引用本文： 朱赟, 魏佳明, 曾逸笛, 林瑞芳, 刘泳君, 郭志华. 免疫细胞介导的 DNA 拷贝数与阿尔茨海默病的因果关系：孟德尔随机化研究. 华西医学, 2024, 39(8): 1204-1211. doi: 10.7507/1002-0179.202406232 复制
阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）是以进行性认知功能衰退为显著特征的神经退行性疾病[1]。其病理特征包括β-淀粉样蛋白斑块积累、tau 蛋白神经纤维缠结、脑淀粉样血管病、炎症和神经退行性变，进而导致神经元损伤和脑组织萎缩[2]。DNA 拷贝数变化是基因组中大片段 DNA 的增加或减少的现象，DNA 拷贝数异常导致的线粒体障碍在 AD 发病中起着关键作用[3]，此外，DNA 拷贝数的变化被认为与免疫细胞的异常激活有关，这可能是神经元损伤的重要原因之一[4]。尽管尸检研究揭示了 DNA 拷贝数与 AD 神经病理及认知功能之间的关联，但由于观察性横断面研究的局限性，其与 AD 间的因果关系仍不明确[5]。研究发现，血液中的 DNA 拷贝数可能受免疫细胞的影响，而在外周系统中促炎细胞因子和趋化因子的升高可能会加剧 AD 的进程[6]。免疫细胞的激活，可能引发细胞因子风暴，对神经元造成损伤，加速认知功能的衰退[7]；进一步研究表明，特定基因如 TREM2 的拷贝数变化与 AD 病理直接相关[8]，这提示免疫细胞可能是 DNA 拷贝数影响 AD 发病的中介因素[9]。
孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）是利用遗传变异作为工具变量（instrumental variables, IV）探究变量与疾病之间因果关系的方法[10]。其受混杂因素和反向因果关系的影响较小[11]。本研究旨在运用 MR 方法探讨 DNA 拷贝数与 AD 之间的因果关系，分析免疫细胞表型与 AD 的相关性，并揭示 DNA 拷贝数如何通过特定免疫细胞途径影响 AD 的发病和进展，以望为基于免疫调节的 AD 治疗策略提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 研究设计
本研究通过两样本 MR 分析，评估 DNA 拷贝数作为暴露与 AD 作为结局之间的因果关系及免疫细胞的中介作用，具体步骤如下：① 分析当 DNA 拷贝数作为暴露因素，AD 作为结局变量的单向因果关系，并得出总效应（beta_all）；同时需确保当 AD 作为暴露因素，DNA 拷贝数作为结局变量时的反向 MR 无因果关系。② 将 731 种免疫细胞作为暴露因素，AD 作为结局变量，分析二者之间的因果关系，并根据确定的中介免疫细胞得出 beta2。③ 将 DNA 拷贝数作为暴露因素，AD 相关联的 45 种免疫细胞作为结局变量，分析二者之间的因果关系，并根据确定的中介免疫细胞得出 beta1。④ 根据 beta1、beta2、beta_all，计算得出中介免疫细胞在 DNA 拷贝数对 AD 影响的中介效应和直接效应。
在此过程中，使用单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism, SNP）作为工具变量来评估因果关系。MR 研究设计需要满足 3 个基本假设[12]：① 工具变量与暴露因素之间存在较强关联；② 工具变量与任何混杂因素独立；③ 工具变量仅通过暴露因素影响结果。
1.2 数据来源
本研究使用的 DNA 拷贝数汇总数据可在全基因组关联分析（genome wide association study, GWAS）目录数据库中公开获取（注册号 GCST90026372），这些数据由 Chong 等[13]开发的 AutoMitoC 流水线估算得出，包含了 395 718 例欧洲血统的参与者，是迄今为止发表的最全面的 DNA 拷贝数的遗传评估[14-15]。此外，731 种免疫细胞的遗传数据来自 2020 年的一项研究[16]，其数据收录于 GWAS 目录数据库（注册号 GCST90001391-GCST90002121）。AD 数据则来源于芬兰 FinnGen 项目的欧洲 GWAS[17]R10 版本，包含 437 例患者和 183 753 例对照个体的信息。本研究采用的数据均来自公开数据库，不涉及伦理审批问题。GWAS 数据库研究数据信息见表1。
