心力衰竭（心衰）是一种严重的心脏疾病，其特征是心脏无法有效地泵血以满足身体的需求，导致血液循环受阻和器官灌注不足。心衰是目前所有心血管领域里治疗难度最大、预后最差的疾病。根据最新数据，我国心衰患者人数达 1 370 万，35 岁及以上居民的患病率为 1.3%，住院患者的病死率高达 2.8%～4.1%[1-2]。近年来，遗传因素在心血管疾病中的作用及其作为治疗靶点的潜力引起了广泛关注。CYP2C19 是 CYP 基因超家族中的重要亚型之一，定位于 10 号染色体，在体内编码细胞色素 P450（CYP450）酶系[3]，后者在维持心血管系统的稳态方面发挥着重要作用。它可催化几种内源性分子的形成和/或代谢，如胆固醇、性激素和花生四烯酸等，已知这几种代谢产物对心血管功能具有重要意义[4]。研究发现，CYP2C19 基因多态性可导致 CYP450 酶活性的改变，从而影响相关疾病的发生和发展。其中，CYP2C19*3（rs12769205 位点突变）是一个关键的多态性位点，它通过破坏内含子 2 中的分支位点，导致 CYP2C19 功能蛋白的异常表达[5]。
作为一种有效的研究方法，基因组关联分析（genome association study, GAS）通过识别与特定性状相关的基因组变异位点，有助于深入理解人类疾病和动植物遗传的机制，并可利用单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）作为标记，探索基因组与表型之间的关联[6]。目前，国内外众多学者利用 GAS 揭示了静脉血栓栓塞[7]、心房颤动[8]等多个心血管疾病背后的遗传变异位点，并证实了其致病作用。而心衰患病的遗传病因仍有待探索。因此，本研究利用 GAS 方法深入分析了 CYP2C19 基因多态性与心衰患者的患病风险及预后之间的关系，旨在揭示 CYP2C19 基因多态性在心衰发生和发展中的作用机制，为心衰的预防和治疗提供新的分子靶点。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选取 2021 年 6 月—2022 年 12 月于新疆维吾尔自治区人民医院心血管内科病房住院并行基因组学检测的 1 368 例患者作为研究对象。所有研究对象均自愿入组并签署知情同意书，并通过我院伦理委员会审批（KY2023081801）。
1.2 研究方法
1.2.1 分组
根据定义将研究对象分为缺血性心衰组和非心衰组。其中，“缺血性心衰”指：① 存在基础的缺血性心脏疾病（如高血压、冠心病）；② 有心衰的临床表现，如呼吸困难、乏力、体液潴留（水肿）、肺部湿性啰音等；③ 至少具有一项或一项以上心血管异常的客观指标，如左心室射血分数（left ventricular ejection, LVEF）、脑钠肽（brain natriuretic peptide, BNP）水平、心肌肌钙蛋白（cardiac troponin, cTn）T、cTnI、X 线胸片和（或）超声心动图结果等；④ 既往病例记录确诊心衰且病因明确；⑤ 并非由于严重感染、恶性肿瘤以及明确肝、肾原发疾病所致的心衰；⑥ 非肺栓塞引起的右心衰竭；⑦ 非糖尿病心肌病引起的心衰。“非心衰”是指无上述心衰临床表现、无心衰病史。
剔除标准：主要为二分类性状关联分析的剔除标准。使用 PLINK 软件，选取“缺血性心衰”与“非心衰”作为表型对个体与基因型数据进行质量控制，通过缺失质控将个体及 SNP 缺失＞2%的值予以剔除，通过次等位基因频率（minor allele frequency, MAF）质控将 MAP＜0.05 的 SNP 予以剔除，通过 Hardy-Weinberg 平衡质控以及杂合度质控，将杂合度在 3 倍标准差以外的个体予以剔除。
1.2.2 观察指标
收集患者的基本信息［性别，年龄，体质量指数（body mass index, BMI），是否合并高血压、冠心病与糖尿病］和相关心功能指标［BNP、cTnI、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）、肌红蛋白（myoglobin, Mb）、肌酸激酶（creatine kinase, CK）与肌酸激酶同工酶（creatine kinase - muscle and brain isoenzyme, CK-MB）］。其中，“高血压”指原发性高血压，定义为：在未使用降压药的情况下，非同日 3 次测量诊室血压，收缩压≥140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）和/或舒张压≥90 mm Hg[9]。“冠心病”指诊断为慢性冠脉疾病与急性冠状动脉综合征的患者[10]。“糖尿病”指 2 型糖尿病，定义为：空腹血糖≥7.0 mmol/L 和/或糖负荷后 2 h 血糖≥11.1 mmol/L[11]。BMI 由体重与身高的平方相除得到。
1.2.3 基因分型
