引用本文： 曲晓丽, 王敏, 贺健康, 刘亚雄, 周新民, 李涤尘, 靳忠民. 共培养的大块组织工程肝构建及体内植入研究. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(3): 325-330. doi: 10.7507/1002-1892.20140073 复制
肝脏移植是治疗慢性肝衰竭、肝硬化、肝癌等终末性肝病的常见方法，存在供体紧缺、需长期服用免疫药物、成活率低等不足[1]，组织工程技术有望解决这些难题。肝脏由多种细胞成分和多种管道系统组成，一般单细胞构建组织技术与传统生物材料均很难模拟其复杂的结构和功能。
原代肝细胞在一定时间内能保持成熟肝细胞功能，具有高活性与高代谢能力[2]，是目前用于肝组织工程研究的常用种子细胞。但原代肝细胞增殖和生长能力有限，在体外难以长期维持功能表达（如白蛋白和尿素的分泌），往往需要通过促进肝细胞聚团生长[3-5]，或者与其他非实质细胞（如成纤维细胞和内皮细胞）共培养等方式来提高肝细胞的活性和功能[6-8]。大量研究表明，原代肝细胞和成纤维细胞共培养能稳定肝细胞的功能，但多为肝细胞层与成纤维细胞层的共培养，罕见细胞在三维支架中共培养，未实现大块组织工程肝的体内长期存活[6-8]。因此我们选用SD大鼠肺成纤维细胞和原代肝细胞于三维支架共培养，并同种异体植入肝硬化SD大鼠模型体内，探讨共培养的大块组织工程肝体内长期存活机制，以期为临床构建可长期存活并具有功能的组织工程肝奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
5～6周龄健康雄性SD大鼠4只，体重150～ 180 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供；标准饲料，自由饮食，室温18～25℃饲养，术前8 h禁食，2 h禁水。原代SD大鼠肺成纤维细胞购于武汉原生原代生物医药科技有限公司，细胞状态良好时呈扁平或细长状，取第3～5代细胞用于实验。
胶原溶液制备方法：参照文献[9]方法并结合西安交通大学机械系统工程国家重点实验室条件制备。取健康雄性SD大鼠鼠尾，乙醇浸泡后抽出白色肌腱溶于0.1%有菌醋酸溶液，搅拌后4℃以9 840 × g离心2 h后弃沉淀，冻干后得到胶原泡沫。将胶原泡沫用0.1%有菌醋酸溶液搅拌溶解至14 mg/mL，置于透析袋中。先后用0.1%有菌醋酸溶液、1%有菌氯仿溶液各透析1 h，然后用0.1%无菌醋酸溶液透析7 d，得到无菌胶原溶液。取5 mL胶原溶液烘干后称取胶原薄膜质量，除以5 mL即获得胶原溶液浓度，用0.1%无菌醋酸溶液调整胶原溶液浓度，得到12 mg/ mL胶原溶液置于无菌容器中，4℃保 存。
前灌注液：NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，KCl 0.40 g/L，NaH2PO4·2H2O 0.078 g/L，Na2HPO4·12H2O 0.151 g/L，HEPES（WOLSEN公司，美国）2.38 g/L，葡萄糖 1.0 g/L。胶原酶灌注液：NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，KCl 0.40 g/L，NaH2PO4·2H2O 0.078 g/L，Na2HPO4·12H2O 0.151 g/L，CaCl2 0.56 g/L，Ⅳ型胶原酶（Sigma公司，美国）0.5 g/ L，2.38 g/L HEPES。肝细胞洗涤液：以Williams’ E培养基（Sigma公司，美国）为基底，加入2.2 g/L NaHCO3、2.38 g/L HEPES 和1%双抗（青、链霉素）溶液。