应以及在此基础上发生的瓣膜纤维化和/或钙化是其主要机制[15]。在此过程中 AVIC 的表型转变包括纤维性活化及向成骨分化（即钙化）是 AS 的关键环节。尽管所有终末期 AS 瓣膜都表现为钙化，但纤维化在 AS 中始终起着重要作用[16]。因此，本研究选择 AVIC 作为靶细胞，研究 AS 早期细胞表型转换（即 AVIC 活化）的生物学机制，以期为轻度 AS 患者进展为重度 AS 患者的中间过程提供潜在阻遏靶点。
如前所述，一项使用硫代巴比妥酸评估全身脂质过氧化和 2,4-二硝基苯肼评估血浆蛋白氧化修饰的队列研究表明，氧化应激水平升高与 AS 的严重程度相关[17]。在分离培养的猪 AVIC 中，TGF-β1 刺激可通过激活促分裂素原活化蛋白激酶信号通路，促进活性氧产生，导致钙结节形成[18]。这表明，氧化应激与 AVIC 表型转换及 AS 进展密切相关，若从抑制活性氧堆积和降低氧化应激水平的角度出发，极有可能探索出可缓解 AVIC 活化乃至 AS 狭窄进程的潜在靶点。另有研究报道，在 AS 患者切除的瓣膜中检测到氧化低密度脂蛋白增加，而 PGC-1α 的表达降低可增加氧化低密度脂蛋白诱导的活性氧堆积及所致的单核细胞炎症反应；反之，PGC-1α 的表达增加则可增强自噬，减轻真皮成纤维细胞向肌成纤维细胞转变[19]。因此，我们推测 PGC-1α 可能与 AVIC 表型转变进程相关，并选择该靶分子进行后续实验。
本研究发现，大鼠 AVIC 活化表型中，伴随活化标志物骨膜蛋白、CTGF 和 α-SMA 表达明显上调，PGC-1α 表达水平发生显著下降。PGC-1α 参与控制多个系统（尤其是心血管系统）的脂质代谢和氧化应激途径[20]。在心脏中，作为氧化代谢的关键调节因子，沉默信息调节因子 1-PGC-1α 轴可通过减少炎症、氧化应激、降低纤维化而发挥心脏保护作用[21]，若抑制 PGC-1α 活性则会加重心功能不全和心力衰竭的临床症状[22]，在 PGC-1α 缺乏的小鼠中，可观察小鼠左心室功能障碍和心率异常[23]；在血管中，在临床标本及实验动物的动脉粥样硬化模型中均表达下调，而激活 PGC-1α 则可发挥抗动脉粥样硬化作用[24]；此外，PGC-1α 参与了多种纤维化疾病的细胞表型转换，如在各种急、慢性肾病及老龄引起的肾纤维化动物模型中，肾组织内 PGC-1α 高表达可缓解肾纤维化，而敲除 PGC-1α 基因的动物出现严重的肾纤维化[25]；在心肌成纤维细胞中特异性敲除 PGC-1α 可诱发心肌重塑，加重血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化，伴随氧化应激反应和炎症反应出现[5]。但是，目前尚无关于 PGC-1α 与 AS 的相关研究。因此我们进行了相关研究，且结果显示，在大鼠和人 AVIC 活化表型中，PGC-1α 的表达增加均发挥了保护性作用，可以缓解 TGF-β1 诱导的 AVIC 活化程度。但是其作用机制是否如前所述与活性氧的生成减少有关及其如何调控活性氧生成均尚未可知。
PGC-1α 基因位于小鼠的 5 号染色体（人类的 4 号染色体）上，编码含有 797 个（小鼠）或 798 个（人类）氨基酸的蛋白质。PGC-1α C 端包含丝氨酸/精氨酸和 RNA 识别基序结构域，可通过识别靶基因上特定序列，与各种转录因子和核受体结合来发挥其转录调节功能[26]。肝细胞中免疫共沉淀后转录组分析报道显示，可被 PGC-1α 潜在结合而调控的 RNA 为编码 FOXO1、PER1、TRPC5 和 CAMK1δ 等[7]。因此，我们通过体外细胞实验进行了筛选验证，结果发现过表达 PGC-1α 能下调 CAMK1δ 的表达水平，而沉默 CAMK1δ 的表达后 AVIC 纤维性活化程度明显减轻，表明 PGC-1α 至少部分通过调控 CAMK1δ 的表达水平发挥 AVIC 活化抑制作用。CAMK1δ 是 CAMK1 家族的成员，CAMK1 亚型包括 CAMK1α、β、γ 和 δ。可被上游 CAMK 激酶磷酸化其苏氨酸残基而激活，介导细胞信号转导[27]。有研究表明，衰老是 AS 的主要危险因素，可通过 NADPH 氧化酶 4-活性氧-CAMK 通路介导心脏重塑[28]。但目前，关于 CAMK1δ 与成纤维样细胞表型转变的研究较少，其细胞内的功能作用尚未完全阐明，后续仍待深入探究。
活性氧是一大类氧化剂的统称，包括源自氧的分子，如超氧化物、过氧化氢、羟基自由基、臭氧和单线态氧等。活性氧在许多心脏病的发病机制中起着关键作用，包括 AS、血管钙化、动脉粥样硬化、心脏纤维化重塑等，并且通常与 TGF-β 信号传导有关[29]。且如前所述，PGC-1α 具有抑制活性氧生成的作用，并且 PGC-1α 可下调 CAMK1δ 表达，而 CAMK1δ 上调与活性氧增加有关[30]。系列证据表明，在 AVIC 活化进程中，PGC-1α 通过下调 CAMK1δ 表达水平抑制活性氧生成而发挥 AVIC 活化抑制作用。因此，我们进行了相关实验，并且验证出 PGC-1α 在 AVIC 活化进程中至少部分通过减少活性氧生成而发挥作用。
mTOR 是一种非典型丝氨酸/苏氨酸激酶，以 mTOR 复合体 1（mTORC1）和 mTOR 复合体 2（mTORC2）的形式存在，属于磷脂酰肌醇激酶家族，在调控细胞凋亡、生长、增殖和自噬中起着至关重要的作用[31]。既往研究报道，在肺纤维化疾病模型中，TGF-β-PI3K-AKT-mTOR 信号通路介导脂多糖诱导的肺成纤维细胞活化[32]。mTOR 被上游调控因子调节，活性氧是其初始调节因子之一[31]。因此，后续我们验证了 PGC-1α 的作用是否通过此通路进行。结果发现，过表达 PGC-1α 后，伴随 AVIC 活化程度缓解、CAMK1δ 表达水平下调、活性氧活性下降的同时，p-mTOR 通路激活受到抑制，提示我们 PGC-1α 至少部分通过抑制 p-mTOR 信号通路激活发挥 AVIC 活化抑制作用。
综上所述，本研究结果表明，过表达 PGC-1α 能通过下调 CAMK1δ 的表达、抑制活性氧活性、负调控 p-mTOR 信号通路激活，进而缓解 TGF-β1 诱导的 AVIC 活化程度，即 PGC-1α 在 AVIC 乃至 AS 进程中发挥保护性作用，有望成为 AS 疾病治疗的靶点。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