禁食>12 h 后采集受试者的外周静脉血。将血液样品抽入 5 mL 乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）管中，并以 4 000×g 离心 5 min（离心半径 0.224 cm）以分离血浆成分。使用标准苯酚-氯仿法从外周血白细胞中提取基因组 DNA[12]。DNA 样品在使用前储存在-80°C 下，使用时将 DNA 稀释至 50 ng/μL 的浓度。使用 Applied Biosystems 公司提供的 TaqMan® SNP 基因分型测定试剂进行基因分型，使用的引物和探针根据 ABI 网站上的信息选择。使用 Applied Biosystems 7900HT 标准实时 PCR 系统进行热循环。使用序列检测系统（sequenced detection systems, SDS）自动化控制器软件（v2.4）读取平板信息。使用 2.5 μL TaqMan Universa Master Mix、0.15 μL 探针和 1.85 ddH2O 在含有 1 μL DNA 的 6 μL 最终反应体系中进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增。使用 SDS 自动化控制器软件 v2.4（ABI）读取所有 96 孔板信息。
本研究对涉及心血管疾病用药的 31 个关键药物代谢酶基因及其 62 个 SNP 位点进行了检测分析。这些基因包括：ABCB1、ABCC9、ACE、ACY3、ADD1、ADRB1、AGT、AGTR1、APOE、BDKRB2、CACNA1C、CES1、CYP2C19、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4、CYP3A5、CYP4F2、GNB3、GP1BA、ITGB3、KCNJ1、LTC4S、MTHFR、NEDD4L、PEAR1、PTGER3、PTGS1、SLCO1B1、VKORC1 和 ABCG2。每个基因都包含特定的 SNP 位点，如 CYP2C19 基因包含 rs12248560、rs12769205、rs28399504、rs3758581、rs4986893 和 rs72552267 共 6 个位点。每一个 SNP 位点包括 3 种基因型，如 CYP2C19 rs12769205 位点包含 AG、GG 与 AA 3 种基因型，与 2 种等位基因类型，如 CYP2C19 rs12769205 位点包含等位基因 A 与等位基因 G 两种等位基因。等位基因类型是指在某个特定基因位点上，由于遗传变异导致的不同碱基序列组成的基因变体；而基因型是指个体在特定基因位点上携带的一对等位基因的组合。
1.2.4 二分类性状关联分析
观察比较缺血性心衰组和非心衰组患者的遗传数据，包括 SNP 标识、染色体编码、基因坐标、参考等位基因及基因型。个体的表型以因变量的形式表示，其中 1 代表缺血性心衰，0 代表非心衰。将遗传变异（如 SNP）作为自变量输入逻辑回归模型，并在模型中纳入年龄、性别等潜在混杂因素。通过计算每个 SNP 的比值比（odds ratio, OR）及其 95%置信区间（confidence interval, CI），评估这些遗传变异与缺血性心衰患病风险的关联强度。
1.2.5 随访
于缺血性心衰组患者出院后 6 个月完成 1 次有效随访，以探究基因多态性与心衰预后的相关性。由 2 位心血管内科的专职医师及护士完成随访工作，随访的方式为电话随访或者门诊随访。随访的内容包括复查的相关检查结果、药物依从性以及是否发生各类不良事件。研究的终点事件定义为主要不良心血管事件（major adverse cardiovascular events, MACE）的发生，MACE 定义为：非计划性靶血管血运重建、非致死性心肌梗死、因心绞痛或心衰的非计划性再入院、非致死性卒中及心源性死亡[13]。有效随访定义为患者接受电话随访或门诊随访，并且其预后情况被完整记录。
1.3 数据筛选
将数据导入 SPSS 26.0 统计软件，将缺失值≥20%的数据剔除，缺失值＜20%的数据保留，对缺失值按照多重插补进行数据补全处理。
1.4 质量控制
实验操作由专业实验人员完成。临床测量数据予以双人录入，避免错漏。数据录入完毕后交由第三人进行统计分析。
1.5 统计学方法
采用 SPSS 26.0 统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组件比较采用 t 检验；非正态分布的连续型变量以中位数（下四分位数，上四分位数）表示，组间比较采用 Mann-Whitney U 检验。计数资料采用频数和百分比表示，组间比较采用χ2 检验或 Fisher 确切概率法。采用 PLINK 软件、Gitbash 软件进行数据质量控制与二分类性状关联分析，计算χ2 值与 OR 值；采用 Benjamini-Hochberg 方法进行 FDR 检验。Graphpad Prism 用于绘制柱形图。采用多因素 logistic 回归方法分析得出心衰患病的独立危险因素，计算 OR 值及其 95%CI，拟合优度采用 Hosmer-Lemeshow 检验。采用逐步回归方法来识别并排除可能导致多重共线性的变量。双侧检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 两组患者基线临床特征比较
共纳入患者 1 368 例，经二分类性状关联分析剔除 16 例，最终纳入 1 352 例。其中，缺血性心衰组 169 例，非心衰组 1 183 例。两组患者的基本信息比较见表1。可见，缺血性心衰组较非心衰组的年龄较大，合并高血压、冠心病、糖尿病的比例增加，BNP、CK-MB 和 LDH 水平增高（P<0.05）。