肝细胞培养液：以Williams’ E培养基为基底，加入10%FBS（HyClone公司，美国）、2.2 g/L NaHCO3、500 U/L牛胰岛素（Sigma公司，美国）、500 μg/L地塞米松和1%双抗溶液。SD大鼠肺成纤维细胞培养液：以H-DMEM为基底，加入10%FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）和1%双抗溶液。白蛋白ELISA试剂盒（R&D公司，美国）；尿素氮试剂盒（南京建成生物工程研究所）。
外科显微手术器械（上海医疗器械设备厂）；77202-50蠕动泵（保定兰格恒流泵有限公司）；CO2恒温培养箱（ThermoFisher公司，美国）；HC-3018R高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；倒置荧光显微镜Ti-S（Nikon公司，日本）；真空冷冻干燥机VFD2000（北京博医康实验仪器有限公司）；真空浇铸成型机（西安交通大学快速成型中心）；Pro/ENGINEER Wildfire 5软件（PTC公司，美国）。
1.2 大鼠原代肝细胞分离培养
取4只雄性SD大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠0.3 mL麻醉后，四肢固定，腹部大“十”字切开。游离肝门静脉，留置针插管，近端结扎固定插管。先以37℃预热的前灌注液以25 mL/min流速原位灌注肝脏，直至呈现米黄色；切除肝脏后，用胶原酶灌注液以10 mL/ min流速循环灌注消化肝脏，直至肝脏变软、肿胀，出现大理石样纹理后停止。将肝脏置于4℃预冷的肝细胞洗涤液中，撕破肝包膜，抖落肝细胞，经200目筛网过滤后洗涤3次，用4℃肝细胞培养液重悬。行锥虫蓝染色，倒置相差显微镜观察示细胞成活率＞ 85%。见图 1。
图1
倒置相差显微镜下原代肝细胞观察（锥虫蓝染色× 10） 箭头示死细胞 1.3 共培养的胶原水凝胶人工肝组织构建及体外培养
1.3.1 硅胶模具制备
使用Pro/ENGINEER Wildfire 5软件绘制用于制造硅胶模具的模型，每个小方块边长10 mm、厚2 mm。将设计完成后的STL文件交由西安交通大学国家科学技术园恒通公司，使用SPS 450型光固化快速成型机完成树脂模具的3-D打印。将树脂模具清洗干净后进行硅胶模具的浇铸。称重约100 g硅胶和1.5%（质量比）的固化剂；将树脂模具卡入有机玻璃制造的套壳中，将混入了固化剂的硅胶导入其中，并在真空浇铸成型机中抽真空约3 min；完成后平置24 h，剥下硅胶模具（图 2）。
1.3.2 胶原水凝胶人工肝组织构建
实验分为两组，A组为单纯原代肝细胞（密度为5 ×106个/ mL），B组为原代肝细胞和成纤维细胞共培养（比例为1∶0.4）[10]，原代肝细胞密度与A组相同。预先将硅胶模具和20 mL小烧杯分别在医用乙醇中浸泡过夜。将20 mL小烧杯置于超净台的冰袋上预先降温；向小烧杯中加入10 × DMEM培养基和适量NaOH溶液，调整pH值至7.8左右，然后加入12 mg/mL胶原溶液，逐滴加入NaOH溶液晃动，调节pH值至中性；分别倒入两组细胞悬液，调节pH值至7.4；其中胶原溶液∶细胞悬液∶10 × DMEM比例为5∶4∶1；以上操作均在冰袋上进行，保持温度为0℃。每个硅胶模具中加入200 μL上述混合液，水凝胶支架尺寸为1 cm × 1 cm × 2 mm，然后室温下成胶（图 3）；2 h后成胶脱模，置于24孔板中，每孔加入1 mL肝细胞培养液，每天换 液。
1.3.3 观测指标