表1
GWAS 数据库研究数据信息
1.3 工具变量选择
在选取工具变量时，本研究遵循了上述 3 个基本假设，然而最近一项研究表明，与免疫细胞表型相关的 SNP 数量有限[18]，若使用传统的显著性阈值 P＜5×10−8，可能会限制研究的可行性。因此，本研究在处理 DNA 拷贝数及 731 个免疫细胞表型的 SNP 时，统一采用了更为宽松的阈值 P<1×10−5，以增加可用于分析的 SNP 数量[19-20]。
与此同时，为了进一步提高分析的准确性和可靠性，本研究采取了以下步骤：首先使用 R2=0.001 及范围=10 000 kb 的标准来识别并剔除连锁不平衡的 SNP，以避免因遗传连锁导致的统计偏差[21]。其次，排除了中等频率的回文 SNP，这类 SNP 可能出现测序或基因分型错误[22]。最后，为了评估所选工具变量的强度，本研究计算了每个 SNP 的 F 统计量。F 统计量是通过将 SNP 与暴露关联的效应大小（β）的平方除以该关联的方差计算，其反映了工具变量与暴露之间的关联强度。F 统计量＞10 通常被认为是强工具变量的一个指标，表明不存在弱工具变量问题，从而增加了 MR 分析结果的可靠性[23]。
1.4 统计学方法
数据分析使用 R 软件（版本 4.3.1）中的 MRPRESSO（版本 1.0）和 TwoSampleMR（版本 0.5.6）包进行。本研究采用了 5 种方法来评估因果关系，包括逆方差加权法（inverse variance weighted, IVW）、MR-Egger、加权中位数法、简单模式和加权模式方法。其中，IVW 法在因果推理中被认为足够稳健，故选为估计因果效应的主要方法[24]，P＜0.05 表明存在因果关系[25]，其他 4 种方法作为补充分析[26]。为了评价 SNP 的异质性，使用了 Cochran’s Q 检验，并通过 MR-PRESSO 和 MR-Egger 截距检测来校正水平多效性[27]。加权中位数法用于检查内部工具偏倚，如果分析中超过 50%的权重来自有效的 SNP，则该方法能够提供一致的估计。此外，本研究采用了“留一法”进行敏感性分析，通过依次排除每个 SNP 来评估估计值是否由任何单个 SNP 驱动。以比值比（odds ratio, OR）及其 95% 置信区间（confidence interval, CI）评估暴露与结局的效应关系。
通过两步法中介分析，计算 DNA 拷贝数对 AD 的总效应（beta_all）、DNA 拷贝数对确定的中介免疫细胞的影响（beta1）、确定的中介免疫细胞对 AD 的影响（beta2）、中介效应（beta12）[28]、直接效应（beta_dir）及中介效应比。其中，总效应即 DNA 拷贝数对 AD 的整体影响，该整体影响可以分解为 DNA 拷贝数对 AD 的直接影响和免疫细胞介导的间接影响；中介效应（beta12=beta1×beta2）即 DNA 拷贝数通过确定的免疫细胞介导对 AD 的间接影响；直接效应（beta_dir=beta_all−beta12）即 DNA 拷贝数对 AD 的直接影响；通过中介效应比（beta12_p=beta12/beta_all），即中介效应在总效应中的比例可发现 DNA 拷贝数通过该免疫细胞介导对 AD 的影响百分比。若中介效应与总效应的效应量正、负方向不一致，不可计算中介效应比[29]。单侧检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 MR 分析结果
2.1.1 基因预测的 DNA 拷贝数与 AD 的关系
通过剔除连锁不平衡和弱工具变量后，共选择出 134 个与 DNA 拷贝数有关的 SNP，F 值为 19～473。IVW 法检验显示OR=0.241，β=−1.422，95%CI（0.112，0.521），P=0.000 3，提示 DNA 拷贝数与 AD 之间存在负向因果关系，虽简单模式和加权模式方法的 P＞0.05，但 MR-Egger、加权中位数法的 P＜0.05，考虑 IVW 方法为主要方法，结果可信度较高。Cochran’s Q 检验P=0.75，表明 DNA 拷贝数与 AD 的因果关系不存在异质性；MR-PRESSO 检验P=0.76、MR-Egger 截距检验 P=0.36，表明 DNA 拷贝数与 AD 的因果关系不存在水平多效性。DNA 拷贝数与 AD 的 MR 分析见表2。DNA 拷贝数与 AD 的 MR 分析森林图与散点图见图1、2。