表1
缺血性心衰组与非心衰组患者临床特征比较
2.2 两组患者遗传变量二分类性状关联分析结果
二分类性状关联分析结果见表2。可见，CYP2C19 rs12769205 位点为显著性位点并与缺血性心衰的患病具有相关性。在 rs12769205 位点，患者携带等位基因为G时的患病风险低于等位基因A（OR=0.733，P=
表2
二分类性状关联分析结果
2.3 两组患者等位基因与疾病的相关性分析
rs12769205 位点的 G 等位基因在缺血性心衰组中的出现频率为 22.78%（77/338），而在非心衰组中为 28.70%（679/2 366），两组比较差异有统计学意义（χ2=5.141，P=0.024）。
为观察影响 CYP2C19 rs12769205 位点不同等位基因携带者患心衰的影响因素，将患者的基本信息进行变量赋值（表3），多因素 logistic 回归分析结果（表4）显示，患者的等位基因类型、年龄、BMI 和冠心病是心衰的独立影响因素。
表3
变量赋值表
表4
CYP2C19 rs12769205 位点不同等位基因携带者患心衰的多因素 logistic 回归分析
2.4 缺血性心衰患者等位基因与临床指标相关性分析
对缺血性心衰患者的等位基因与临床指标（BNP、cTnI、LDH、cTnT、Mb、CK、CK-MB 与 LVEF）的相关性进行分析结果（图1）显示，在 rs12769205 多态性位点，患者等位基因携带数量与心功能指标水平具有相关性，2 个突变等位基因（GG）携带者 cTnT 水平高于 1 个突变等位基因（AG）携带者（P=0.044），亦高于野生型等位基因（AA）携带者（P=0.028）。
图1
心衰患者的 rs12769205 位点等位基因携带情况与各临床指标的相关性
a. BNP 与等位基因携带情况的相关性；b. cTnI 与等位基因携带情况的相关性；c. LDH 与等位基因携带情况的相关性；d. cTnT 与等位基因携带情况的相关性；e. Mb 与等位基因携带情况的相关性；f. CK 与等位基因携带情况的相关性；g. CK-MB 与等位基因携带情况的相关性；h. LVEF 与等位基因携带情况的相关性。*
2.5 随访结局
共对 169 例缺血性心衰患者在出院 6 个月后进行了随访，其中有效随访 112 例，余 57 例因联系方式错误或拒绝回答而被定义为失访。平均随访时间 1.63（1.00，4.00）个月。在携带 rs12769205 位点等位基因 A 与等位基因 G 的受试者中，分别有 84.21%（32/38）和 15.79%（6/38）发生 MACE，但 2 种等位基因类型在发生与未发生 MACE 组中的分布未显示出统计学差异（χ2=0.632，P=0.427）。依据 rs12769205 位点等位基因类型分组，绘制随访期内 MACE 累积发生率的 Kaplan-Meier 生存曲线，结果显示：携带 2 种等位基因的患者随访期内累积心血管不良事件发生率比较，差异无统计学意义（P=0.430），见图2。
图2
依据 rs12769205 位点等位基因类型分组绘制的 MACE 累计发生率的 Kaplan-Meier 曲线
MACE：主要不良心血管事件；Allele：等位基因；censored：检剔后
3 讨论
近年，GAS 作为确定疾病相关基因、易感区域或疾病的标志物，从而探究复杂疾病遗传机制的方法得到迅速发展，已发现系列心血管疾病相关基因和变异位点。本研究前期采集了心血管疾病患者的外周血样本用于药物基因组学检测，但在分析数据的过程中，利用基因组分析的方法（二分类性状关联分析），发现 CYP2C19 编码的 CYP450 酶系这一药物代谢酶与心衰患病具有相关性。既往研究多集中于探讨 CYP450 酶系作为药物代谢酶的关键作用，却很少关注 CYP450 酶系及其代谢产物在心血管疾病发生发展中的重要作用。CYP450 酶系在体内主要参与花生四烯酸的代谢，作为花生四烯酸在体内的主要代谢酶之一，CYP 酶将花生四烯酸分别经 CYP 环氧合酶和 CYP 羟化酶代谢为活性产物环氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids, EET）和无活性产物羟基二十碳四烯酸（hydroxyeicosatetraenoic acids, HETE）[14-15]。研究发现，花生四烯酸、EET、HETE等均在心血管疾病的发生发展中具有重要意义[5, 16-17]。因此，本研究以此为开头，近一步探讨了 CYP2C19 rs12769205 多态性位点与心衰患病的相关性。本研究结果显示，CYP2C19 rs12769205 多态性位点与缺血性心衰的患病具有相关性，且心衰组患者多携带野生型等位基因且等位基因类型为心衰患病的独立影响因素。此外，在 rs12769205 多态性位点，患者突变等位基因的携带数量与心功能指标 cTnT 水平相关。但对心衰患者的随访结果显示，暂未发现 rs12769205 位点的等位基因类型与患者不良预后具有相关性。