① 肝细胞形态观察：于3、7、14、21 d于倒置相差显微镜下观察两组肝细胞形态。② 肝功能检测：以1、3、7、11、14、21 d为检测时间点，于检测前1天更换无血清肝细胞培养液培养。各时间点吸取培养上清液，以556 × g离心5 min后，取上清，分别采用大鼠白蛋白ELISA试剂盒检测白蛋白分泌量，尿素氮试剂盒检测尿素分泌量。
1.4 动物体内植入实验
肝硬化大鼠模型制备由第四军医大学西京消化病医院完成。取24只SPF级雌性SD大鼠（体重200～250 g），按500 mg/（kg·d）剂量腹部皮下注射含50%四氯化碳的橄榄油溶液，每周2次，同时每周按1 mL/100 g剂量灌服30%乙醇溶液2次，持续12周后采血测定肝功能，并行肝脏切片，确定肝硬化模型建立成功。分别于肝硬化大鼠腹腔大网膜包裹1片1.3.2中两组共培养1 d的胶原水凝胶人工肝组织，将肝脏翻起放入近脾门部位（n=12）。分别于植入后3、7、14、28 d处死两组大鼠各3只，收集植入的胶原水凝胶人工肝组织，置于甲醛固定，常规石蜡包埋，切片，行 HE染色、细胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）染色和ALB染色。
1.5 统计学方法
采用SPSS统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用two-way ANOVA检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 肝细胞形态观察
共培养3 d，B组肝细胞开始呈现2～3个聚团生长；而A组肝细胞无明显聚团现象。7 d，两组肝细胞聚团生长较3 d时明显，B组多于A组，有多细胞聚团出现，细胞呈透亮的多边形，细胞核清晰可见。14 d，两组水凝胶中开始出现细胞碎片，细胞边缘不平整，A组较B组更突出。21 d，水凝胶中碎片增多，细胞边缘不平整，两组间无明显差异。见图 4。
2.2 肝功能检测
A组白蛋白分泌量仅于共培养3 d内呈上升趋势，之后均急剧下降；B组白蛋白分泌量于共培养3 d内明显少于A组，前7 d内呈上升趋势，并于7 d时高于A组且达峰值，之后急剧下降，但仍高于A组。各时间点两组白蛋白分泌量比较，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。B组尿素分泌量与A组比较，培养1、3 d时差异无统计学意义（P＞ 0.05）；3 d后开始高于A组，两组均于7 d时达峰值，之后逐渐下降，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见图 5。
2.3 动物体内植入实验
2.3.1 HE染色
植入后3 d，A组肝细胞呈多面体，核大而圆且居中，部分有双核或多核，核仁明显，核膜清楚，肝细胞在水凝胶支架中生长状况良好，部分细胞间出现连接，只有少量炎性细胞附着于水凝胶表面，中心尚无炎性细胞浸润，对细胞状态影响小；7 d时开始出现凋亡无核的细胞，细胞边缘模糊；14 d时肝细胞结构尚完整，但逐渐有凋亡趋势，核膜、核仁破碎，核膜色不清，水凝胶中心也出现少量炎性细胞浸润；28 d时未见肝细胞。植入后3、7、14 d时，B组肝细胞生长状况良好并有聚集或排列生长表现，偶见炎性细胞浸润；28 d时细胞生长状态尚可，呈多边形，细胞核清晰可见，部分为多核，但密度明显减少。见图 6。
图6
植入后两组HE染色观察（× 20） ⓐ A组3 d ⓑ B组3 d ⓒ A组7 d ⓓ B组7 d ⓔ A组14 d ⓕ B组14 d ⓖ A组28 d ⓗ B组28 d 2.3.2 ALB染色
