类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是最常见的免疫介导性疾病之一，肠道微生物群与患者免疫系统之间的相互作用可能在 RA 的发生发展中起到一定作用。甲氨蝶呤（methotrexate, MTX）作为治疗 RA 的一线药物，肠道微生物及其酶产物可以通过直接和间接机制影响药物的生物利用度、临床疗效和毒性。因此了解肠道微生物群影响 RA 的机制、肠道微生物群对 MTX 疗效的影响至关重要。该文就肠道微生物群可能致 RA 发病的机制，以及肠道微生物群在 MTX 药物代谢和治疗反应中的作用机制及影响作一综述。
引用本文： 张瑞, 张莉, 毛婧, 李文花, 张宪萌, 沈海丽. 基于肠道微生物群探讨类风湿关节炎发病机制及甲氨蝶呤疗效. 华西医学, 2024, 39(8): 1302-1307. doi: 10.7507/1002-0179.202405209 复制
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种发病机制复杂的全身性自身免疫性疾病，其特征是免疫耐受丧失和慢性炎症[1]。虽然 RA 的确切发病机制尚不清楚，但目前认为 RA 的临床表现与遗传易感个体接触环境因素诱发免疫系统靶向激活有关[2]。国内外研究证据表明，RA 的发病机制存在“黏膜起源假说”的特征，黏膜起源假说是指因慢性黏膜炎症（肠道、口腔和肺部）而导致自身结构的免疫耐受性丧失[3-4]。黏膜微生物组、牙周炎、吸烟等环境因素也会通过促进或加重局部黏膜炎症而参与发病机制。甲氨蝶呤（methotrexate, MTX）作为指南推荐的治疗 RA 的锚定药物，肠道微生物群中的微生物酶对药物的直接作用可以提高或削弱其疗效，药物诱导的肠黏膜炎至少部分与患者的肠道微生物有关[5-6]。了解 MTX 影响肠道微生物群的机制、肠道菌群失调对疗效的影响至关重要。本文就肠道微生物群可能导致 RA 的发病机制，以及肠道微生物群对 MTX 药物代谢和疗效的作用机制及影响进行综述，以期为探索 RA 新的治疗靶点开拓新的视角。
1 肠道微生物群在 RA 发病机制中的作用
Arumugam 等[7]首先提出人类肠道菌群由 3 种主要肠道型细菌组成，即拟杆菌属、普雷沃菌属和瘤胃球菌属，这主要是由关键细菌属的相对丰度决定的。RA 患者的微生物群以普雷沃菌属为主，其次为革兰阳性菌，而双歧杆菌、革兰阴性杆菌和厚壁菌较少[8]。RA 患者在出现临床症状之前就存在普雷沃菌属的富集，提示肠道普雷沃菌属可能与 RA 的发病机制有关[9]。有学者强调了肠道微生物群在 RA 发病机制中的关键作用，其机制主要包括调节炎症因子和免疫反应、损伤肠黏膜屏障和自身抗原的分子模拟[10]。
1.1 调节炎症因子和免疫反应
胃肠道承载着体内大部分免疫细胞，与肠道微生物群的不断相互作用塑造了它们的功能和表型。肠道微生物群介导与宿主免疫系统的持续双向通信，在诱发感染和在人体共生之间维持平衡[11]。肠道相关淋巴组织中的先天免疫细胞是抵御胃肠道外源性物质的第一道防线。肠道菌群紊乱可触发先天免疫细胞的异常激活，导致促炎细胞因子［包括白细胞介素（interleukin, IL）-12、IL-23 和Ⅰ型干扰素等］的上调，以及抗炎细胞因子（包括转化生长因子β和 IL-10 等）的减少[12]。
适应性淋巴细胞是自身免疫的关键参与者，T 细胞和 B 细胞的异常激活会引起 RA。具备促炎能力的肠道病原体可以通过先天免疫过度激活来重塑免疫环境，然后是适应性免疫系统的异常激活[13]。肠道微生物群主要通过微生物群衍生的代谢物，在调节 T 细胞功能方面发挥作用，并可能通过异常抗原呈递和调节适应性免疫来破坏肠道免疫稳态，特别是涉及初始 T 细胞与辅助性 T（helper T, Th）17 细胞的极化和自身反应性 B 细胞的产生[14-15]。肠黏膜含有许多 Th17 和调节性 T（regulatory T, Treg）细胞[16]，Th17 细胞通常以微生物群依赖性方式存在于肠道中，维持组织稳态并对抗细胞外细菌和真菌，而肠道 Treg 细胞保持对饮食抗原、肠道微生物群和自身抗原的耐受性，并抑制自身反应效应 T 细胞的激活和增殖[17]。来自人类肠道的细菌菌株可以调节 Th17 和 Treg 细胞的分化和活化[18]。