表2
DNA 拷贝数与 AD 的 MR 分析
图1
DNA 拷贝数与 AD 的 MR 分析森林图
黑点表示使用单个 SNP 估计 DNA 拷贝数与 AD 风险的影响，黑线表示估计值的 95%CI；红点表示使用 MR-Egger 和 IVW 法估计 DNA 拷贝数与 AD 风险的总体影响，红线表示总体估计值的 95%CI。Inverse variance weighted：逆方差加权法；exposure：DNA 拷贝数；outcome：阿尔茨海默病；横坐标为各个 SNP 估计 DNA 拷贝数对 AD 的效应值；纵坐标为所有纳入的 SNP
图2
DNA 拷贝数与 AD 的 MR 分析散点图
横坐标为单个 SNP 对 DNA 拷贝数的效应，纵坐标为单个 SNP 对 AD 的效应，彩色线为 DNA 拷贝数对 AD 的因果效应估计值拟合线，可见随着 DNA 拷贝数增加，AD 发病风险降低。SNP：单核苷酸多样性；MR Test：孟德尔随机化方法；Inverse variance weighted：逆方差加权法；Weighted median：加权中位数法；Weighted mode：加权模式方法；Simple mode：简单模式；exposure：DNA 拷贝数；outcome：阿尔茨海默病；AD：阿尔茨海默病；MR：孟德尔随机化
此外，将 AD 作为暴露因素，DNA 拷贝数作为结局变量，进行反向 MR 分析结果显示 5 种分析方法（逆方差加权法 P=0.62、加权中位数法 P=0.99、MR-Egger 法 P=0.72、简单模式 P=0.55、加权模式 P=0.52）的 P 值均＞0.05；反向 MR 分析的敏感性分析结果显示，未发现存在异质性或水平多效性，表明 DNA 拷贝数与 AD 间的负向因果关系呈单向。
2.1.2 免疫细胞与 AD 的遗传因果关系
通过剔除连锁不平衡和弱工具变量，与 731 个免疫细胞表型有关的 SNP 数量为 1～93 个，F 值均＞10。将 731 个免疫细胞表型作为暴露因素，AD 作为结局变量，依次进行 731 次两样本 MR 分析，IVW 法检验 45 个免疫细胞表型与 AD 均有因果关系（P＜0.05），见图3。
图3
免疫细胞表型与 AD 的 MR 分析森林图
黑线表示效应值的 95%CI ；红点表示效应值；exposure：免疫细胞表型；nsnp：SNP 数量；method：方法；pval：
2.1.3 DNA 拷贝数与 45 个已知与 AD 具有因果关系的免疫细胞表型的关系
将 DNA 拷贝数作为暴露因素，选取与 DNA 拷贝数相关的 SNP 作为工具变量，与已知的 45 个免疫细胞表型作为结局依次进行两样本 MR 分析，IVW 法检验显示 DNA 拷贝数与 HVEM on CD45RA-CD4+有因果关系［OR=0.534，β=−0.627，95%CI（0.339，0.842），P＜0.05］；敏感性分析结果显示，Cochran’s Q 检验 P=0.99、MR-PRESSO 检验 P=0.99、MR-Egger 截距检验 P=0.24，表明不存在异质性或水平多效性，DNA 拷贝数与该免疫细胞表型具有负向因果关系，结果稳定。DNA 拷贝数与其余 44 个免疫细胞表型 IVW 法结果显示 P 值均＞0.05，差异均无统计学意义。
2.2 免疫细胞表型介导的中介效应比
两步法中介分析结果显示，DNA 拷贝数对该免疫细胞表型影响的效应量为−0.627，HVEM on CD45RA-CD4+对 AD 影响的效应量为 0.104，HVEM on CD45RA-CD4+在 DNA 拷贝数对 AD 影响中的中介效应量为−0.065，DNA 拷贝数对 AD 影响的总效应量为−1.422，该免疫细胞表型介导的中介效应比为 4.6%。
3 讨论
本研究首次运用中介 MR 分析方法，探讨了 DNA 拷贝数、免疫细胞与 AD 间的因果关系；结果表明，DNA 拷贝数与 AD 间存在负向因果关系，而反向 MR 分析未发现 AD 对 DNA 拷贝数的影响。进一步的中介 MR 显示，DNA 拷贝数可能通过 HVEM on CD45RA-CD4+影响 AD 的发病，中介效应比为 4.6%。可见，DNA 拷贝数的增加可能通过降低 HVEM on CD45RA-CD4+水平，进而减少 AD 发病风险，为理解 AD 的发病机制提供了新的视角。