植入后3 d，A组肝细胞形态模糊，但已经开始表达白蛋白；7 d时肝细胞状态良好，白蛋白分泌更为旺盛；14 d时肝细胞数量和白蛋白分泌量均下降；28 d未见肝细胞。植入后3、7、14 d，B组肝细胞数量和状态均较稳定，白蛋白分泌也处于较高水平；28 d时，虽然细胞数量明显减少，但白蛋白分泌依旧旺盛。见图 7。
2.3.3 CK18染色
植入后各时间点A、B组的肝细胞均维持了成熟肝细胞表型。见图 8。
3 讨论
原代肝细胞在体外易失去表性特征和生物功能，增殖潜力受限，与肝脏非实质细胞混合共培养能有效改善该问题，既往已有很多相关报道。Nishikawa等[11]使用NIH/3T3成纤维细胞与肝细胞在共价固定了胶原的聚二甲基硅氧烷硅胶膜上共培养，能够形成双层结构，肝细胞的各项功能表达均维持在较高水平，尤其是白蛋白分泌量是空白组（硅胶膜上只种植肝细胞）的20倍左右。Sakai等[12]通过一层肝细胞和一层成纤维细胞叠加的方法构建了片层组织，发现两层细胞间相互交联，且肝细胞功能良好。虽然两种方法中成纤维细胞均有效提高了肝细胞功能表达，并与肝细胞交联形成片层，但细胞均无支架支撑，只能在二维空间内铺展生长，与构建三维组织工程肝尚有一定距离。而且成纤维细胞和肝细胞之间的相互作用和影响也不是三维空间式的相互作用，降低了成纤维细胞对肝细胞的稳定作用。
结合3-D打印技术，能够快速制造所需的结构模型，并通过负型方法制造模具，为支架细胞复合体提供成胶空间。然后采用SD大鼠同系的肺成纤维细胞与原代肝细胞混匀后配成胶原细胞悬液，成胶过程中肝细胞和成纤维细胞在支架内部被空间立体化，胶原水凝胶为它们提供了三维空间内的支撑，使得它们能在三维空间内建立相互作用和影响，比平面效果更强。
团聚生长是细胞的特性之一，团聚生长可使细胞间建立相互联系，促进彼此生长。倒置相差显微镜观察示，B组体外共培养及体内植入实验均显示肝细胞团聚现象，而A组少见，提示成纤维细胞对肝细胞具有支持和促团聚作用。Kim等[13]采用内皮细胞和肝细胞共培养，肝细胞的团聚生长产生了胆小管功能性结构。提示我们构建的共培养体系中，肝细胞的团聚生长也产生了类似胆小管的功能性结构，但是否具有胆小管功能尚需进一步验证。除了细胞团聚现象，在体内植入实验中，我们还观察到团聚的细胞呈条索状排列。正常肝脏的肝细胞彼此相互接触，按不同平面沿中央静脉呈辐射状排列，形成肝细胞索。我们的结果也呈现此排列规律，提示肝细胞在共培养和水凝胶微环境下，植入至大鼠腹腔大网膜区域，可向类正常肝脏方向生长，表明我们构建的组织工程肝在体内有形成肝脏的潜力。但由于水凝胶降解过快，28 d样本已完全降解，故缺乏后期观测。
体外培养和体内植入结果的共同点在于，共培养组均比单纯肝细胞组细胞团聚生长多，肝功能表达良好，主要原因是：① 胶原水凝胶生物相容性好，免疫排斥反应小，为肝细胞生存提供了良好的结构支持。② 成纤维细胞分泌肝细胞生长因子为肝细胞提供营养支持，有效稳定了其生长状态。A组体外培养14 d时，细胞凋亡、产生碎片，肝功能表达也急剧下降。B组共培养细胞可存活至28 d，体内植入14 d和28 d还可见一些双核肝细胞，说明细胞生长状态依然旺盛。ALB染色结果也表明肝细胞在14 d和28 d能够稳定分泌白蛋 白。
体内共培养肝细胞状态明显好于体外培养的可能原因是：支架移植部位为肝脏下、靠近脾门附近，此处有较多腹腔营养物质及促肝细胞生长因子分泌；另外，肝硬化大鼠肝功能衰竭，自身修复功能也间接刺激植入的组织工程肝表达肝脏功能，刺激植入肝细胞生长旺盛。虽然可能由于植入的肝细胞数量远小于整个肝脏细胞数量，所发挥的肝脏功能并不足以修复整个肝脏，但也启发我们在后续体内植入实验时，给大鼠人为制造一些损伤，如肝切除、肝衰竭、肝硬化等，可能会刺激植入的组织工程肝肝细胞生长和功能表达。