在生理条件下，Th17 和 Treg 细胞的功能处于平衡状态[19]。肠道菌群失调通过改变 Th17/Treg 细胞比例和滤泡辅助性 T（follicular helper T, Tfh）/滤泡调节性 T（follicular regulatory T, Tfr）细胞失衡导致炎症[20]。微生物抗原还可以在 Tfh 细胞的帮助下诱导 B 淋巴细胞过度激活，分化为浆细胞并产生致病性自身抗体，可能会影响 RA 的发病机制[21]。因此，肠道菌群失调、炎症因子和免疫反应是相互关联的，共同影响 RA 的病情发展。
1.2 改变肠道屏障功能
肠道黏膜屏障由单层肠上皮细胞形成和维持，用于隔离肠腔中的有害物质，避免病原体入侵肠道、进入体循环和肠外组织并引发免疫反应[22]。黏液在这种屏障中起着至关重要的作用，它使得许多扩散分子可以进入宿主组织，同时限制微生物的进入和定植[23]。连蛋白（zonulin）是肠细胞在饮食和微生物刺激下分泌的一种肠毒素，它会刺激肠道黏膜将闭锁小带蛋白 1 和闭塞蛋白从紧密连接复合物中分离出来，从而导致肠道屏障损伤、通透性增加、血液中细菌产物易位和炎症反应的启动[22, 24]。同时 zonulin 诱导 T 细胞介导的黏膜炎症，并可能控制免疫细胞从肠道迁移到关节[25]。
肠道屏障由肠道微生物群和宿主免疫系统之间的微调通信控制[26]。肠上皮细胞通过跨细胞途径和树突状细胞进行管腔抗原取样，调节肠腔和黏膜下层之间的分子运输，导致对非自身的耐受性或免疫反应。黏膜屏障功能的丧失会影响细菌和抗原的运输，并使微生物及其产物进入固有层和上皮下空间。Toll 样受体和病原体相关分子模式对微生物的相互作用可能会激活免疫系统，导致促炎细胞因子的产生（IL-6、肿瘤坏死因子α或 IL-1β）以消除病原体[27]。
RA 患者的肠道完整性受损会导致微生物通过肠道屏障转移到肠道组织甚至体循环中。肠道微生物群可促进局部组织中先天免疫和适应性免疫反应的过度激活，从而导致全身免疫失调[21]。肠道微生物群紊乱也会触发自身反应性细胞通过循环迁移至关节，导致局部关节炎症[28]。自身反应性细胞会激活巨噬细胞，导致炎性细胞因子的产生。此外，肿瘤坏死因子α、IL-6 和 IL-1 等细胞因子可诱导成纤维细胞产生基质金属蛋白酶和核因子κB 配体的受体激活剂，介导骨和软骨组织的破坏，从而导致 RA 的发生发展[29]。有研究在 RA 患者中发现过量的共生肠道细菌会降低人肠上皮细胞中紧密连接蛋白的表达，并通过破坏肠黏膜的完整性来增加疾病发生率[30]。相比之下，粪杆菌的丰度在 RA 患者中降低，证明其可维持肠道屏障功能，维持 Th17/Treg 平衡，并发挥显著的抗炎作用[31]。这些发现表明，肠道微生物群多样性的变化可能会损害肠黏膜通透性，从而促进 RA 的发生[32]。
1.3 自身抗原的分子模拟
分子模拟或交叉反应假说提出，外源性物质（即与自身抗原具有抗原相似性的微生物制剂）可能触发针对自身抗原的免疫反应。肠道细菌可以通过分子模拟激活免疫系统并触发针对自身抗原的 T 细胞反应[33]。普雷沃菌通过激活对关节炎相关自身抗原核糖体蛋白 L23a 具有特异性的自身反应性 T 细胞，促进小鼠关节炎的发展[34]。同样，源自脆弱拟杆菌、白色念珠菌和血链球菌的肽与Ⅱ型胶原相似，并在胶原诱导性关节炎模型中诱导交叉反应[35]。
Pianta 等[36]使用蛋白质组学检测滑膜或外周血单核细胞中人类白细胞 DR 抗原呈递的肽，分别在 52%和 56%的 RA 患者中检测出作为 T 细胞和 B 细胞反应靶标的 N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶（N-acetylglucosamine-6-sulfatase, GNS）和细丝蛋白 A。GNS 和细丝蛋白 A 存在于滑液和发炎的滑膜组织中。人类白细胞 DR 抗原呈递的 GNS 肽与普雷沃菌属中的芳基硫酸酯酶蛋白和副拟杆菌属中 GNS 表位具有明显的同源性。微生物抗原可以通过树突状细胞和巨噬细胞呈递给 CD4+ T 细胞，导致炎症 T 细胞亚型的分化。因此，分子模拟可以部分解释肠道黏膜屏障免疫耐受破坏与 RA 患者自身免疫发展之间的联系。