本研究发现 DNA 拷贝数与 AD 呈负向因果关系，与已有研究指出较高的 DNA 拷贝数与减轻 AD 神经病理负担和改善神经认知表现密切相关[30]一致。在 AD 患者的大脑中，线粒体的形态学变化和功能障碍是疾病进展的关键特征[31]。此外，基因和蛋白质表达研究也支持线粒体途径在 AD 发病中的核心作用[32]。值得注意的是，载脂蛋白ε4 等位基因（ApoE-4）作为散发性 AD 的最强遗传风险因素，与线粒体相关蛋白质水平的下降相关。这一发现不仅加深了对 ApoE-4 如何促进 AD 发病的理解，还揭示了它与认知功能恶化之间的内在联系[33]。进一步的研究表明，ApoE-4 与 DNA 拷贝数降低之间存在显著的相关性[15]，这可能是 DNA 拷贝数在 AD 发病中的另一机制[14]。具体而言，DNA 拷贝数与线粒体转录因子 A（TFAM）的水平呈正相关，而 TFAM 作为促进线粒体 DNA 转录和复制的关键因子，其表达水平的增加在 AD 小鼠模型中已被证实可改善老年小鼠的认知功能并减少记忆障碍[13，34]。此外，另一项研究发现，AD 患者脑组织中的 DNA 拷贝数较低，甚至可能具有区域特异性[35]。在一项队列研究中也发现 DNA 拷贝数与 AD 病理呈负相关（β=−0.07，P=0.003 4）[36]。
研究表明，免疫细胞在 AD 发展过程中浸润中枢神经系统，在神经炎症中发挥重要作用[37-38]。活化的中性粒细胞不仅能在血管壁上积聚并黏附，阻碍血液流通，还能穿越受损的血脑屏障进入脑组织，通过释放炎症细胞因子和中性粒细胞胞外陷阱加剧疾病进程[39]。动物模型研究表明，与野生型小鼠相比，认知缺陷小鼠体内 CD45+和 CD18+细胞水平显著升高，特别是在 AD 相关区域，这些细胞主要为中性粒细胞，其高活化状态及在血管中的积聚现象可能与内皮糖萼蛋白复合物的减少相关[40-41]。此外，促炎细胞因子如白细胞介素（interleukin, IL）-1β在 AD 中也扮演了重要角色，它通过召集并激活单核细胞和白细胞等免疫细胞，进一步加剧了神经退行性变[42]。T 淋巴细胞则通过影响神经胶质细胞的功能，间接促进 AD 的发展[43]。特别是 CD4+和 CD8+T 淋巴细胞的迁移增加，在 AD 患者的脑实质中被检测到高水平存在，这些 T 细胞主要参与 IL-17 的产生，而 T 辅助细胞及其标志性细胞因子 IL-17 在 AD 的发病和进展中起着关键的致病作用[44]。IL-12 主要由树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞[45]分泌，在 AD 早期，IL-12 分泌升高与认知表现相关[46]。活化的小胶质细胞在 AD 期间上调 IL-12 的分泌，这不仅促使小胶质细胞转化为致病状态，还损害了β-淀粉样蛋白的清除功能，从而加剧了 AD 的严重程度[47]。肿瘤坏死因子α作为另一种重要的促炎细胞因子，由活化的巨噬细胞和淋巴细胞释放，其通过肿瘤坏死因子α/TNFR1 信号通路的激活促进神经元坏死，推动了 AD 的发展[48]。B 淋巴细胞也通过分泌炎性细胞因子和抗体来调节 AD 的疾病进程[49]。值得注意的是，免疫细胞表型 HVEM on CD45RA-CD4+T 细胞，作为一种效应/记忆 T 细胞亚群[50]，在 AD 病理中可能具有特殊意义。HVEM 是肿瘤坏死因子超家族成员，通过与配体（如 B 细胞淋巴瘤相关抗原和淋巴瘤转化蛋白）的相互作用，调控 T 细胞的活化和抑制功能，进而影响免疫反应[51]。在 AD 背景下，HVEM 的表达和信号传导可能通过调节 T 细胞介导的炎症过程，直接影响神经炎症和神经退行性变的进展[52]。