综上述，在胶原水凝胶中共培养大鼠原代肝细胞和成纤维细胞，可以更好地模拟体内细胞微环境及细胞间的构架关系，为组织工程肝提供了更理想的细胞培养体系模型，也为构建可移植的长期存活的组织工程肝奠定了实验基础。
肝脏移植是治疗慢性肝衰竭、肝硬化、肝癌等终末性肝病的常见方法，存在供体紧缺、需长期服用免疫药物、成活率低等不足[1]，组织工程技术有望解决这些难题。肝脏由多种细胞成分和多种管道系统组成，一般单细胞构建组织技术与传统生物材料均很难模拟其复杂的结构和功能。
原代肝细胞在一定时间内能保持成熟肝细胞功能，具有高活性与高代谢能力[2]，是目前用于肝组织工程研究的常用种子细胞。但原代肝细胞增殖和生长能力有限，在体外难以长期维持功能表达（如白蛋白和尿素的分泌），往往需要通过促进肝细胞聚团生长[3-5]，或者与其他非实质细胞（如成纤维细胞和内皮细胞）共培养等方式来提高肝细胞的活性和功能[6-8]。大量研究表明，原代肝细胞和成纤维细胞共培养能稳定肝细胞的功能，但多为肝细胞层与成纤维细胞层的共培养，罕见细胞在三维支架中共培养，未实现大块组织工程肝的体内长期存活[6-8]。因此我们选用SD大鼠肺成纤维细胞和原代肝细胞于三维支架共培养，并同种异体植入肝硬化SD大鼠模型体内，探讨共培养的大块组织工程肝体内长期存活机制，以期为临床构建可长期存活并具有功能的组织工程肝奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
5～6周龄健康雄性SD大鼠4只，体重150～ 180 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供；标准饲料，自由饮食，室温18～25℃饲养，术前8 h禁食，2 h禁水。原代SD大鼠肺成纤维细胞购于武汉原生原代生物医药科技有限公司，细胞状态良好时呈扁平或细长状，取第3～5代细胞用于实验。
胶原溶液制备方法：参照文献[9]方法并结合西安交通大学机械系统工程国家重点实验室条件制备。取健康雄性SD大鼠鼠尾，乙醇浸泡后抽出白色肌腱溶于0.1%有菌醋酸溶液，搅拌后4℃以9 840 × g离心2 h后弃沉淀，冻干后得到胶原泡沫。将胶原泡沫用0.1%有菌醋酸溶液搅拌溶解至14 mg/mL，置于透析袋中。先后用0.1%有菌醋酸溶液、1%有菌氯仿溶液各透析1 h，然后用0.1%无菌醋酸溶液透析7 d，得到无菌胶原溶液。取5 mL胶原溶液烘干后称取胶原薄膜质量，除以5 mL即获得胶原溶液浓度，用0.1%无菌醋酸溶液调整胶原溶液浓度，得到12 mg/ mL胶原溶液置于无菌容器中，4℃保 存。
前灌注液：NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，KCl 0.40 g/L，NaH2PO4·2H2O 0.078 g/L，Na2HPO4·12H2O 0.151 g/L，HEPES（WOLSEN公司，美国）2.38 g/L，葡萄糖 1.0 g/L。胶原酶灌注液：NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，KCl 0.40 g/L，NaH2PO4·2H2O 0.078 g/L，Na2HPO4·12H2O 0.151 g/L，CaCl2 0.56 g/L，Ⅳ型胶原酶（Sigma公司，美国）0.5 g/ L，2.38 g/L HEPES。肝细胞洗涤液：以Williams’ E培养基（Sigma公司，美国）为基底，加入2.2 g/L NaHCO3、2.38 g/L HEPES 和1%双抗（青、链霉素）溶液。肝细胞培养液：以Williams’ E培养基为基底，加入10%FBS（HyClone公司，美国）、2.2 g/L NaHCO3、500 U/L牛胰岛素（Sigma公司，美国）、500 μg/L地塞米松和1%双抗溶液。SD大鼠肺成纤维细胞培养液：以H-DMEM为基底，加入10%FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）和1%双抗溶液。白蛋白ELISA试剂盒（R&D公司，美国）；尿素氮试剂盒（南京建成生物工程研究所）。