本研究通过比较 rs12769205 多态性位点的等位基因在缺血性心衰和非心衰患者间的分布发现，相比非心衰组，缺血性心衰组患者 rs12769205 位点的 G 等位基因出现的频率减低，这表明缺血性心衰组患者多携带野生型等位基因，结合二分类性状分析结果，可考虑此突变位点为保护性突变，这与既往研究结果相符。有研究对 CYP2C19 多态性位点基因突变的意义进行了探讨，结果发现 CYP2C19 非功能等位基因在人类进化过程中被积极选择并显示出显著的生存优势[18]。此外，野生型等位基因代表 CYP2C19 所编码酶系处于相对正常或高活性状态，这将导致下游代谢产物 EET 与 DHET 的产生增加[15, 18]。有研究对心衰患者外周血内 EET 含量进行测定后发现，心衰患者体内 EET 含量增加，但 EET 的进一步代谢酶 sEH 的活性亦增高，这导致无活性代谢产物 DHET 的含量增加，且 EET/DHET 比值减低，从而导致 EET 这一微血管舒张剂未能在心血管系统中发挥有益作用[19-21]。
此外，本研究利用多因素 logistic 回归分析发现，年龄、冠心病、等位基因类型及 BMI 是心衰的独立影响因素（P＜0.05）。有研究指出，冠心病、高血压已成为心衰的最主要病因。冠状动脉疾病导致缺血性心肌损害，而心衰始于心肌损伤，随着病变的进展出现心肌病理性重塑，进而出现左心室扩大和/或肥大。起初，以肾素-血管紧张素系统、抗利尿激素激活和交感神经兴奋为主的代偿机制尚能维持心脏正常输出，但这些神经体液机制最终将导致直接细胞毒性，致使心泵衰竭[22]。流行病学调查显示，随着年龄增长，心衰患病率迅速增加，70 岁以上人群患病率上升至 10%以上[23]。研究发现，衰老动物模型出现心室重塑、舒张功能障碍、间质纤维化的表现[24]，这提示年龄可能是心功能不全的独立影响因素。此外，BMI 也是心衰的独立危险因素。一项对弗雷明汉心脏研究参与者的分析显示，超重和肥胖患者相比 BMI 正常者，心衰风险分别增加 34%和 104%[25]。研究指出，血液动力学超负荷、神经激素激活和氧化应激引起的心室重塑可能是肥胖与慢性心衰相关的机制[26]。
cTn 是心肌收缩中起调控作用的蛋白，包括 cTnT、cTnI 和 cTnC。当心肌受损时，心肌细胞胞膜的完整性遭到破坏，游离和结合部分的 cTnT 相继释放入血，导致 cTnT 的血液浓度升高。研究指出，发生心衰时，心脏压力和容量负荷增加，由纺锤体组成的心肌纤维束被动拉长、易位和溶解，导致心肌细胞膜损伤，进而出现肌钙蛋白水平的升高[27]。研究指出，在应激、缺血、缺氧等病理条件下，细胞膜磷脂可释放大量的花生四烯酸，从而导致多种有害后果，包括异常的兴奋-收缩耦合、细胞凋亡等，从而出现心脏功能障碍，甚至心衰的发生，表现为肌钙蛋白、肌酸激酶同工酶、乳酸脱氢酶的升高等[28]。而低剂量氯化钆则可消除过量的花生四烯酸的毒性作用，改善心肌活性[29]。本研究发现心衰患者的 CYP2C19 rs12769205 位点突变基因携带数与 cTnT 呈相关性，可推测，心衰患者体内 rs12769205 位点的等位基因突变导致 CYP450 酶活性的减低，这可能导致花生四烯酸的代谢困难，进而出现病变发展过程中心肌酶升高的表现。此外，亦不排除队列中合并急性冠状动脉综合征的患者出现心肌损伤导致的心肌酶升高表现。
目前，基因组测序结果除了用于心血管疾病的患病风险预测外，还可用于对疾病预后的评估[30]。如多基因风险评分在冠状动脉病变等疾病的预后评估（如心血管不良事件的发生率）中显示出良好效果[31]。而本研究旨在探讨 CYP2C19 多态性位点与心衰患病的相关性，因此，本研究暂时只对心衰组患者进行了随访，以评估患者携带的等位基因类型与心衰患者出现 MACE 的相关性；研究结果显示，暂未发现 CYP2C19 rs12769205 位点的等位基因类型与心衰患者出现 MACE 具有相关性。因此，可考虑缺血性心衰组纳入研究的患者例数较少且其中完成随访的患者例数亦较少，这可能是暂未发现有意义的研究结果的原因之一。
本研究存在一些局限性。一方面，本研究的研究例数较少，仅局限于同一家医院。未来的研究应包括来自其他地区、更大样本量的研究，以进一步验证 CYP2C19 基因多态性与心衰患病的相关性。另一方面，本研究虽然通过随访评估了 CYP2C19 基因多态性与心衰预后的相关性，但随访率较低，接下来有待继续补充随访或延长随访时间，以探究遗传因素在心衰患者心血管不良预后中发挥的作用。此外，本研究尚未能从基因功能层面进行研究，并进一步阐述基因多态性影响心衰发生、发展的机制，这是该研究的另一处局限。对于心衰这一多数严重心血管疾病的最终“战场”，除遗传因素外，共病、用药、环境等多个因素都在疾病进展中起到重要作用，而遗传因素解释能力有限，需要结合多层面、多组学研究以深入探讨心衰发病与预后的影响因素。
综上，CYP2C19 基因多态性与缺血性心衰的患病具有相关性，其中 rs12769205 位点基因突变是心衰患病的独立影响因素，但该位点等位基因类型与患者的预后无相关性。
作者贡献声明：永佳蕙：研究设计、数据收集与整理、数据分析、论文撰写；陶静，丽霞：数据收集、数据处理；数据分析：王凯阳；杨毅宁：研究指导、论文修改
志谢：感谢新疆维吾尔自治区科技厅及新疆维吾尔自治区人民医院对本研究的资金支持。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