然而，本研究存在一定的局限性。首先，研究依赖于公开的 GWAS 数据进行 MR 分析。可能受到数据质量、样本选择偏倚和遗传异质性等因素影响。其次，本研究仅探讨了 DNA 拷贝数、特定免疫细胞表型与 AD 之间的因果关系，未全面考察其他可能的中介因素或调节因子。最后，虽本研究为理解 AD 的发病机制提供了新的视角，但距离临床应用还有一定的距离。因此，未来的研究应收集 AD 患者个体水平的数据，以验证和扩展本研究结果；应综合考虑多种因素的作用，以更全面地揭示 AD 的发病机制；并应探索这些发现的临床意义和应用价值，为 AD 的预防和治疗策略提供实践指导。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）是以进行性认知功能衰退为显著特征的神经退行性疾病[1]。其病理特征包括β-淀粉样蛋白斑块积累、tau 蛋白神经纤维缠结、脑淀粉样血管病、炎症和神经退行性变，进而导致神经元损伤和脑组织萎缩[2]。DNA 拷贝数变化是基因组中大片段 DNA 的增加或减少的现象，DNA 拷贝数异常导致的线粒体障碍在 AD 发病中起着关键作用[3]，此外，DNA 拷贝数的变化被认为与免疫细胞的异常激活有关，这可能是神经元损伤的重要原因之一[4]。尽管尸检研究揭示了 DNA 拷贝数与 AD 神经病理及认知功能之间的关联，但由于观察性横断面研究的局限性，其与 AD 间的因果关系仍不明确[5]。研究发现，血液中的 DNA 拷贝数可能受免疫细胞的影响，而在外周系统中促炎细胞因子和趋化因子的升高可能会加剧 AD 的进程[6]。免疫细胞的激活，可能引发细胞因子风暴，对神经元造成损伤，加速认知功能的衰退[7]；进一步研究表明，特定基因如 TREM2 的拷贝数变化与 AD 病理直接相关[8]，这提示免疫细胞可能是 DNA 拷贝数影响 AD 发病的中介因素[9]。
孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）是利用遗传变异作为工具变量（instrumental variables, IV）探究变量与疾病之间因果关系的方法[10]。其受混杂因素和反向因果关系的影响较小[11]。本研究旨在运用 MR 方法探讨 DNA 拷贝数与 AD 之间的因果关系，分析免疫细胞表型与 AD 的相关性，并揭示 DNA 拷贝数如何通过特定免疫细胞途径影响 AD 的发病和进展，以望为基于免疫调节的 AD 治疗策略提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 研究设计
本研究通过两样本 MR 分析，评估 DNA 拷贝数作为暴露与 AD 作为结局之间的因果关系及免疫细胞的中介作用，具体步骤如下：① 分析当 DNA 拷贝数作为暴露因素，AD 作为结局变量的单向因果关系，并得出总效应（beta_all）；同时需确保当 AD 作为暴露因素，DNA 拷贝数作为结局变量时的反向 MR 无因果关系。② 将 731 种免疫细胞作为暴露因素，AD 作为结局变量，分析二者之间的因果关系，并根据确定的中介免疫细胞得出 beta2。③ 将 DNA 拷贝数作为暴露因素，AD 相关联的 45 种免疫细胞作为结局变量，分析二者之间的因果关系，并根据确定的中介免疫细胞得出 beta1。④ 根据 beta1、beta2、beta_all，计算得出中介免疫细胞在 DNA 拷贝数对 AD 影响的中介效应和直接效应。
在此过程中，使用单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism, SNP）作为工具变量来评估因果关系。MR 研究设计需要满足 3 个基本假设[12]：① 工具变量与暴露因素之间存在较强关联；② 工具变量与任何混杂因素独立；③ 工具变量仅通过暴露因素影响结果。
1.2 数据来源
本研究使用的 DNA 拷贝数汇总数据可在全基因组关联分析（genome wide association study, GWAS）目录数据库中公开获取（注册号 GCST90026372），这些数据由 Chong 等[13]开发的 AutoMitoC 流水线估算得出，包含了 395 718 例欧洲血统的参与者，是迄今为止发表的最全面的 DNA 拷贝数的遗传评估[14-15]。此外，731 种免疫细胞的遗传数据来自 2020 年的一项研究[16]，其数据收录于 GWAS 目录数据库（注册号 GCST90001391-GCST90002121）。AD 数据则来源于芬兰 FinnGen 项目的欧洲 GWAS[17]R10 版本，包含 437 例患者和 183 753 例对照个体的信息。本研究采用的数据均来自公开数据库，不涉及伦理审批问题。GWAS 数据库研究数据信息见表1。
表1
GWAS 数据库研究数据信息
1.3 工具变量选择