2 肠道微生物群调节 MTX 的药代动力学
RA 管理指南提出了早期治疗、联合治疗的治疗原则，其中推荐 MTX 单药或与其他传统改善病情抗风湿药（disease-modifying antirheumatic drug, DMARD）作为 RA 治疗的一线方案，剂量最大可用到每周 25～30 mg，我国常用剂量为≤每周 10 mg[37]。由于肠道吸收 MTX 的能力有限，因此口服 MTX 在体内的生物利用度亦有限，这可能与肠道微生物群相关[38]。口服 MTX 后，首先被近端空肠主动吸收，吸收药物的程度和剂量与还原叶酸载体 1 相关，MTX 在口服给药后 0.75～2 h 内血浆浓度将达到最大值，但药物的半衰期相对较短（约为 1 h），18 h 后其在血清中的浓度几乎为零且检测不到[39]。MTX 从肠道进入循环，其中 35%～50%的药物与白蛋白结合，大多数 MTX 通过还原叶酸载体 1 转移到细胞中，主要是红细胞、白细胞、滑膜细胞和肝细胞[40]。
MTX 有 3 种不同的代谢途径[6, 40]：① 肠道代谢：肠道微生物产生的细菌酶即羧肽酶 G2，通过将 MTX 裂解成 2 种非细胞毒性代谢产物即2, 4-二氨基-N10-甲基蝶酸和谷氨酸来降低 MTX 浓度。假单胞菌属可在体外通过羧肽酶 G2 作用于 MTX，催化谷氨酸的产生，这说明肠道细菌可以调节药物活性代谢物的可用性并控制其作用机制。② 肝脏代谢途径：肝脏负责将 MTX 生物转化为7-羟基 MTX，7-羟基 MTX 可抑制二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase, DHFR）。DHFR 也存在于肠道微生物群中，表明它可能影响药物的代谢，反之亦然，导致药物和微生物代谢之间的相互作用。③ 细胞代谢：MTX 在细胞内转化为聚谷氨酸。由于其涉及免疫调节的主要机制，因此该途径优先于其他途径。因此，MTX 的主要活性形式依赖于肠道稳态和肠道屏障完整性。
肠道菌群还可以通过保持肠道屏障的完整性来间接调节药理代谢。微生物生态失调会影响微生物的多样性，从而影响肠道中微生物的易位、免疫调节、代谢和酶降解[41]。高剂量 MTX 发挥一定的抗菌作用，导致宿主中拟杆菌门减少和厚壁菌门丰度增加[42]。对小鼠模型使用 MTX 后，脆弱拟杆菌的丰度降低，但乳酸杆菌的丰度未降低[43]。
3 肠道微生物群影响 MTX 疗效的机制
3.1 药物-肠道微生物群反馈回路
药物治疗效应与肠道微生物群之间存在反馈回路，DMARD 治疗可能会影响和重塑肠道微生物群的结构和功能，直接影响肠道菌群的生长，以调节全身免疫。此外，肠道微生物群的改变也可能通过各种机制改善 DMARD 的疗效[41]。有研究表明，厚壁菌门和拟杆菌门会由于 RA 的治疗而增加，这是治疗后出现的理想结果[42]。同时，也有研究表明，在对标准药物治疗无反应的 RA 患者队列中观察到肠道微生物群中产气梭菌丰度增加，而对药物治疗反应良好的 RA 患者中产气荚膜梭菌减少[44]。这些研究结果表明，微生物群可能会影响患者对 RA 治疗的反应。对 RA 治疗无反应可能与 MTX 消耗有关，目前可能归因于梭状芽胞杆菌丰度增加和拟杆菌丰度降低[45]。
3.2 细菌酶作用
DMARD 治疗反应的差异性与催化其代谢的细菌酶有关。过度暴露于具有 DHFR 活性的蛋白质可恢复耐药大肠杆菌菌株中对细胞内 MTX 的敏感性。MTX 可能与细菌 DHFR 具有相容性，如大肠杆菌和干酪乳杆菌[46]。此外，MTX 可以通过肠道菌群转化为 MTX-聚谷氨酸[47]。一些患者出现对初始口服药物的无反应表现可能是因为由肠道宏基因组（如拟杆菌）决定的四氢叶酸还原酶的产生途径与宿主中的 DHFR 和 MTX 代谢竞争，从而干扰 MTX 的抗炎作用[48]。
3.3 其他可能的机制