心力衰竭（心衰）是一种严重的心脏疾病，其特征是心脏无法有效地泵血以满足身体的需求，导致血液循环受阻和器官灌注不足。心衰是目前所有心血管领域里治疗难度最大、预后最差的疾病。根据最新数据，我国心衰患者人数达 1 370 万，35 岁及以上居民的患病率为 1.3%，住院患者的病死率高达 2.8%～4.1%[1-2]。近年来，遗传因素在心血管疾病中的作用及其作为治疗靶点的潜力引起了广泛关注。CYP2C19 是 CYP 基因超家族中的重要亚型之一，定位于 10 号染色体，在体内编码细胞色素 P450（CYP450）酶系[3]，后者在维持心血管系统的稳态方面发挥着重要作用。它可催化几种内源性分子的形成和/或代谢，如胆固醇、性激素和花生四烯酸等，已知这几种代谢产物对心血管功能具有重要意义[4]。研究发现，CYP2C19 基因多态性可导致 CYP450 酶活性的改变，从而影响相关疾病的发生和发展。其中，CYP2C19*3（rs12769205 位点突变）是一个关键的多态性位点，它通过破坏内含子 2 中的分支位点，导致 CYP2C19 功能蛋白的异常表达[5]。
作为一种有效的研究方法，基因组关联分析（genome association study, GAS）通过识别与特定性状相关的基因组变异位点，有助于深入理解人类疾病和动植物遗传的机制，并可利用单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）作为标记，探索基因组与表型之间的关联[6]。目前，国内外众多学者利用 GAS 揭示了静脉血栓栓塞[7]、心房颤动[8]等多个心血管疾病背后的遗传变异位点，并证实了其致病作用。而心衰患病的遗传病因仍有待探索。因此，本研究利用 GAS 方法深入分析了 CYP2C19 基因多态性与心衰患者的患病风险及预后之间的关系，旨在揭示 CYP2C19 基因多态性在心衰发生和发展中的作用机制，为心衰的预防和治疗提供新的分子靶点。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选取 2021 年 6 月—2022 年 12 月于新疆维吾尔自治区人民医院心血管内科病房住院并行基因组学检测的 1 368 例患者作为研究对象。所有研究对象均自愿入组并签署知情同意书，并通过我院伦理委员会审批（KY2023081801）。
1.2 研究方法
1.2.1 分组
根据定义将研究对象分为缺血性心衰组和非心衰组。其中，“缺血性心衰”指：① 存在基础的缺血性心脏疾病（如高血压、冠心病）；② 有心衰的临床表现，如呼吸困难、乏力、体液潴留（水肿）、肺部湿性啰音等；③ 至少具有一项或一项以上心血管异常的客观指标，如左心室射血分数（left ventricular ejection, LVEF）、脑钠肽（brain natriuretic peptide, BNP）水平、心肌肌钙蛋白（cardiac troponin, cTn）T、cTnI、X 线胸片和（或）超声心动图结果等；④ 既往病例记录确诊心衰且病因明确；⑤ 并非由于严重感染、恶性肿瘤以及明确肝、肾原发疾病所致的心衰；⑥ 非肺栓塞引起的右心衰竭；⑦ 非糖尿病心肌病引起的心衰。“非心衰”是指无上述心衰临床表现、无心衰病史。
剔除标准：主要为二分类性状关联分析的剔除标准。使用 PLINK 软件，选取“缺血性心衰”与“非心衰”作为表型对个体与基因型数据进行质量控制，通过缺失质控将个体及 SNP 缺失＞2%的值予以剔除，通过次等位基因频率（minor allele frequency, MAF）质控将 MAP＜0.05 的 SNP 予以剔除，通过 Hardy-Weinberg 平衡质控以及杂合度质控，将杂合度在 3 倍标准差以外的个体予以剔除。
1.2.2 观察指标
收集患者的基本信息［性别，年龄，体质量指数（body mass index, BMI），是否合并高血压、冠心病与糖尿病］和相关心功能指标［BNP、cTnI、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）、肌红蛋白（myoglobin, Mb）、肌酸激酶（creatine kinase, CK）与肌酸激酶同工酶（creatine kinase - muscle and brain isoenzyme, CK-MB）］。其中，“高血压”指原发性高血压，定义为：在未使用降压药的情况下，非同日 3 次测量诊室血压，收缩压≥140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）和/或舒张压≥90 mm Hg[9]。“冠心病”指诊断为慢性冠脉疾病与急性冠状动脉综合征的患者[10]。“糖尿病”指 2 型糖尿病，定义为：空腹血糖≥7.0 mmol/L 和/或糖负荷后 2 h 血糖≥11.1 mmol/L[11]。BMI 由体重与身高的平方相除得到。
1.2.3 基因分型
