引用本文： 范雪娇, 田春祥, 傅月荷, 李秀群, 邓力, 吕青. 脂肪脱细胞基质的制备和初步评价. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(3): 377-383. doi: 10.7507/1002-1892.20140084 复制
目前，临床常用的脂肪组织缺损修复方法包括自体或同种异体移植物填充，存在来源有限和免疫排斥反应等缺点。组织工程方法为脂肪组织缺损修复重建提供了新思路。目前，以脂肪组织为载体的组织工程研究主要集中在种子细胞筛选、支架材料制备、生物活性因子诱导刺激、组织工程化脂肪构建及体内移植等方面。自2001年Zuk等从脂肪组织中成功分离获得脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）以来，经过不断的探索，ADSCs已基本确定为具有多向分化潜能的MSCs，是包括脂肪组织工程在内的多种组织再生的重要细胞来源[1-5]。
目前，制约脂肪组织工程发展的关键问题之一在于选取理想的生物支架材料。其中，低免疫原性的脱细胞生物材料因具有天然特定的三维结构、富含相关活性因子等特性而备受关注。研究表明，经不同脱细胞方法获得的脂肪脱细胞基质均能基本保持组织特异性，具有诱导ADSCs成脂分化的作用[6-10]。为进一步探索更高效的人脂肪脱细胞基质制备方法，并了解其结构和功能，本实验联合反复冻融、有机溶剂抽提和酶消化法制备脂肪脱细胞基质，初步观察其组成成分和细胞相容性，为脂肪组织工程寻找合适的支架材料奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
腹壁皮下脂肪组织由四川大学华西医院接受乳腺癌根治术或乳腺癌改良根治术患者自愿捐赠。切取后将一部分置于含20 mg/mL牛血清白蛋白的无钙、镁PBS缓冲液中，冰浴2 h内进行人ADSCs（human ADSCs，hADSCs）分离培养；另一部分置于4℃PBS缓冲液中保存，用于制备脂肪脱细胞基质。
1.2 主要试剂与仪器
胰蛋白酶、异丙醇（成都科龙化工公司）；三羟甲基氨基甲烷、苯甲基磺酰氟、EDTA、Ⅰ型脱氧核糖核酸酶（deoxyribonucleaseⅠ，DNase-Ⅰ）、核糖核酸酶A（ribonuclease A，RNase A）（Sigma 公司，美国）；DMEM/F12培养基、FBS（HyClone公司，美国）；牛血清白蛋白（Roche 公司，瑞士）；钙黄绿素及碘化丙啶荧光染料、DAPI荧光染料、兔抗大鼠Ⅳ型胶原、层粘连蛋白及纤连蛋白多克隆抗体、生物素标记的山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
倒置相差荧光显微镜（Leica公司，德国）；细胞培养孵箱、-40℃冰箱（SANYO公司，日本）；DW3 真空冻干机（Heto公司，德国）；扫描电镜、偏振光显微镜（Olympus公司，日本）；激光共聚焦显微镜（Nikon公司，日本）。
1.3 脂肪脱细胞基质制备及相关检测