在选取工具变量时，本研究遵循了上述 3 个基本假设，然而最近一项研究表明，与免疫细胞表型相关的 SNP 数量有限[18]，若使用传统的显著性阈值 P＜5×10−8，可能会限制研究的可行性。因此，本研究在处理 DNA 拷贝数及 731 个免疫细胞表型的 SNP 时，统一采用了更为宽松的阈值 P<1×10−5，以增加可用于分析的 SNP 数量[19-20]。
与此同时，为了进一步提高分析的准确性和可靠性，本研究采取了以下步骤：首先使用 R2=0.001 及范围=10 000 kb 的标准来识别并剔除连锁不平衡的 SNP，以避免因遗传连锁导致的统计偏差[21]。其次，排除了中等频率的回文 SNP，这类 SNP 可能出现测序或基因分型错误[22]。最后，为了评估所选工具变量的强度，本研究计算了每个 SNP 的 F 统计量。F 统计量是通过将 SNP 与暴露关联的效应大小（β）的平方除以该关联的方差计算，其反映了工具变量与暴露之间的关联强度。F 统计量＞10 通常被认为是强工具变量的一个指标，表明不存在弱工具变量问题，从而增加了 MR 分析结果的可靠性[23]。
1.4 统计学方法
数据分析使用 R 软件（版本 4.3.1）中的 MRPRESSO（版本 1.0）和 TwoSampleMR（版本 0.5.6）包进行。本研究采用了 5 种方法来评估因果关系，包括逆方差加权法（inverse variance weighted, IVW）、MR-Egger、加权中位数法、简单模式和加权模式方法。其中，IVW 法在因果推理中被认为足够稳健，故选为估计因果效应的主要方法[24]，P＜0.05 表明存在因果关系[25]，其他 4 种方法作为补充分析[26]。为了评价 SNP 的异质性，使用了 Cochran’s Q 检验，并通过 MR-PRESSO 和 MR-Egger 截距检测来校正水平多效性[27]。加权中位数法用于检查内部工具偏倚，如果分析中超过 50%的权重来自有效的 SNP，则该方法能够提供一致的估计。此外，本研究采用了“留一法”进行敏感性分析，通过依次排除每个 SNP 来评估估计值是否由任何单个 SNP 驱动。以比值比（odds ratio, OR）及其 95% 置信区间（confidence interval, CI）评估暴露与结局的效应关系。
通过两步法中介分析，计算 DNA 拷贝数对 AD 的总效应（beta_all）、DNA 拷贝数对确定的中介免疫细胞的影响（beta1）、确定的中介免疫细胞对 AD 的影响（beta2）、中介效应（beta12）[28]、直接效应（beta_dir）及中介效应比。其中，总效应即 DNA 拷贝数对 AD 的整体影响，该整体影响可以分解为 DNA 拷贝数对 AD 的直接影响和免疫细胞介导的间接影响；中介效应（beta12=beta1×beta2）即 DNA 拷贝数通过确定的免疫细胞介导对 AD 的间接影响；直接效应（beta_dir=beta_all−beta12）即 DNA 拷贝数对 AD 的直接影响；通过中介效应比（beta12_p=beta12/beta_all），即中介效应在总效应中的比例可发现 DNA 拷贝数通过该免疫细胞介导对 AD 的影响百分比。若中介效应与总效应的效应量正、负方向不一致，不可计算中介效应比[29]。单侧检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 MR 分析结果
2.1.1 基因预测的 DNA 拷贝数与 AD 的关系
通过剔除连锁不平衡和弱工具变量后，共选择出 134 个与 DNA 拷贝数有关的 SNP，F 值为 19～473。IVW 法检验显示OR=0.241，β=−1.422，95%CI（0.112，0.521），P=0.000 3，提示 DNA 拷贝数与 AD 之间存在负向因果关系，虽简单模式和加权模式方法的 P＞0.05，但 MR-Egger、加权中位数法的 P＜0.05，考虑 IVW 方法为主要方法，结果可信度较高。Cochran’s Q 检验P=0.75，表明 DNA 拷贝数与 AD 的因果关系不存在异质性；MR-PRESSO 检验P=0.76、MR-Egger 截距检验 P=0.36，表明 DNA 拷贝数与 AD 的因果关系不存在水平多效性。DNA 拷贝数与 AD 的 MR 分析见表2。DNA 拷贝数与 AD 的 MR 分析森林图与散点图见图1、2。
表2
DNA 拷贝数与 AD 的 MR 分析
图1