禁食>12 h 后采集受试者的外周静脉血。将血液样品抽入 5 mL 乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）管中，并以 4 000×g 离心 5 min（离心半径 0.224 cm）以分离血浆成分。使用标准苯酚-氯仿法从外周血白细胞中提取基因组 DNA[12]。DNA 样品在使用前储存在-80°C 下，使用时将 DNA 稀释至 50 ng/μL 的浓度。使用 Applied Biosystems 公司提供的 TaqMan® SNP 基因分型测定试剂进行基因分型，使用的引物和探针根据 ABI 网站上的信息选择。使用 Applied Biosystems 7900HT 标准实时 PCR 系统进行热循环。使用序列检测系统（sequenced detection systems, SDS）自动化控制器软件（v2.4）读取平板信息。使用 2.5 μL TaqMan Universa Master Mix、0.15 μL 探针和 1.85 ddH2O 在含有 1 μL DNA 的 6 μL 最终反应体系中进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增。使用 SDS 自动化控制器软件 v2.4（ABI）读取所有 96 孔板信息。
本研究对涉及心血管疾病用药的 31 个关键药物代谢酶基因及其 62 个 SNP 位点进行了检测分析。这些基因包括：ABCB1、ABCC9、ACE、ACY3、ADD1、ADRB1、AGT、AGTR1、APOE、BDKRB2、CACNA1C、CES1、CYP2C19、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4、CYP3A5、CYP4F2、GNB3、GP1BA、ITGB3、KCNJ1、LTC4S、MTHFR、NEDD4L、PEAR1、PTGER3、PTGS1、SLCO1B1、VKORC1 和 ABCG2。每个基因都包含特定的 SNP 位点，如 CYP2C19 基因包含 rs12248560、rs12769205、rs28399504、rs3758581、rs4986893 和 rs72552267 共 6 个位点。每一个 SNP 位点包括 3 种基因型，如 CYP2C19 rs12769205 位点包含 AG、GG 与 AA 3 种基因型，与 2 种等位基因类型，如 CYP2C19 rs12769205 位点包含等位基因 A 与等位基因 G 两种等位基因。等位基因类型是指在某个特定基因位点上，由于遗传变异导致的不同碱基序列组成的基因变体；而基因型是指个体在特定基因位点上携带的一对等位基因的组合。
1.2.4 二分类性状关联分析
观察比较缺血性心衰组和非心衰组患者的遗传数据，包括 SNP 标识、染色体编码、基因坐标、参考等位基因及基因型。个体的表型以因变量的形式表示，其中 1 代表缺血性心衰，0 代表非心衰。将遗传变异（如 SNP）作为自变量输入逻辑回归模型，并在模型中纳入年龄、性别等潜在混杂因素。通过计算每个 SNP 的比值比（odds ratio, OR）及其 95%置信区间（confidence interval, CI），评估这些遗传变异与缺血性心衰患病风险的关联强度。
1.2.5 随访
于缺血性心衰组患者出院后 6 个月完成 1 次有效随访，以探究基因多态性与心衰预后的相关性。由 2 位心血管内科的专职医师及护士完成随访工作，随访的方式为电话随访或者门诊随访。随访的内容包括复查的相关检查结果、药物依从性以及是否发生各类不良事件。研究的终点事件定义为主要不良心血管事件（major adverse cardiovascular events, MACE）的发生，MACE 定义为：非计划性靶血管血运重建、非致死性心肌梗死、因心绞痛或心衰的非计划性再入院、非致死性卒中及心源性死亡[13]。有效随访定义为患者接受电话随访或门诊随访，并且其预后情况被完整记录。
1.3 数据筛选
将数据导入 SPSS 26.0 统计软件，将缺失值≥20%的数据剔除，缺失值＜20%的数据保留，对缺失值按照多重插补进行数据补全处理。
1.4 质量控制
实验操作由专业实验人员完成。临床测量数据予以双人录入，避免错漏。数据录入完毕后交由第三人进行统计分析。
1.5 统计学方法
采用 SPSS 26.0 统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组件比较采用 t 检验；非正态分布的连续型变量以中位数（下四分位数，上四分位数）表示，组间比较采用 Mann-Whitney U 检验。计数资料采用频数和百分比表示，组间比较采用χ2 检验或 Fisher 确切概率法。采用 PLINK 软件、Gitbash 软件进行数据质量控制与二分类性状关联分析，计算χ2 值与 OR 值；采用 Benjamini-Hochberg 方法进行 FDR 检验。Graphpad Prism 用于绘制柱形图。采用多因素 logistic 回归方法分析得出心衰患病的独立危险因素，计算 OR 值及其 95%CI，拟合优度采用 Hosmer-Lemeshow 检验。采用逐步回归方法来识别并排除可能导致多重共线性的变量。双侧检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 两组患者基线临床特征比较
共纳入患者 1 368 例，经二分类性状关联分析剔除 16 例，最终纳入 1 352 例。其中，缺血性心衰组 169 例，非心衰组 1 183 例。两组患者的基本信息比较见表1。可见，缺血性心衰组较非心衰组的年龄较大，合并高血压、冠心病、糖尿病的比例增加，BNP、CK-MB 和 LDH 水平增高（P<0.05）。