除了疗效与肠道菌群失调之间的密切关联外，还有研究探讨了其他可能的机制，包括免疫调节和代谢调节[42, 49-50]。Nayak 等[42]的研究指出，MTX 显著改变了人类肠道微生物组；尽管菌株之间的药物敏感性不同，但针对 DHFR 的作用机制在人和细菌细胞中似乎是保守的；将处理后样本移植到暴露于炎症触发因素的无菌小鼠后，免疫激活受到抑制，从而可以检测到与肠道和脾免疫细胞相关的 MTX 调节细菌分类群。Artacho 等[49]揭示了肠道细菌分类群的丰度和其基因（尤其是参与 MTX 和嘌呤代谢的直系同源物）与临床反应之间存在显著相关性，此外，他们还创建了一个基于微生物组的模型，可以预测不同患者的 MTX 反应程度。RA 患者的临床反应与治疗前的远端肠道样本离体孵育后剩余的 MTX 水平密切相关，这意味着肠道微生物群对 MTX 代谢和疗效存在直接影响。Han 等[50]基于机器学习发现参与 MTX 代谢的基因组成在应答组和非应答组之间存在显著差异，这些基因主要与厚壁菌门和拟杆菌门有关，此外，他们还证明了药物在肠道微生物群中的分解代谢能力与 RA 患者对 MTX 的反应机制密切相关，并提出代谢能力是决定宿主对 MTX 反应的关键组成部分。
4 肠道微生物群对 MTX 疗效的影响
4.1 肠道微生物群或其代谢物对 MTX 胃肠道毒性的影响
长期口服 MTX 可能引起许多不良反应，包括胃肠道毒性、心脏毒性、骨髓毒性、肾毒性和肺毒性，这极大地限制了 MTX 的临床应用。其中，胃肠道毒性是最常见的副作用，其主要症状包括恶心、呕吐、腹痛、腹胀和腹泻，从而导致吸收不良、体重减轻，并最终可能导致停止治疗[51-52]。肠道环境的稳态对整个胃肠道的完整性和功能是至关重要的。肠道微生物群在黏膜炎的发生和进展中起着重要作用，黏膜炎是肠道损伤的主要表现之一[53]。肠道微生物群的组成、结构和代谢物的变化可能会影响 MTX 的代谢，从而影响肠道黏膜的状态。然而，这些复杂的动态过程仍需要进一步研究。
据报道，一些细菌和其代谢产物，如氨基酸、多酚或维生素，可能会影响 MTX 诱导的肠黏膜损伤[52]。其中一种可能的解释是，长期暴露于 MTX 可能会诱导肠道中微生物群落和功能的变化，并诱导下游羧肽酶 G2 活性的破坏，这可能会延迟其对 MTX 的解毒，从而导致胃肠道毒性增加[54]。然而，单一菌株或代谢物对胃肠道毒性的影响范围有限。因此，通过与候选细菌和代谢物建立联合疗法来降低 MTX 的胃肠道毒性是可行的。据报道，饮食的改变会导致肠道微生物群的微环境发生变化，高脂高蔗糖饮食中的蛋白质或脂质会改变肠道环境，最终加重 MTX 诱导的肠道炎症[55]。
4.2 MTX 对 RA 患者肠道微生物群的影响
一项 16S 测序相关研究显示，常规口服剂量的 MTX 不会导致肠道微生物生态的持续紊乱[49]。但之后的研究显示，MTX 可以影响肠道微生物的群落结构，并改变肠道菌群的多样性和功能[56]。MTX 抑制了 40 种代表性肠道细菌菌株中 30%的生长和 43 种细菌分离株中 84%的生长，覆盖了 43%的人类肠道微生物群的相对丰度[57]。动物实验显示，MTX 能以剂量依赖性方式影响人源化小鼠的肠道微生物群组成[54]。低剂量的 MTX 增加了微生物群的物种丰富度和多样性，包括厚壁菌门的相对丰度增加和拟杆菌门的相对丰度降低，这逆转了通常与 RA 相关的微生物群的相对平衡。然而，高剂量的 MTX 却显著降低了肠道细菌多样性[56]。
RA 患者在治疗前的肠道宏基因组决定了他们是否对 MTX 有反应；而不同剂量的 MTX 改变了肠道细菌的物种丰富度和多样性。换而言之，MTX 与肠道微生物群之间可能存在剂量依赖性的双向相互作用。
5 小结与展望
本文重点介绍了肠道微生物群改变致 RA 发病的多种机制以及药物-微生物群相互作用在 MTX 用于 RA 时药物代谢和治疗反应中的可能作用机制和影响。越来越多的证据揭示了肠道微生物群及其代谢物和参与 RA 发病机制的细胞（免疫和非免疫）之间联系的机制。人类肠道微生物群及其酶产物也可以直接和/或间接影响药物的生物利用度、临床疗效和毒性。而某些药物和活性成分可以通过改变肠道微生物群组成来影响免疫系统，从而增强宿主的防御能力。此外，肠道微生物还与 MTX 耐药性或反应不良有关。尽管特定微生物群落的显著异常与 RA 疾病进展有关，但为了促进肠道微生物群靶向治疗的进展，仍需解决以下几个关键问题：首先，将来的研究仍需进一步阐明 RA 与微生物组成改变的相关性以及影响 RA 发展的机制通路；其次，还需进一步探索肠道微生物组是否可以直接代谢体内的 MTX，启动免疫系统以增强反应，或两者兼而有之；第三，有必要了解 MTX 对肠道菌群的相互作用，包括药物对细菌代谢和繁殖的影响，以及细菌对药物生物转化的影响和机制，为优化或恢复 RA 患者微生物共生的治疗策略铺路。