外科显微手术器械（上海医疗器械设备厂）；77202-50蠕动泵（保定兰格恒流泵有限公司）；CO2恒温培养箱（ThermoFisher公司，美国）；HC-3018R高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；倒置荧光显微镜Ti-S（Nikon公司，日本）；真空冷冻干燥机VFD2000（北京博医康实验仪器有限公司）；真空浇铸成型机（西安交通大学快速成型中心）；Pro/ENGINEER Wildfire 5软件（PTC公司，美国）。
1.2 大鼠原代肝细胞分离培养
取4只雄性SD大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠0.3 mL麻醉后，四肢固定，腹部大“十”字切开。游离肝门静脉，留置针插管，近端结扎固定插管。先以37℃预热的前灌注液以25 mL/min流速原位灌注肝脏，直至呈现米黄色；切除肝脏后，用胶原酶灌注液以10 mL/ min流速循环灌注消化肝脏，直至肝脏变软、肿胀，出现大理石样纹理后停止。将肝脏置于4℃预冷的肝细胞洗涤液中，撕破肝包膜，抖落肝细胞，经200目筛网过滤后洗涤3次，用4℃肝细胞培养液重悬。行锥虫蓝染色，倒置相差显微镜观察示细胞成活率＞ 85%。见图 1。
图1
倒置相差显微镜下原代肝细胞观察（锥虫蓝染色× 10） 箭头示死细胞 1.3 共培养的胶原水凝胶人工肝组织构建及体外培养
1.3.1 硅胶模具制备
使用Pro/ENGINEER Wildfire 5软件绘制用于制造硅胶模具的模型，每个小方块边长10 mm、厚2 mm。将设计完成后的STL文件交由西安交通大学国家科学技术园恒通公司，使用SPS 450型光固化快速成型机完成树脂模具的3-D打印。将树脂模具清洗干净后进行硅胶模具的浇铸。称重约100 g硅胶和1.5%（质量比）的固化剂；将树脂模具卡入有机玻璃制造的套壳中，将混入了固化剂的硅胶导入其中，并在真空浇铸成型机中抽真空约3 min；完成后平置24 h，剥下硅胶模具（图 2）。
1.3.2 胶原水凝胶人工肝组织构建
实验分为两组，A组为单纯原代肝细胞（密度为5 ×106个/ mL），B组为原代肝细胞和成纤维细胞共培养（比例为1∶0.4）[10]，原代肝细胞密度与A组相同。预先将硅胶模具和20 mL小烧杯分别在医用乙醇中浸泡过夜。将20 mL小烧杯置于超净台的冰袋上预先降温；向小烧杯中加入10 × DMEM培养基和适量NaOH溶液，调整pH值至7.8左右，然后加入12 mg/mL胶原溶液，逐滴加入NaOH溶液晃动，调节pH值至中性；分别倒入两组细胞悬液，调节pH值至7.4；其中胶原溶液∶细胞悬液∶10 × DMEM比例为5∶4∶1；以上操作均在冰袋上进行，保持温度为0℃。每个硅胶模具中加入200 μL上述混合液，水凝胶支架尺寸为1 cm × 1 cm × 2 mm，然后室温下成胶（图 3）；2 h后成胶脱模，置于24孔板中，每孔加入1 mL肝细胞培养液，每天换 液。
1.3.3 观测指标
① 肝细胞形态观察：于3、7、14、21 d于倒置相差显微镜下观察两组肝细胞形态。② 肝功能检测：以1、3、7、11、14、21 d为检测时间点，于检测前1天更换无血清肝细胞培养液培养。各时间点吸取培养上清液，以556 × g离心5 min后，取上清，分别采用大鼠白蛋白ELISA试剂盒检测白蛋白分泌量，尿素氮试剂盒检测尿素分泌量。