表1
缺血性心衰组与非心衰组患者临床特征比较
2.2 两组患者遗传变量二分类性状关联分析结果
二分类性状关联分析结果见表2。可见，CYP2C19 rs12769205 位点为显著性位点并与缺血性心衰的患病具有相关性。在 rs12769205 位点，患者携带等位基因为G时的患病风险低于等位基因A（OR=0.733，P=
表2
二分类性状关联分析结果
2.3 两组患者等位基因与疾病的相关性分析
rs12769205 位点的 G 等位基因在缺血性心衰组中的出现频率为 22.78%（77/338），而在非心衰组中为 28.70%（679/2 366），两组比较差异有统计学意义（χ2=5.141，P=0.024）。
为观察影响 CYP2C19 rs12769205 位点不同等位基因携带者患心衰的影响因素，将患者的基本信息进行变量赋值（表3），多因素 logistic 回归分析结果（表4）显示，患者的等位基因类型、年龄、BMI 和冠心病是心衰的独立影响因素。
表3
变量赋值表
表4
CYP2C19 rs12769205 位点不同等位基因携带者患心衰的多因素 logistic 回归分析
2.4 缺血性心衰患者等位基因与临床指标相关性分析
对缺血性心衰患者的等位基因与临床指标（BNP、cTnI、LDH、cTnT、Mb、CK、CK-MB 与 LVEF）的相关性进行分析结果（图1）显示，在 rs12769205 多态性位点，患者等位基因携带数量与心功能指标水平具有相关性，2 个突变等位基因（GG）携带者 cTnT 水平高于 1 个突变等位基因（AG）携带者（P=0.044），亦高于野生型等位基因（AA）携带者（P=0.028）。
图1
心衰患者的 rs12769205 位点等位基因携带情况与各临床指标的相关性
a. BNP 与等位基因携带情况的相关性；b. cTnI 与等位基因携带情况的相关性；c. LDH 与等位基因携带情况的相关性；d. cTnT 与等位基因携带情况的相关性；e. Mb 与等位基因携带情况的相关性；f. CK 与等位基因携带情况的相关性；g. CK-MB 与等位基因携带情况的相关性；h. LVEF 与等位基因携带情况的相关性。*
2.5 随访结局
共对 169 例缺血性心衰患者在出院 6 个月后进行了随访，其中有效随访 112 例，余 57 例因联系方式错误或拒绝回答而被定义为失访。平均随访时间 1.63（1.00，4.00）个月。在携带 rs12769205 位点等位基因 A 与等位基因 G 的受试者中，分别有 84.21%（32/38）和 15.79%（6/38）发生 MACE，但 2 种等位基因类型在发生与未发生 MACE 组中的分布未显示出统计学差异（χ2=0.632，P=0.427）。依据 rs12769205 位点等位基因类型分组，绘制随访期内 MACE 累积发生率的 Kaplan-Meier 生存曲线，结果显示：携带 2 种等位基因的患者随访期内累积心血管不良事件发生率比较，差异无统计学意义（P=0.430），见图2。
图2
依据 rs12769205 位点等位基因类型分组绘制的 MACE 累计发生率的 Kaplan-Meier 曲线
MACE：主要不良心血管事件；Allele：等位基因；censored：检剔后
3 讨论
近年，GAS 作为确定疾病相关基因、易感区域或疾病的标志物，从而探究复杂疾病遗传机制的方法得到迅速发展，已发现系列心血管疾病相关基因和变异位点。本研究前期采集了心血管疾病患者的外周血样本用于药物基因组学检测，但在分析数据的过程中，利用基因组分析的方法（二分类性状关联分析），发现 CYP2C19 编码的 CYP450 酶系这一药物代谢酶与心衰患病具有相关性。既往研究多集中于探讨 CYP450 酶系作为药物代谢酶的关键作用，却很少关注 CYP450 酶系及其代谢产物在心血管疾病发生发展中的重要作用。CYP450 酶系在体内主要参与花生四烯酸的代谢，作为花生四烯酸在体内的主要代谢酶之一，CYP 酶将花生四烯酸分别经 CYP 环氧合酶和 CYP 羟化酶代谢为活性产物环氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids, EET）和无活性产物羟基二十碳四烯酸（hydroxyeicosatetraenoic acids, HETE）[14-15]。研究发现，花生四烯酸、EET、HETE等均在心血管疾病的发生发展中具有重要意义[5, 16-17]。因此，本研究以此为开头，近一步探讨了 CYP2C19 rs12769205 多态性位点与心衰患病的相关性。本研究结果显示，CYP2C19 rs12769205 多态性位点与缺血性心衰的患病具有相关性，且心衰组患者多携带野生型等位基因且等位基因类型为心衰患病的独立影响因素。此外，在 rs12769205 多态性位点，患者突变等位基因的携带数量与心功能指标 cTnT 水平相关。但对心衰患者的随访结果显示，暂未发现 rs12769205 位点的等位基因类型与患者不良预后具有相关性。