综上所述，肠道微生物群在 MTX 治疗 RA 中作用的研究仍是热点领域，具有重要的临床意义。MTX 作为一种用于治疗肿瘤和免疫性疾病的“老药”，仍需要进一步探索，以改善疗效，降低毒性风险，同时还需要评估调节肠道微生物群以优化 MTX 治疗策略的可能性，来改善 RA 的治疗结局。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种发病机制复杂的全身性自身免疫性疾病，其特征是免疫耐受丧失和慢性炎症[1]。虽然 RA 的确切发病机制尚不清楚，但目前认为 RA 的临床表现与遗传易感个体接触环境因素诱发免疫系统靶向激活有关[2]。国内外研究证据表明，RA 的发病机制存在“黏膜起源假说”的特征，黏膜起源假说是指因慢性黏膜炎症（肠道、口腔和肺部）而导致自身结构的免疫耐受性丧失[3-4]。黏膜微生物组、牙周炎、吸烟等环境因素也会通过促进或加重局部黏膜炎症而参与发病机制。甲氨蝶呤（methotrexate, MTX）作为指南推荐的治疗 RA 的锚定药物，肠道微生物群中的微生物酶对药物的直接作用可以提高或削弱其疗效，药物诱导的肠黏膜炎至少部分与患者的肠道微生物有关[5-6]。了解 MTX 影响肠道微生物群的机制、肠道菌群失调对疗效的影响至关重要。本文就肠道微生物群可能导致 RA 的发病机制，以及肠道微生物群对 MTX 药物代谢和疗效的作用机制及影响进行综述，以期为探索 RA 新的治疗靶点开拓新的视角。
1 肠道微生物群在 RA 发病机制中的作用
Arumugam 等[7]首先提出人类肠道菌群由 3 种主要肠道型细菌组成，即拟杆菌属、普雷沃菌属和瘤胃球菌属，这主要是由关键细菌属的相对丰度决定的。RA 患者的微生物群以普雷沃菌属为主，其次为革兰阳性菌，而双歧杆菌、革兰阴性杆菌和厚壁菌较少[8]。RA 患者在出现临床症状之前就存在普雷沃菌属的富集，提示肠道普雷沃菌属可能与 RA 的发病机制有关[9]。有学者强调了肠道微生物群在 RA 发病机制中的关键作用，其机制主要包括调节炎症因子和免疫反应、损伤肠黏膜屏障和自身抗原的分子模拟[10]。
1.1 调节炎症因子和免疫反应
胃肠道承载着体内大部分免疫细胞，与肠道微生物群的不断相互作用塑造了它们的功能和表型。肠道微生物群介导与宿主免疫系统的持续双向通信，在诱发感染和在人体共生之间维持平衡[11]。肠道相关淋巴组织中的先天免疫细胞是抵御胃肠道外源性物质的第一道防线。肠道菌群紊乱可触发先天免疫细胞的异常激活，导致促炎细胞因子［包括白细胞介素（interleukin, IL）-12、IL-23 和Ⅰ型干扰素等］的上调，以及抗炎细胞因子（包括转化生长因子β和 IL-10 等）的减少[12]。
适应性淋巴细胞是自身免疫的关键参与者，T 细胞和 B 细胞的异常激活会引起 RA。具备促炎能力的肠道病原体可以通过先天免疫过度激活来重塑免疫环境，然后是适应性免疫系统的异常激活[13]。肠道微生物群主要通过微生物群衍生的代谢物，在调节 T 细胞功能方面发挥作用，并可能通过异常抗原呈递和调节适应性免疫来破坏肠道免疫稳态，特别是涉及初始 T 细胞与辅助性 T（helper T, Th）17 细胞的极化和自身反应性 B 细胞的产生[14-15]。肠黏膜含有许多 Th17 和调节性 T（regulatory T, Treg）细胞[16]，Th17 细胞通常以微生物群依赖性方式存在于肠道中，维持组织稳态并对抗细胞外细菌和真菌，而肠道 Treg 细胞保持对饮食抗原、肠道微生物群和自身抗原的耐受性，并抑制自身反应效应 T 细胞的激活和增殖[17]。来自人类肠道的细菌菌株可以调节 Th17 和 Treg 细胞的分化和活化[18]。在生理条件下，Th17 和 Treg 细胞的功能处于平衡状态[19]。肠道菌群失调通过改变 Th17/Treg 细胞比例和滤泡辅助性 T（follicular helper T, Tfh）/滤泡调节性 T（follicular regulatory T, Tfr）细胞失衡导致炎症[20]。微生物抗原还可以在 Tfh 细胞的帮助下诱导 B 淋巴细胞过度激活，分化为浆细胞并产生致病性自身抗体，可能会影响 RA 的发病机制[21]。因此，肠道菌群失调、炎症因子和免疫反应是相互关联的，共同影响 RA 的病情发展。