取脂肪组织切成0.3～0.5 cm厚组织块，无菌PBS缓冲液充分冲洗去除血液杂质，置于低渗三羟甲基氨基甲烷缓冲液（含10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷、5 mmol/L EDTA）中，-80℃冷冻、37℃水浴复温，反复冻融5次； 0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA 处理6 h，无菌PBS缓冲液冲洗30 min × 3次；异丙醇处理36 h，无菌PBS缓冲液冲洗30 min × 3次；0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA处理6 h，无菌PBS缓冲液冲洗30 min × 3次；5 ×107 U/ L DNase-Ⅰ及1 ×106 U/L RNase A处理16 h，无菌PBS缓冲液冲洗30 min × 3次；异丙醇处理8 h，无菌PBS缓冲液冲洗30 min × 3次。所有溶液均添加双抗（100 U/mL青霉素、0.1 mg/ mL链霉素），处理过程均在持续均匀搅拌下进行，-40℃过夜后置于真空冻干机24 h冻干，环氧乙烷低温消毒后密封备用。
1.3.1 大体观察
大体观察脂肪脱细胞基质形状、颜色及冻干后性状，直尺测量其厚度。
1.3.2 组织学观察
取脱细胞处理前后脂肪组织，一部分经4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，5 μm厚连续切片，行HE 染色及Masson染色，光镜观察细胞结构；行天狼猩红染色，偏振光显微镜观察胶原蛋白结构。另一部分行冰冻切片后油红O染色，光镜观察脂滴形成。
1.3.3 免疫组织化学染色观察
取1.3.2制备的石蜡切片行免疫组织化学染色，一抗为兔抗大鼠Ⅳ型胶原、纤连蛋白及层粘连蛋白多克隆抗体（工作浓度1 ∶ 200），二抗为生物素标记的山羊抗兔IgG，DAB显色，光镜下观察，以棕黄色染色为阳性表达。
1.3.4 DNA残留观察
取1.3.2制备的石蜡切片行DAPI荧光染色，倒置相差荧光显微镜观察细胞核残留情况。
1.3.5 扫描电镜观察
取脂肪脱细胞基质，以2.5%戊二醛固定、乙醇梯度脱水、乙酸异戊酯浸泡后，扫描电镜观察微结构。
1.4 hADSCs分离培养
采用酶消化法[5]分离培养hADSCs。取脂肪组织去除结缔组织和血管后，剪成约1 mm × 1 mm × 1 mm 小块。置于含1 mg/mLⅠ型胶原酶和20 mg/mL 牛血清白蛋白的克氏-林格缓冲液（pH7.4）中，37℃震荡消化30 min，添加等体积DMEM/F12培养基终止消化。静置5 min，吸弃上层成熟脂肪细胞，以离心半径13 cm、1 200 r/min离心5 min，弃含大量脂滴的上层及中间培养基层，将下层片状沉淀在DMEM/F12培养基中重悬，100目滤网过滤。以3 ×104个/cm2细胞密度接种至培养瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱培养，24 h后PBS缓冲液冲洗，除去未贴壁的细胞和细胞碎片。2～3 d更换1次完全培养基。待细胞生长至80%融合时，0.25%胰蛋白酶-0.1% EDTA消化、计数，以3 ×104 个 / cm2接种至新培养瓶，进行传代培养。
1.5 脂肪脱细胞基质的细胞相容性评价
1.5.1 细胞毒性测定