本研究通过比较 rs12769205 多态性位点的等位基因在缺血性心衰和非心衰患者间的分布发现，相比非心衰组，缺血性心衰组患者 rs12769205 位点的 G 等位基因出现的频率减低，这表明缺血性心衰组患者多携带野生型等位基因，结合二分类性状分析结果，可考虑此突变位点为保护性突变，这与既往研究结果相符。有研究对 CYP2C19 多态性位点基因突变的意义进行了探讨，结果发现 CYP2C19 非功能等位基因在人类进化过程中被积极选择并显示出显著的生存优势[18]。此外，野生型等位基因代表 CYP2C19 所编码酶系处于相对正常或高活性状态，这将导致下游代谢产物 EET 与 DHET 的产生增加[15, 18]。有研究对心衰患者外周血内 EET 含量进行测定后发现，心衰患者体内 EET 含量增加，但 EET 的进一步代谢酶 sEH 的活性亦增高，这导致无活性代谢产物 DHET 的含量增加，且 EET/DHET 比值减低，从而导致 EET 这一微血管舒张剂未能在心血管系统中发挥有益作用[19-21]。
此外，本研究利用多因素 logistic 回归分析发现，年龄、冠心病、等位基因类型及 BMI 是心衰的独立影响因素（P＜0.05）。有研究指出，冠心病、高血压已成为心衰的最主要病因。冠状动脉疾病导致缺血性心肌损害，而心衰始于心肌损伤，随着病变的进展出现心肌病理性重塑，进而出现左心室扩大和/或肥大。起初，以肾素-血管紧张素系统、抗利尿激素激活和交感神经兴奋为主的代偿机制尚能维持心脏正常输出，但这些神经体液机制最终将导致直接细胞毒性，致使心泵衰竭[22]。流行病学调查显示，随着年龄增长，心衰患病率迅速增加，70 岁以上人群患病率上升至 10%以上[23]。研究发现，衰老动物模型出现心室重塑、舒张功能障碍、间质纤维化的表现[24]，这提示年龄可能是心功能不全的独立影响因素。此外，BMI 也是心衰的独立危险因素。一项对弗雷明汉心脏研究参与者的分析显示，超重和肥胖患者相比 BMI 正常者，心衰风险分别增加 34%和 104%[25]。研究指出，血液动力学超负荷、神经激素激活和氧化应激引起的心室重塑可能是肥胖与慢性心衰相关的机制[26]。
cTn 是心肌收缩中起调控作用的蛋白，包括 cTnT、cTnI 和 cTnC。当心肌受损时，心肌细胞胞膜的完整性遭到破坏，游离和结合部分的 cTnT 相继释放入血，导致 cTnT 的血液浓度升高。研究指出，发生心衰时，心脏压力和容量负荷增加，由纺锤体组成的心肌纤维束被动拉长、易位和溶解，导致心肌细胞膜损伤，进而出现肌钙蛋白水平的升高[27]。研究指出，在应激、缺血、缺氧等病理条件下，细胞膜磷脂可释放大量的花生四烯酸，从而导致多种有害后果，包括异常的兴奋-收缩耦合、细胞凋亡等，从而出现心脏功能障碍，甚至心衰的发生，表现为肌钙蛋白、肌酸激酶同工酶、乳酸脱氢酶的升高等[28]。而低剂量氯化钆则可消除过量的花生四烯酸的毒性作用，改善心肌活性[29]。本研究发现心衰患者的 CYP2C19 rs12769205 位点突变基因携带数与 cTnT 呈相关性，可推测，心衰患者体内 rs12769205 位点的等位基因突变导致 CYP450 酶活性的减低，这可能导致花生四烯酸的代谢困难，进而出现病变发展过程中心肌酶升高的表现。此外，亦不排除队列中合并急性冠状动脉综合征的患者出现心肌损伤导致的心肌酶升高表现。
目前，基因组测序结果除了用于心血管疾病的患病风险预测外，还可用于对疾病预后的评估[30]。如多基因风险评分在冠状动脉病变等疾病的预后评估（如心血管不良事件的发生率）中显示出良好效果[31]。而本研究旨在探讨 CYP2C19 多态性位点与心衰患病的相关性，因此，本研究暂时只对心衰组患者进行了随访，以评估患者携带的等位基因类型与心衰患者出现 MACE 的相关性；研究结果显示，暂未发现 CYP2C19 rs12769205 位点的等位基因类型与心衰患者出现 MACE 具有相关性。因此，可考虑缺血性心衰组纳入研究的患者例数较少且其中完成随访的患者例数亦较少，这可能是暂未发现有意义的研究结果的原因之一。
本研究存在一些局限性。一方面，本研究的研究例数较少，仅局限于同一家医院。未来的研究应包括来自其他地区、更大样本量的研究，以进一步验证 CYP2C19 基因多态性与心衰患病的相关性。另一方面，本研究虽然通过随访评估了 CYP2C19 基因多态性与心衰预后的相关性，但随访率较低，接下来有待继续补充随访或延长随访时间，以探究遗传因素在心衰患者心血管不良预后中发挥的作用。此外，本研究尚未能从基因功能层面进行研究，并进一步阐述基因多态性影响心衰发生、发展的机制，这是该研究的另一处局限。对于心衰这一多数严重心血管疾病的最终“战场”，除遗传因素外，共病、用药、环境等多个因素都在疾病进展中起到重要作用，而遗传因素解释能力有限，需要结合多层面、多组学研究以深入探讨心衰发病与预后的影响因素。
综上，CYP2C19 基因多态性与缺血性心衰的患病具有相关性，其中 rs12769205 位点基因突变是心衰患病的独立影响因素，但该位点等位基因类型与患者的预后无相关性。
作者贡献声明：永佳蕙：研究设计、数据收集与整理、数据分析、论文撰写；陶静，丽霞：数据收集、数据处理；数据分析：王凯阳；杨毅宁：研究指导、论文修改
志谢：感谢新疆维吾尔自治区科技厅及新疆维吾尔自治区人民医院对本研究的资金支持。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