1.4 动物体内植入实验
肝硬化大鼠模型制备由第四军医大学西京消化病医院完成。取24只SPF级雌性SD大鼠（体重200～250 g），按500 mg/（kg·d）剂量腹部皮下注射含50%四氯化碳的橄榄油溶液，每周2次，同时每周按1 mL/100 g剂量灌服30%乙醇溶液2次，持续12周后采血测定肝功能，并行肝脏切片，确定肝硬化模型建立成功。分别于肝硬化大鼠腹腔大网膜包裹1片1.3.2中两组共培养1 d的胶原水凝胶人工肝组织，将肝脏翻起放入近脾门部位（n=12）。分别于植入后3、7、14、28 d处死两组大鼠各3只，收集植入的胶原水凝胶人工肝组织，置于甲醛固定，常规石蜡包埋，切片，行 HE染色、细胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）染色和ALB染色。
1.5 统计学方法
采用SPSS统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用two-way ANOVA检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 肝细胞形态观察
共培养3 d，B组肝细胞开始呈现2～3个聚团生长；而A组肝细胞无明显聚团现象。7 d，两组肝细胞聚团生长较3 d时明显，B组多于A组，有多细胞聚团出现，细胞呈透亮的多边形，细胞核清晰可见。14 d，两组水凝胶中开始出现细胞碎片，细胞边缘不平整，A组较B组更突出。21 d，水凝胶中碎片增多，细胞边缘不平整，两组间无明显差异。见图 4。
2.2 肝功能检测
A组白蛋白分泌量仅于共培养3 d内呈上升趋势，之后均急剧下降；B组白蛋白分泌量于共培养3 d内明显少于A组，前7 d内呈上升趋势，并于7 d时高于A组且达峰值，之后急剧下降，但仍高于A组。各时间点两组白蛋白分泌量比较，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。B组尿素分泌量与A组比较，培养1、3 d时差异无统计学意义（P＞ 0.05）；3 d后开始高于A组，两组均于7 d时达峰值，之后逐渐下降，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见图 5。
2.3 动物体内植入实验
2.3.1 HE染色
植入后3 d，A组肝细胞呈多面体，核大而圆且居中，部分有双核或多核，核仁明显，核膜清楚，肝细胞在水凝胶支架中生长状况良好，部分细胞间出现连接，只有少量炎性细胞附着于水凝胶表面，中心尚无炎性细胞浸润，对细胞状态影响小；7 d时开始出现凋亡无核的细胞，细胞边缘模糊；14 d时肝细胞结构尚完整，但逐渐有凋亡趋势，核膜、核仁破碎，核膜色不清，水凝胶中心也出现少量炎性细胞浸润；28 d时未见肝细胞。植入后3、7、14 d时，B组肝细胞生长状况良好并有聚集或排列生长表现，偶见炎性细胞浸润；28 d时细胞生长状态尚可，呈多边形，细胞核清晰可见，部分为多核，但密度明显减少。见图 6。
图6
植入后两组HE染色观察（× 20） ⓐ A组3 d ⓑ B组3 d ⓒ A组7 d ⓓ B组7 d ⓔ A组14 d ⓕ B组14 d ⓖ A组28 d ⓗ B组28 d 2.3.2 ALB染色
植入后3 d，A组肝细胞形态模糊，但已经开始表达白蛋白；7 d时肝细胞状态良好，白蛋白分泌更为旺盛；14 d时肝细胞数量和白蛋白分泌量均下降；28 d未见肝细胞。植入后3、7、14 d，B组肝细胞数量和状态均较稳定，白蛋白分泌也处于较高水平；28 d时，虽然细胞数量明显减少，但白蛋白分泌依旧旺盛。见图 7。