将脂肪脱细胞基质置于无血清培养基，于37℃、5%CO2孵箱中浸泡24 h 制备浸提液，调整浸提液浓度为100%、75%、50%及25%。取第3 代hADSCs按1 ×104个/孔细胞密度接种于96孔板中，完全培养基培养24 h细胞贴壁后，吸弃完全培养基，分别加入200 μL 浓度为100%、75%、50%、25%的浸提液（100%、75%、50%、25%组）作为实验组；以完全培养基培养作为阴性对照组。培养1、3、5 d，每组各取5孔，每孔加入20 μL浓度为5 g/L 的MTT，孵育4 h后加入150 μL DMSO，震荡10 min，于490 nm波长处测定吸光度（A）值。计算细胞相对增殖率（relative growth rate，RGR），RGR= 实验组A 值/ 阴性对照组A 值×100%，并对材料毒性进行分级[11]：0 级，RGR≥100%；1 级，80%≤RGR ＜ 100%；2 级，50%≤RGR ＜ 80%；3 级，30%≤RGR ＜ 50%；4 级，RGR ＜ 30%。
1.5.2 细胞黏附观察
将脂肪脱细胞基质置于含完全培养基的6孔板中，37℃、5%CO2孵箱过夜。弃完全培养基后，取200 μL第3代hADSCs以1 ×106 个 / mL 均匀接种至脂肪脱细胞基质中，继续于孵箱中培养；分别于15、30 min及1、2 h后取出，无菌PBS缓冲液终止培养。以2.5% 戊二醛固定、乙醇梯度脱水、乙酸异戊酯浸泡后，扫描电镜观察细胞在脂肪脱细胞基质上黏附情况。
1.5.3 细胞增殖观察
取1.5.2中复合培养2 h的细胞-脂肪脱细胞基质复合物，加入2 mL完全培养基，置于37 ℃、5% CO2 孵箱培养，2～3 d 换液1 次。于培养3、7、14 d，每孔加250 μL钙黄绿素（终浓度为2 μmol/ L） 和碘化丙啶（终浓度为4 μmol/ L），37℃避光孵育30 min。激光共聚焦显微镜观察，活细胞呈绿色荧光，死细胞呈红色荧光。
1.6 统计学方法
采用Microsoft Excel 2010版数据分析包进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 脂肪脱细胞基质相关检测
2.1.1 大体观察
脂肪组织脱细胞处理后基本保持原组织外形，呈乳白色，厚0.1～0.2 cm，有一定延展性（图 1 a），冻干后呈多孔泡沫状（图 1 b）。
图1
脂肪脱细胞基质大体观察 ⓐ 冻干处理前 ⓑ 冻干处理后 2.1.2 组织学观察
脱细胞处理前，HE染色示脂肪细胞膜结构完整、排列整齐，蓝染细胞核靠近细胞膜且清晰可见（图 2 a）；Masson染色示紧密排列的蓝染细胞膜及细胞外的胶原纤维结构（图 2 b）；天狼猩红染色示致密粗大的红色Ⅰ型胶原纤维，呈强折光性，纤细的绿色Ⅲ型胶原纤维与Ⅰ型胶原纤维垂直排列，呈弱折光性（图 2 c）；油红O染色示细胞内结构完整的红色脂滴和蓝染细胞核（图 2 d）。
脱细胞处理后，HE染色示脱细胞效果良好，只见红染的细胞外基质（图 3 a）；Masson染色示蓝染的细胞外胶质纤维结构（图 3 b）；天狼猩红染色示红色Ⅰ型胶原纤维及绿色Ⅲ型胶原纤维较正常组织更致密，但仍呈连续、整齐、有序排列（图 3 c）；油红O染色未见明显红染的脂质成分和蓝染细胞核（图 3 d）。
2.1.3 免疫组织化学染色观察
脱细胞处理前后脂肪组织均含层粘连蛋白、纤连蛋白及Ⅳ型胶原。见图 4、5。
2.1.4 DNA残留观察
DAPI荧光染色示，脱细胞处理前可见明显的蓝色荧光细胞核（图 6 a），脱细胞处理后未见明显阳性细胞核（图 6 b）。
图6
脱细胞处理前后脂肪组织DAPI荧光染色观察（倒置相差荧光显微镜×100） ⓐ 正常脂肪组织 ⓑ 脂肪脱细胞基质 2.1.5 扫描电镜观察
脂肪脱细胞基质中细胞彻底去除，呈现大小不一致的多孔隙结构和整齐有序而胶原纤维束交错的细胞外基质微结构。见图 7。
2.2 脂肪脱细胞基质的细胞相容性评价