1.2 改变肠道屏障功能
肠道黏膜屏障由单层肠上皮细胞形成和维持，用于隔离肠腔中的有害物质，避免病原体入侵肠道、进入体循环和肠外组织并引发免疫反应[22]。黏液在这种屏障中起着至关重要的作用，它使得许多扩散分子可以进入宿主组织，同时限制微生物的进入和定植[23]。连蛋白（zonulin）是肠细胞在饮食和微生物刺激下分泌的一种肠毒素，它会刺激肠道黏膜将闭锁小带蛋白 1 和闭塞蛋白从紧密连接复合物中分离出来，从而导致肠道屏障损伤、通透性增加、血液中细菌产物易位和炎症反应的启动[22, 24]。同时 zonulin 诱导 T 细胞介导的黏膜炎症，并可能控制免疫细胞从肠道迁移到关节[25]。
肠道屏障由肠道微生物群和宿主免疫系统之间的微调通信控制[26]。肠上皮细胞通过跨细胞途径和树突状细胞进行管腔抗原取样，调节肠腔和黏膜下层之间的分子运输，导致对非自身的耐受性或免疫反应。黏膜屏障功能的丧失会影响细菌和抗原的运输，并使微生物及其产物进入固有层和上皮下空间。Toll 样受体和病原体相关分子模式对微生物的相互作用可能会激活免疫系统，导致促炎细胞因子的产生（IL-6、肿瘤坏死因子α或 IL-1β）以消除病原体[27]。
RA 患者的肠道完整性受损会导致微生物通过肠道屏障转移到肠道组织甚至体循环中。肠道微生物群可促进局部组织中先天免疫和适应性免疫反应的过度激活，从而导致全身免疫失调[21]。肠道微生物群紊乱也会触发自身反应性细胞通过循环迁移至关节，导致局部关节炎症[28]。自身反应性细胞会激活巨噬细胞，导致炎性细胞因子的产生。此外，肿瘤坏死因子α、IL-6 和 IL-1 等细胞因子可诱导成纤维细胞产生基质金属蛋白酶和核因子κB 配体的受体激活剂，介导骨和软骨组织的破坏，从而导致 RA 的发生发展[29]。有研究在 RA 患者中发现过量的共生肠道细菌会降低人肠上皮细胞中紧密连接蛋白的表达，并通过破坏肠黏膜的完整性来增加疾病发生率[30]。相比之下，粪杆菌的丰度在 RA 患者中降低，证明其可维持肠道屏障功能，维持 Th17/Treg 平衡，并发挥显著的抗炎作用[31]。这些发现表明，肠道微生物群多样性的变化可能会损害肠黏膜通透性，从而促进 RA 的发生[32]。
1.3 自身抗原的分子模拟
分子模拟或交叉反应假说提出，外源性物质（即与自身抗原具有抗原相似性的微生物制剂）可能触发针对自身抗原的免疫反应。肠道细菌可以通过分子模拟激活免疫系统并触发针对自身抗原的 T 细胞反应[33]。普雷沃菌通过激活对关节炎相关自身抗原核糖体蛋白 L23a 具有特异性的自身反应性 T 细胞，促进小鼠关节炎的发展[34]。同样，源自脆弱拟杆菌、白色念珠菌和血链球菌的肽与Ⅱ型胶原相似，并在胶原诱导性关节炎模型中诱导交叉反应[35]。
Pianta 等[36]使用蛋白质组学检测滑膜或外周血单核细胞中人类白细胞 DR 抗原呈递的肽，分别在 52%和 56%的 RA 患者中检测出作为 T 细胞和 B 细胞反应靶标的 N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶（N-acetylglucosamine-6-sulfatase, GNS）和细丝蛋白 A。GNS 和细丝蛋白 A 存在于滑液和发炎的滑膜组织中。人类白细胞 DR 抗原呈递的 GNS 肽与普雷沃菌属中的芳基硫酸酯酶蛋白和副拟杆菌属中 GNS 表位具有明显的同源性。微生物抗原可以通过树突状细胞和巨噬细胞呈递给 CD4+ T 细胞，导致炎症 T 细胞亚型的分化。因此，分子模拟可以部分解释肠道黏膜屏障免疫耐受破坏与 RA 患者自身免疫发展之间的联系。
2 肠道微生物群调节 MTX 的药代动力学
RA 管理指南提出了早期治疗、联合治疗的治疗原则，其中推荐 MTX 单药或与其他传统改善病情抗风湿药（disease-modifying antirheumatic drug, DMARD）作为 RA 治疗的一线方案，剂量最大可用到每周 25～30 mg，我国常用剂量为≤每周 10 mg[37]。由于肠道吸收 MTX 的能力有限，因此口服 MTX 在体内的生物利用度亦有限，这可能与肠道微生物群相关[38]。口服 MTX 后，首先被近端空肠主动吸收，吸收药物的程度和剂量与还原叶酸载体 1 相关，MTX 在口服给药后 0.75～2 h 内血浆浓度将达到最大值，但药物的半衰期相对较短（约为 1 h），18 h 后其在血清中的浓度几乎为零且检测不到[39]。MTX 从肠道进入循环，其中 35%～50%的药物与白蛋白结合，大多数 MTX 通过还原叶酸载体 1 转移到细胞中，主要是红细胞、白细胞、滑膜细胞和肝细胞[40]。