DNA 拷贝数与 AD 的 MR 分析森林图
黑点表示使用单个 SNP 估计 DNA 拷贝数与 AD 风险的影响，黑线表示估计值的 95%CI；红点表示使用 MR-Egger 和 IVW 法估计 DNA 拷贝数与 AD 风险的总体影响，红线表示总体估计值的 95%CI。Inverse variance weighted：逆方差加权法；exposure：DNA 拷贝数；outcome：阿尔茨海默病；横坐标为各个 SNP 估计 DNA 拷贝数对 AD 的效应值；纵坐标为所有纳入的 SNP
图2
DNA 拷贝数与 AD 的 MR 分析散点图
横坐标为单个 SNP 对 DNA 拷贝数的效应，纵坐标为单个 SNP 对 AD 的效应，彩色线为 DNA 拷贝数对 AD 的因果效应估计值拟合线，可见随着 DNA 拷贝数增加，AD 发病风险降低。SNP：单核苷酸多样性；MR Test：孟德尔随机化方法；Inverse variance weighted：逆方差加权法；Weighted median：加权中位数法；Weighted mode：加权模式方法；Simple mode：简单模式；exposure：DNA 拷贝数；outcome：阿尔茨海默病；AD：阿尔茨海默病；MR：孟德尔随机化
此外，将 AD 作为暴露因素，DNA 拷贝数作为结局变量，进行反向 MR 分析结果显示 5 种分析方法（逆方差加权法 P=0.62、加权中位数法 P=0.99、MR-Egger 法 P=0.72、简单模式 P=0.55、加权模式 P=0.52）的 P 值均＞0.05；反向 MR 分析的敏感性分析结果显示，未发现存在异质性或水平多效性，表明 DNA 拷贝数与 AD 间的负向因果关系呈单向。
2.1.2 免疫细胞与 AD 的遗传因果关系
通过剔除连锁不平衡和弱工具变量，与 731 个免疫细胞表型有关的 SNP 数量为 1～93 个，F 值均＞10。将 731 个免疫细胞表型作为暴露因素，AD 作为结局变量，依次进行 731 次两样本 MR 分析，IVW 法检验 45 个免疫细胞表型与 AD 均有因果关系（P＜0.05），见图3。
图3
免疫细胞表型与 AD 的 MR 分析森林图
黑线表示效应值的 95%CI ；红点表示效应值；exposure：免疫细胞表型；nsnp：SNP 数量；method：方法；pval：
2.1.3 DNA 拷贝数与 45 个已知与 AD 具有因果关系的免疫细胞表型的关系
将 DNA 拷贝数作为暴露因素，选取与 DNA 拷贝数相关的 SNP 作为工具变量，与已知的 45 个免疫细胞表型作为结局依次进行两样本 MR 分析，IVW 法检验显示 DNA 拷贝数与 HVEM on CD45RA-CD4+有因果关系［OR=0.534，β=−0.627，95%CI（0.339，0.842），P＜0.05］；敏感性分析结果显示，Cochran’s Q 检验 P=0.99、MR-PRESSO 检验 P=0.99、MR-Egger 截距检验 P=0.24，表明不存在异质性或水平多效性，DNA 拷贝数与该免疫细胞表型具有负向因果关系，结果稳定。DNA 拷贝数与其余 44 个免疫细胞表型 IVW 法结果显示 P 值均＞0.05，差异均无统计学意义。
2.2 免疫细胞表型介导的中介效应比
两步法中介分析结果显示，DNA 拷贝数对该免疫细胞表型影响的效应量为−0.627，HVEM on CD45RA-CD4+对 AD 影响的效应量为 0.104，HVEM on CD45RA-CD4+在 DNA 拷贝数对 AD 影响中的中介效应量为−0.065，DNA 拷贝数对 AD 影响的总效应量为−1.422，该免疫细胞表型介导的中介效应比为 4.6%。
3 讨论
本研究首次运用中介 MR 分析方法，探讨了 DNA 拷贝数、免疫细胞与 AD 间的因果关系；结果表明，DNA 拷贝数与 AD 间存在负向因果关系，而反向 MR 分析未发现 AD 对 DNA 拷贝数的影响。进一步的中介 MR 显示，DNA 拷贝数可能通过 HVEM on CD45RA-CD4+影响 AD 的发病，中介效应比为 4.6%。可见，DNA 拷贝数的增加可能通过降低 HVEM on CD45RA-CD4+水平，进而减少 AD 发病风险，为理解 AD 的发病机制提供了新的视角。