2.2.1 细胞毒性测定
培养各时间点，不同浓度材料浸提液作用于细胞后RGR比较差异均无统计学意义（P＞ 0.05），毒性分级为0～1级。见表 1。
表1
不同浓度材料浸提液与细胞培养后各时间点RGR比较（n=5，%，2.2.2 细胞黏附观察
扫描电镜观察示，接种15 min后hADSCs附于脂肪脱细胞基质表面，细胞呈球形，与材料接触不紧密（图 8 a）；30 min时细胞伸出伪足，可立体贴附于材料中，细胞间通过纤维丝样突起相互连接（图 8 b）；1 h时细胞之间接触增多，接触面增大，细胞黏附材料作用增强（图 8 c）；2 h时细胞几乎紧密黏附于材料上（图 8 d）。
2.2.3 细胞增殖观察
激光共聚焦显微镜观察示，复合培养3 d可见较多活细胞，无明显死细胞（图 9 a）；7 d时细胞增殖明显，呈密集排列（图 9 b）；14 d时细胞排列较7 d时密集，出现少量死细胞（图 9 c），并均匀分散地进入脂肪脱细胞基质内部。
3 讨论
经脱细胞处理的天然细胞外基质结构材料，因保留了原组织特定的功能结构特点而成为组织工程研究的理想支架材料。目前广泛研究的脱细胞材料有小肠黏膜、膀胱、血管、心脏瓣膜、脂肪组织等细胞外基质，如何快速、有效地去除细胞内成分，并完整保留天然细胞外基质结构，是组织工程支架材料研究的关键。
3.1 脂肪脱细胞方法的选择及改进
目前，组织工程研究中常用的脱细胞处理方法包括物理机械法、化学试剂法或生物酶作用，旨在去除细胞内高抗原性的蛋白、脂质和核酸等细胞成分，避免材料引起的免疫反应和炎性反应。脱细胞处理同时需要最大限度保存细胞外基质成分，从而保持材料特定的生物学结构和功能，以利种子细胞生长，并最终形成新的生物替代组织或器官。脂肪组织中脂肪细胞超过其体积的90%[12]，细胞内脂肪酸丰富，细胞破裂后溢出的脂肪酸会严重影响脱细胞溶剂的渗透，所以对脂肪组织采用单一脱细胞方法很难快速、有效地去除细胞成分。目前脂肪组织脱细胞方法主要有反复高速离心、生物酶制剂消化、有机溶剂溶解提取细胞、阴离子表面活性剂SDS等化学试剂破坏细胞膜等，不同方法脱脂程度不一，联合多种方式已成为发展趋势[7-8, 10, 13-18]。
文献报道异丙醇脱脂效果好，但它会与胶原蛋白和黏多糖发生交联反应，改变材料表面特性[19-20]；胰蛋白酶能有效脱细胞，但也会破坏细胞外基质中的胶原蛋白和弹力蛋白，影响材料黏弹性[20-22]。材料微结构改变会影响种子细胞的黏附、增殖等细胞相容性，并且此副反应与处理时间成正相关[20, 23]。2010年Flynn[7]通过联合物理方式、化学试剂和生物酶制剂脱细胞处理得到的脂肪脱细胞基质，基本保留了细胞外基质结构及有关生物活性物质，如层粘连蛋白和Ⅳ型胶原，且能诱导ADSCs成脂分化。该方法较简便，可重复性较好，但化学试剂及生物酶处理时间较长，可能影响材料的生物相容性。研究表明，在软骨、筋膜、骨等组织工程中采用冻融技术可有效脱细胞，整个过程对细胞外基质的结构和性能无显著影响，且与冻融循环次数无明显相关性[24-27]。因此，我们在进行脂肪组织脱细胞时，提出在Flynn法3次冻融基础上增加2次冻融过程，同时将对生物相容性有影响的胰蛋白酶处理时间22 h和异丙醇处理时间56 h，分别缩短到12 h和44 h，使人脂肪组织脱细胞处理的总时间从Flynn法的5 d缩短至4 d；并且除冻融以外的所有脱细胞过程均采用低速震荡，以加速脱细胞液均匀进入组织内部。经检测脂肪脱细胞基质的组织成分和细胞相容性，提示本研究改进的脱细胞方式可行。