MTX 有 3 种不同的代谢途径[6, 40]：① 肠道代谢：肠道微生物产生的细菌酶即羧肽酶 G2，通过将 MTX 裂解成 2 种非细胞毒性代谢产物即2, 4-二氨基-N10-甲基蝶酸和谷氨酸来降低 MTX 浓度。假单胞菌属可在体外通过羧肽酶 G2 作用于 MTX，催化谷氨酸的产生，这说明肠道细菌可以调节药物活性代谢物的可用性并控制其作用机制。② 肝脏代谢途径：肝脏负责将 MTX 生物转化为7-羟基 MTX，7-羟基 MTX 可抑制二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase, DHFR）。DHFR 也存在于肠道微生物群中，表明它可能影响药物的代谢，反之亦然，导致药物和微生物代谢之间的相互作用。③ 细胞代谢：MTX 在细胞内转化为聚谷氨酸。由于其涉及免疫调节的主要机制，因此该途径优先于其他途径。因此，MTX 的主要活性形式依赖于肠道稳态和肠道屏障完整性。
肠道菌群还可以通过保持肠道屏障的完整性来间接调节药理代谢。微生物生态失调会影响微生物的多样性，从而影响肠道中微生物的易位、免疫调节、代谢和酶降解[41]。高剂量 MTX 发挥一定的抗菌作用，导致宿主中拟杆菌门减少和厚壁菌门丰度增加[42]。对小鼠模型使用 MTX 后，脆弱拟杆菌的丰度降低，但乳酸杆菌的丰度未降低[43]。
3 肠道微生物群影响 MTX 疗效的机制
3.1 药物-肠道微生物群反馈回路
药物治疗效应与肠道微生物群之间存在反馈回路，DMARD 治疗可能会影响和重塑肠道微生物群的结构和功能，直接影响肠道菌群的生长，以调节全身免疫。此外，肠道微生物群的改变也可能通过各种机制改善 DMARD 的疗效[41]。有研究表明，厚壁菌门和拟杆菌门会由于 RA 的治疗而增加，这是治疗后出现的理想结果[42]。同时，也有研究表明，在对标准药物治疗无反应的 RA 患者队列中观察到肠道微生物群中产气梭菌丰度增加，而对药物治疗反应良好的 RA 患者中产气荚膜梭菌减少[44]。这些研究结果表明，微生物群可能会影响患者对 RA 治疗的反应。对 RA 治疗无反应可能与 MTX 消耗有关，目前可能归因于梭状芽胞杆菌丰度增加和拟杆菌丰度降低[45]。
3.2 细菌酶作用
DMARD 治疗反应的差异性与催化其代谢的细菌酶有关。过度暴露于具有 DHFR 活性的蛋白质可恢复耐药大肠杆菌菌株中对细胞内 MTX 的敏感性。MTX 可能与细菌 DHFR 具有相容性，如大肠杆菌和干酪乳杆菌[46]。此外，MTX 可以通过肠道菌群转化为 MTX-聚谷氨酸[47]。一些患者出现对初始口服药物的无反应表现可能是因为由肠道宏基因组（如拟杆菌）决定的四氢叶酸还原酶的产生途径与宿主中的 DHFR 和 MTX 代谢竞争，从而干扰 MTX 的抗炎作用[48]。
3.3 其他可能的机制
除了疗效与肠道菌群失调之间的密切关联外，还有研究探讨了其他可能的机制，包括免疫调节和代谢调节[42, 49-50]。Nayak 等[42]的研究指出，MTX 显著改变了人类肠道微生物组；尽管菌株之间的药物敏感性不同，但针对 DHFR 的作用机制在人和细菌细胞中似乎是保守的；将处理后样本移植到暴露于炎症触发因素的无菌小鼠后，免疫激活受到抑制，从而可以检测到与肠道和脾免疫细胞相关的 MTX 调节细菌分类群。Artacho 等[49]揭示了肠道细菌分类群的丰度和其基因（尤其是参与 MTX 和嘌呤代谢的直系同源物）与临床反应之间存在显著相关性，此外，他们还创建了一个基于微生物组的模型，可以预测不同患者的 MTX 反应程度。RA 患者的临床反应与治疗前的远端肠道样本离体孵育后剩余的 MTX 水平密切相关，这意味着肠道微生物群对 MTX 代谢和疗效存在直接影响。Han 等[50]基于机器学习发现参与 MTX 代谢的基因组成在应答组和非应答组之间存在显著差异，这些基因主要与厚壁菌门和拟杆菌门有关，此外，他们还证明了药物在肠道微生物群中的分解代谢能力与 RA 患者对 MTX 的反应机制密切相关，并提出代谢能力是决定宿主对 MTX 反应的关键组成部分。