2.3.3 CK18染色
植入后各时间点A、B组的肝细胞均维持了成熟肝细胞表型。见图 8。
3 讨论
原代肝细胞在体外易失去表性特征和生物功能，增殖潜力受限，与肝脏非实质细胞混合共培养能有效改善该问题，既往已有很多相关报道。Nishikawa等[11]使用NIH/3T3成纤维细胞与肝细胞在共价固定了胶原的聚二甲基硅氧烷硅胶膜上共培养，能够形成双层结构，肝细胞的各项功能表达均维持在较高水平，尤其是白蛋白分泌量是空白组（硅胶膜上只种植肝细胞）的20倍左右。Sakai等[12]通过一层肝细胞和一层成纤维细胞叠加的方法构建了片层组织，发现两层细胞间相互交联，且肝细胞功能良好。虽然两种方法中成纤维细胞均有效提高了肝细胞功能表达，并与肝细胞交联形成片层，但细胞均无支架支撑，只能在二维空间内铺展生长，与构建三维组织工程肝尚有一定距离。而且成纤维细胞和肝细胞之间的相互作用和影响也不是三维空间式的相互作用，降低了成纤维细胞对肝细胞的稳定作用。
结合3-D打印技术，能够快速制造所需的结构模型，并通过负型方法制造模具，为支架细胞复合体提供成胶空间。然后采用SD大鼠同系的肺成纤维细胞与原代肝细胞混匀后配成胶原细胞悬液，成胶过程中肝细胞和成纤维细胞在支架内部被空间立体化，胶原水凝胶为它们提供了三维空间内的支撑，使得它们能在三维空间内建立相互作用和影响，比平面效果更强。
团聚生长是细胞的特性之一，团聚生长可使细胞间建立相互联系，促进彼此生长。倒置相差显微镜观察示，B组体外共培养及体内植入实验均显示肝细胞团聚现象，而A组少见，提示成纤维细胞对肝细胞具有支持和促团聚作用。Kim等[13]采用内皮细胞和肝细胞共培养，肝细胞的团聚生长产生了胆小管功能性结构。提示我们构建的共培养体系中，肝细胞的团聚生长也产生了类似胆小管的功能性结构，但是否具有胆小管功能尚需进一步验证。除了细胞团聚现象，在体内植入实验中，我们还观察到团聚的细胞呈条索状排列。正常肝脏的肝细胞彼此相互接触，按不同平面沿中央静脉呈辐射状排列，形成肝细胞索。我们的结果也呈现此排列规律，提示肝细胞在共培养和水凝胶微环境下，植入至大鼠腹腔大网膜区域，可向类正常肝脏方向生长，表明我们构建的组织工程肝在体内有形成肝脏的潜力。但由于水凝胶降解过快，28 d样本已完全降解，故缺乏后期观测。
体外培养和体内植入结果的共同点在于，共培养组均比单纯肝细胞组细胞团聚生长多，肝功能表达良好，主要原因是：① 胶原水凝胶生物相容性好，免疫排斥反应小，为肝细胞生存提供了良好的结构支持。② 成纤维细胞分泌肝细胞生长因子为肝细胞提供营养支持，有效稳定了其生长状态。A组体外培养14 d时，细胞凋亡、产生碎片，肝功能表达也急剧下降。B组共培养细胞可存活至28 d，体内植入14 d和28 d还可见一些双核肝细胞，说明细胞生长状态依然旺盛。ALB染色结果也表明肝细胞在14 d和28 d能够稳定分泌白蛋 白。
体内共培养肝细胞状态明显好于体外培养的可能原因是：支架移植部位为肝脏下、靠近脾门附近，此处有较多腹腔营养物质及促肝细胞生长因子分泌；另外，肝硬化大鼠肝功能衰竭，自身修复功能也间接刺激植入的组织工程肝表达肝脏功能，刺激植入肝细胞生长旺盛。虽然可能由于植入的肝细胞数量远小于整个肝脏细胞数量，所发挥的肝脏功能并不足以修复整个肝脏，但也启发我们在后续体内植入实验时，给大鼠人为制造一些损伤，如肝切除、肝衰竭、肝硬化等，可能会刺激植入的组织工程肝肝细胞生长和功能表达。
综上述，在胶原水凝胶中共培养大鼠原代肝细胞和成纤维细胞，可以更好地模拟体内细胞微环境及细胞间的构架关系，为组织工程肝提供了更理想的细胞培养体系模型，也为构建可移植的长期存活的组织工程肝奠定了实验基础。