3.2 脱细胞效果分析
目前对脱细胞材料的检测尚无明确统一标准，我们选择对制备的脂肪脱细胞基质进行组织学和生物相容性检测，分析脱细胞效果。正常脂肪组织主要由密集的脂肪细胞和少量细胞间质构成，脂肪细胞的细胞质大部分为脂滴，油红O染色显示成片的脂肪细胞呈红色，明显较间质细胞大，蓝色细胞核挤在细胞边缘。经脱细胞前后HE染色和DAPI染色比较，表明脱细胞处理后的细胞外基质未见明显细胞核，油红O染色示去脂完全，提示脱细胞方法有效。
目前对脱脂完全与否对支架材料的影响报道不一。Brown等[6]认为即使脱脂不完全，对材料诱导成脂分化作用亦无显著影响；但Young等[16]研究证实完全脱脂有利于后续去除细胞成分。本研究结果提示完全脱脂有利于后续脱细胞试剂的渗透和 hADSCs黏附，因此我们认为在脱细胞基质制备过程中完全脱脂是重要环节。研究表明，有利于细胞黏附和定植的生物活性蛋白有层粘连蛋白、纤连蛋白等[28-30]，免疫组织化学染色观察示，本研究制备的脂肪脱细胞基质不仅富含层粘连蛋白，还保留了丰富的纤连蛋白。
主要存在于细胞基膜和血管部位的Ⅳ型胶原蛋白，可能为下一步组织工程脂肪的血管再生提供有利条件[6]。Yu等[10]采用对胶原蛋白破坏较小的淀粉酶制备脂肪脱细胞基质，该基质泡沫在大鼠体内表现出明显促血管生成作用。本研究免疫组织化学染色示，脱细胞处理后的脂肪组织仍保留了大部分Ⅳ型胶原蛋白，提示制备的材料在促进血管生成上可能具有优越性，但有待进一步研究明确。种子细胞在支架材料中的黏附、增殖等与材料孔径相关[31-32]，Masson染色和天狼猩红染色示，脂肪脱细胞基质较完整地保留了Ⅰ 型胶原和与之垂直排列的Ⅲ型胶原，并维持了脂肪组织中由密集脂肪细胞间隙内少量胶原纤维和细胞间质中稠密胶原纤维组成的微结构，有利于复合hADSCs后较均匀地进入整个材料中特定位置。扫描电镜观察示，种子细胞通过与细的胶原纤维接触而黏附于材料表面，进一步与较粗大的胶原纤维接触而更好地融入材料内部。
脂肪脱细胞基质的制备方法决定了其保留细胞外基质天然功能结构的程度，在有效脱细胞前提下，尽量减少对细胞外基质生理结构和生物活性的影响，是制备脱细胞生物材料的不断追求。本研究制备的脂肪脱细胞基质生理结构保留良好，且富含有利于细胞黏附生长的活性蛋白，细胞相容性好，有望成为脂肪组织工程支架材料。
目前，临床常用的脂肪组织缺损修复方法包括自体或同种异体移植物填充，存在来源有限和免疫排斥反应等缺点。组织工程方法为脂肪组织缺损修复重建提供了新思路。目前，以脂肪组织为载体的组织工程研究主要集中在种子细胞筛选、支架材料制备、生物活性因子诱导刺激、组织工程化脂肪构建及体内移植等方面。自2001年Zuk等从脂肪组织中成功分离获得脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）以来，经过不断的探索，ADSCs已基本确定为具有多向分化潜能的MSCs，是包括脂肪组织工程在内的多种组织再生的重要细胞来源[1-5]。
目前，制约脂肪组织工程发展的关键问题之一在于选取理想的生物支架材料。其中，低免疫原性的脱细胞生物材料因具有天然特定的三维结构、富含相关活性因子等特性而备受关注。研究表明，经不同脱细胞方法获得的脂肪脱细胞基质均能基本保持组织特异性，具有诱导ADSCs成脂分化的作用[6-10]。为进一步探索更高效的人脂肪脱细胞基质制备方法，并了解其结构和功能，本实验联合反复冻融、有机溶剂抽提和酶消化法制备脂肪脱细胞基质，初步观察其组成成分和细胞相容性，为脂肪组织工程寻找合适的支架材料奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