4 肠道微生物群对 MTX 疗效的影响
4.1 肠道微生物群或其代谢物对 MTX 胃肠道毒性的影响
长期口服 MTX 可能引起许多不良反应，包括胃肠道毒性、心脏毒性、骨髓毒性、肾毒性和肺毒性，这极大地限制了 MTX 的临床应用。其中，胃肠道毒性是最常见的副作用，其主要症状包括恶心、呕吐、腹痛、腹胀和腹泻，从而导致吸收不良、体重减轻，并最终可能导致停止治疗[51-52]。肠道环境的稳态对整个胃肠道的完整性和功能是至关重要的。肠道微生物群在黏膜炎的发生和进展中起着重要作用，黏膜炎是肠道损伤的主要表现之一[53]。肠道微生物群的组成、结构和代谢物的变化可能会影响 MTX 的代谢，从而影响肠道黏膜的状态。然而，这些复杂的动态过程仍需要进一步研究。
据报道，一些细菌和其代谢产物，如氨基酸、多酚或维生素，可能会影响 MTX 诱导的肠黏膜损伤[52]。其中一种可能的解释是，长期暴露于 MTX 可能会诱导肠道中微生物群落和功能的变化，并诱导下游羧肽酶 G2 活性的破坏，这可能会延迟其对 MTX 的解毒，从而导致胃肠道毒性增加[54]。然而，单一菌株或代谢物对胃肠道毒性的影响范围有限。因此，通过与候选细菌和代谢物建立联合疗法来降低 MTX 的胃肠道毒性是可行的。据报道，饮食的改变会导致肠道微生物群的微环境发生变化，高脂高蔗糖饮食中的蛋白质或脂质会改变肠道环境，最终加重 MTX 诱导的肠道炎症[55]。
4.2 MTX 对 RA 患者肠道微生物群的影响
一项 16S 测序相关研究显示，常规口服剂量的 MTX 不会导致肠道微生物生态的持续紊乱[49]。但之后的研究显示，MTX 可以影响肠道微生物的群落结构，并改变肠道菌群的多样性和功能[56]。MTX 抑制了 40 种代表性肠道细菌菌株中 30%的生长和 43 种细菌分离株中 84%的生长，覆盖了 43%的人类肠道微生物群的相对丰度[57]。动物实验显示，MTX 能以剂量依赖性方式影响人源化小鼠的肠道微生物群组成[54]。低剂量的 MTX 增加了微生物群的物种丰富度和多样性，包括厚壁菌门的相对丰度增加和拟杆菌门的相对丰度降低，这逆转了通常与 RA 相关的微生物群的相对平衡。然而，高剂量的 MTX 却显著降低了肠道细菌多样性[56]。
RA 患者在治疗前的肠道宏基因组决定了他们是否对 MTX 有反应；而不同剂量的 MTX 改变了肠道细菌的物种丰富度和多样性。换而言之，MTX 与肠道微生物群之间可能存在剂量依赖性的双向相互作用。
5 小结与展望
本文重点介绍了肠道微生物群改变致 RA 发病的多种机制以及药物-微生物群相互作用在 MTX 用于 RA 时药物代谢和治疗反应中的可能作用机制和影响。越来越多的证据揭示了肠道微生物群及其代谢物和参与 RA 发病机制的细胞（免疫和非免疫）之间联系的机制。人类肠道微生物群及其酶产物也可以直接和/或间接影响药物的生物利用度、临床疗效和毒性。而某些药物和活性成分可以通过改变肠道微生物群组成来影响免疫系统，从而增强宿主的防御能力。此外，肠道微生物还与 MTX 耐药性或反应不良有关。尽管特定微生物群落的显著异常与 RA 疾病进展有关，但为了促进肠道微生物群靶向治疗的进展，仍需解决以下几个关键问题：首先，将来的研究仍需进一步阐明 RA 与微生物组成改变的相关性以及影响 RA 发展的机制通路；其次，还需进一步探索肠道微生物组是否可以直接代谢体内的 MTX，启动免疫系统以增强反应，或两者兼而有之；第三，有必要了解 MTX 对肠道菌群的相互作用，包括药物对细菌代谢和繁殖的影响，以及细菌对药物生物转化的影响和机制，为优化或恢复 RA 患者微生物共生的治疗策略铺路。
综上所述，肠道微生物群在 MTX 治疗 RA 中作用的研究仍是热点领域，具有重要的临床意义。MTX 作为一种用于治疗肿瘤和免疫性疾病的“老药”，仍需要进一步探索，以改善疗效，降低毒性风险，同时还需要评估调节肠道微生物群以优化 MTX 治疗策略的可能性，来改善 RA 的治疗结局。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。