本研究发现 DNA 拷贝数与 AD 呈负向因果关系，与已有研究指出较高的 DNA 拷贝数与减轻 AD 神经病理负担和改善神经认知表现密切相关[30]一致。在 AD 患者的大脑中，线粒体的形态学变化和功能障碍是疾病进展的关键特征[31]。此外，基因和蛋白质表达研究也支持线粒体途径在 AD 发病中的核心作用[32]。值得注意的是，载脂蛋白ε4 等位基因（ApoE-4）作为散发性 AD 的最强遗传风险因素，与线粒体相关蛋白质水平的下降相关。这一发现不仅加深了对 ApoE-4 如何促进 AD 发病的理解，还揭示了它与认知功能恶化之间的内在联系[33]。进一步的研究表明，ApoE-4 与 DNA 拷贝数降低之间存在显著的相关性[15]，这可能是 DNA 拷贝数在 AD 发病中的另一机制[14]。具体而言，DNA 拷贝数与线粒体转录因子 A（TFAM）的水平呈正相关，而 TFAM 作为促进线粒体 DNA 转录和复制的关键因子，其表达水平的增加在 AD 小鼠模型中已被证实可改善老年小鼠的认知功能并减少记忆障碍[13，34]。此外，另一项研究发现，AD 患者脑组织中的 DNA 拷贝数较低，甚至可能具有区域特异性[35]。在一项队列研究中也发现 DNA 拷贝数与 AD 病理呈负相关（β=−0.07，P=0.003 4）[36]。
研究表明，免疫细胞在 AD 发展过程中浸润中枢神经系统，在神经炎症中发挥重要作用[37-38]。活化的中性粒细胞不仅能在血管壁上积聚并黏附，阻碍血液流通，还能穿越受损的血脑屏障进入脑组织，通过释放炎症细胞因子和中性粒细胞胞外陷阱加剧疾病进程[39]。动物模型研究表明，与野生型小鼠相比，认知缺陷小鼠体内 CD45+和 CD18+细胞水平显著升高，特别是在 AD 相关区域，这些细胞主要为中性粒细胞，其高活化状态及在血管中的积聚现象可能与内皮糖萼蛋白复合物的减少相关[40-41]。此外，促炎细胞因子如白细胞介素（interleukin, IL）-1β在 AD 中也扮演了重要角色，它通过召集并激活单核细胞和白细胞等免疫细胞，进一步加剧了神经退行性变[42]。T 淋巴细胞则通过影响神经胶质细胞的功能，间接促进 AD 的发展[43]。特别是 CD4+和 CD8+T 淋巴细胞的迁移增加，在 AD 患者的脑实质中被检测到高水平存在，这些 T 细胞主要参与 IL-17 的产生，而 T 辅助细胞及其标志性细胞因子 IL-17 在 AD 的发病和进展中起着关键的致病作用[44]。IL-12 主要由树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞[45]分泌，在 AD 早期，IL-12 分泌升高与认知表现相关[46]。活化的小胶质细胞在 AD 期间上调 IL-12 的分泌，这不仅促使小胶质细胞转化为致病状态，还损害了β-淀粉样蛋白的清除功能，从而加剧了 AD 的严重程度[47]。肿瘤坏死因子α作为另一种重要的促炎细胞因子，由活化的巨噬细胞和淋巴细胞释放，其通过肿瘤坏死因子α/TNFR1 信号通路的激活促进神经元坏死，推动了 AD 的发展[48]。B 淋巴细胞也通过分泌炎性细胞因子和抗体来调节 AD 的疾病进程[49]。值得注意的是，免疫细胞表型 HVEM on CD45RA-CD4+T 细胞，作为一种效应/记忆 T 细胞亚群[50]，在 AD 病理中可能具有特殊意义。HVEM 是肿瘤坏死因子超家族成员，通过与配体（如 B 细胞淋巴瘤相关抗原和淋巴瘤转化蛋白）的相互作用，调控 T 细胞的活化和抑制功能，进而影响免疫反应[51]。在 AD 背景下，HVEM 的表达和信号传导可能通过调节 T 细胞介导的炎症过程，直接影响神经炎症和神经退行性变的进展[52]。
然而，本研究存在一定的局限性。首先，研究依赖于公开的 GWAS 数据进行 MR 分析。可能受到数据质量、样本选择偏倚和遗传异质性等因素影响。其次，本研究仅探讨了 DNA 拷贝数、特定免疫细胞表型与 AD 之间的因果关系，未全面考察其他可能的中介因素或调节因子。最后，虽本研究为理解 AD 的发病机制提供了新的视角，但距离临床应用还有一定的距离。因此，未来的研究应收集 AD 患者个体水平的数据，以验证和扩展本研究结果；应综合考虑多种因素的作用，以更全面地揭示 AD 的发病机制；并应探索这些发现的临床意义和应用价值，为 AD 的预防和治疗策略提供实践指导。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