腹壁皮下脂肪组织由四川大学华西医院接受乳腺癌根治术或乳腺癌改良根治术患者自愿捐赠。切取后将一部分置于含20 mg/mL牛血清白蛋白的无钙、镁PBS缓冲液中，冰浴2 h内进行人ADSCs（human ADSCs，hADSCs）分离培养；另一部分置于4℃PBS缓冲液中保存，用于制备脂肪脱细胞基质。
1.2 主要试剂与仪器
胰蛋白酶、异丙醇（成都科龙化工公司）；三羟甲基氨基甲烷、苯甲基磺酰氟、EDTA、Ⅰ型脱氧核糖核酸酶（deoxyribonucleaseⅠ，DNase-Ⅰ）、核糖核酸酶A（ribonuclease A，RNase A）（Sigma 公司，美国）；DMEM/F12培养基、FBS（HyClone公司，美国）；牛血清白蛋白（Roche 公司，瑞士）；钙黄绿素及碘化丙啶荧光染料、DAPI荧光染料、兔抗大鼠Ⅳ型胶原、层粘连蛋白及纤连蛋白多克隆抗体、生物素标记的山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
倒置相差荧光显微镜（Leica公司，德国）；细胞培养孵箱、-40℃冰箱（SANYO公司，日本）；DW3 真空冻干机（Heto公司，德国）；扫描电镜、偏振光显微镜（Olympus公司，日本）；激光共聚焦显微镜（Nikon公司，日本）。
1.3 脂肪脱细胞基质制备及相关检测
取脂肪组织切成0.3～0.5 cm厚组织块，无菌PBS缓冲液充分冲洗去除血液杂质，置于低渗三羟甲基氨基甲烷缓冲液（含10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷、5 mmol/L EDTA）中，-80℃冷冻、37℃水浴复温，反复冻融5次； 0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA 处理6 h，无菌PBS缓冲液冲洗30 min × 3次；异丙醇处理36 h，无菌PBS缓冲液冲洗30 min × 3次；0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA处理6 h，无菌PBS缓冲液冲洗30 min × 3次；5 ×107 U/ L DNase-Ⅰ及1 ×106 U/L RNase A处理16 h，无菌PBS缓冲液冲洗30 min × 3次；异丙醇处理8 h，无菌PBS缓冲液冲洗30 min × 3次。所有溶液均添加双抗（100 U/mL青霉素、0.1 mg/ mL链霉素），处理过程均在持续均匀搅拌下进行，-40℃过夜后置于真空冻干机24 h冻干，环氧乙烷低温消毒后密封备用。
1.3.1 大体观察
大体观察脂肪脱细胞基质形状、颜色及冻干后性状，直尺测量其厚度。
1.3.2 组织学观察
取脱细胞处理前后脂肪组织，一部分经4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，5 μm厚连续切片，行HE 染色及Masson染色，光镜观察细胞结构；行天狼猩红染色，偏振光显微镜观察胶原蛋白结构。另一部分行冰冻切片后油红O染色，光镜观察脂滴形成。
1.3.3 免疫组织化学染色观察
取1.3.2制备的石蜡切片行免疫组织化学染色，一抗为兔抗大鼠Ⅳ型胶原、纤连蛋白及层粘连蛋白多克隆抗体（工作浓度1 ∶ 200），二抗为生物素标记的山羊抗兔IgG，DAB显色，光镜下观察，以棕黄色染色为阳性表达。
1.3.4 DNA残留观察
取1.3.2制备的石蜡切片行DAPI荧光染色，倒置相差荧光显微镜观察细胞核残留情况。
1.3.5 扫描电镜观察
取脂肪脱细胞基质，以2.5%戊二醛固定、乙醇梯度脱水、乙酸异戊酯浸泡后，扫描电镜观察微结构。
1.4 hADSCs分离培养
采用酶消化法[5]分离培养hADSCs。取脂肪组织去除结缔组织和血管后，剪成约1 mm × 1 mm × 1 mm 小块。置于含1 mg/mLⅠ型胶原酶和20 mg/mL 牛血清白蛋白的克氏-林格缓冲液（pH7.4）中，37℃震荡消化30 min，添加等体积DMEM/F12培养基终止消化。静置5 min，吸弃上层成熟脂肪细胞，以离心半径13 cm、1 200 r/min离心5 min，弃含大量脂滴的上层及中间培养基层，将下层片状沉淀在DMEM/F12培养基中重悬，100目滤网过滤。以3 ×104个/cm2细胞密度接种至培养瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱培养，24 h后PBS缓冲液冲洗，除去未贴壁的细胞和细胞碎片。2～3 d更换1次完全培养基。待细胞生长至80%融合时，0.25%胰蛋白酶-0.1% EDTA消化、计数，以3 ×104 个 / cm2接种至新培养瓶，进行传代培养。
1.5 脂肪脱细胞基质的细胞相容性评价
1.5.1 细胞毒性测定
将脂肪脱细胞基质置于无血清培养基，于37℃、5%CO2孵箱中浸泡24 h 制备浸提液，调整浸提液浓度为100%、75%、50%及25%。取第3 代hADSCs按1 ×104个/孔细胞密度接种于96孔板中，完全培养基培养24 h细胞贴壁后，吸弃完全培养基，分别加入200 μL 浓度为100%、75%、50%、25%的浸提液（100%、75%、50%、25%组）作为实验组；以完全培养基培养作为阴性对照组。培养1、3、5 d，每组各取5孔，每孔加入20 μL浓度为5 g/L 的MTT，孵育4 h后加入150 μL DMSO，震荡10 min，于490 nm波长处测定吸光度（A）值。计算细胞相对增殖率（relative growth rate，RGR），RGR= 实验组A 值/ 阴性对照组A 值×100%，并对材料毒性进行分级[11]：0 级，RGR≥100%；1 级，80%≤RGR ＜ 100%；2 级，50%≤RGR ＜ 80%；3 级，30%≤RGR ＜ 50%；4 级，RGR ＜ 30%。
1.5.2 细胞黏附观察
将脂肪脱细胞基质置于含完全培养基的6孔板中，37℃、5%CO2孵箱过夜。弃完全培养基后，取200 μL第3代hADSCs以1 ×106 个 / mL 均匀接种至脂肪脱细胞基质中，继续于孵箱中培养；分别于15、30 min及1、2 h后取出，无菌PBS缓冲液终止培养。以2.5% 戊二醛固定、乙醇梯度脱水、乙酸异戊酯浸泡后，扫描电镜观察细胞在脂肪脱细胞基质上黏附情况。
1.5.3 细胞增殖观察
取1.5.2中复合培养2 h的细胞-脂肪脱细胞基质复合物，加入2 mL完全培养基，置于37 ℃、5% CO2 孵箱培养，2～3 d 换液1 次。于培养3、7、14 d，每孔加250 μL钙黄绿素（终浓度为2 μmol/ L） 和碘化丙啶（终浓度为4 μmol/ L），37℃避光孵育30 min。激光共聚焦显微镜观察，活细胞呈绿色荧光，死细胞呈红色荧光。
1.6 统计学方法
采用Microsoft Excel 2010版数据分析包进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 脂肪脱细胞基质相关检测
2.1.1 大体观察
脂肪组织脱细胞处理后基本保持原组织外形，呈乳白色，厚0.1～0.2 cm，有一定延展性（图 1 a），冻干后呈多孔泡沫状（图 1 b）。
图1
脂肪脱细胞基质大体观察 ⓐ 冻干处理前 ⓑ 冻干处理后 2.1.2 组织学观察
脱细胞处理前，HE染色示脂肪细胞膜结构完整、排列整齐，蓝染细胞核靠近细胞膜且清晰可见（图 2 a）；Masson染色示紧密排列的蓝染细胞膜及细胞外的胶原纤维结构（图 2 b）；天狼猩红染色示致密粗大的红色Ⅰ型胶原纤维，呈强折光性，纤细的绿色Ⅲ型胶原纤维与Ⅰ型胶原纤维垂直排列，呈弱折光性（图 2 c）；油红O染色示细胞内结构完整的红色脂滴和蓝染细胞核（图 2 d）。
脱细胞处理后，HE染色示脱细胞效果良好，只见红染的细胞外基质（图 3 a）；Masson染色示蓝染的细胞外胶质纤维结构（图 3 b）；天狼猩红染色示红色Ⅰ型胶原纤维及绿色Ⅲ型胶原纤维较正常组织更致密，但仍呈连续、整齐、有序排列（图 3 c）；油红O染色未见明显红染的脂质成分和蓝染细胞核（图 3 d）。
2.1.3 免疫组织化学染色观察
脱细胞处理前后脂肪组织均含层粘连蛋白、纤连蛋白及Ⅳ型胶原。见图 4、5。
2.1.4 DNA残留观察
DAPI荧光染色示，脱细胞处理前可见明显的蓝色荧光细胞核（图 6 a），脱细胞处理后未见明显阳性细胞核（图 6 b）。
图6
脱细胞处理前后脂肪组织DAPI荧光染色观察（倒置相差荧光显微镜×100） ⓐ 正常脂肪组织 ⓑ 脂肪脱细胞基质 2.1.5 扫描电镜观察
脂肪脱细胞基质中细胞彻底去除，呈现大小不一致的多孔隙结构和整齐有序而胶原纤维束交错的细胞外基质微结构。见图 7。
2.2 脂肪脱细胞基质的细胞相容性评价
2.2.1 细胞毒性测定
培养各时间点，不同浓度材料浸提液作用于细胞后RGR比较差异均无统计学意义（P＞ 0.05），毒性分级为0～1级。见表 1。
表1
不同浓度材料浸提液与细胞培养后各时间点RGR比较（n=5，%，2.2.2 细胞黏附观察
扫描电镜观察示，接种15 min后hADSCs附于脂肪脱细胞基质表面，细胞呈球形，与材料接触不紧密（图 8 a）；30 min时细胞伸出伪足，可立体贴附于材料中，细胞间通过纤维丝样突起相互连接（图 8 b）；1 h时细胞之间接触增多，接触面增大，细胞黏附材料作用增强（图 8 c）；2 h时细胞几乎紧密黏附于材料上（图 8 d）。
2.2.3 细胞增殖观察
激光共聚焦显微镜观察示，复合培养3 d可见较多活细胞，无明显死细胞（图 9 a）；7 d时细胞增殖明显，呈密集排列（图 9 b）；14 d时细胞排列较7 d时密集，出现少量死细胞（图 9 c），并均匀分散地进入脂肪脱细胞基质内部。
3 讨论
经脱细胞处理的天然细胞外基质结构材料，因保留了原组织特定的功能结构特点而成为组织工程研究的理想支架材料。目前广泛研究的脱细胞材料有小肠黏膜、膀胱、血管、心脏瓣膜、脂肪组织等细胞外基质，如何快速、有效地去除细胞内成分，并完整保留天然细胞外基质结构，是组织工程支架材料研究的关键。
3.1 脂肪脱细胞方法的选择及改进
目前，组织工程研究中常用的脱细胞处理方法包括物理机械法、化学试剂法或生物酶作用，旨在去除细胞内高抗原性的蛋白、脂质和核酸等细胞成分，避免材料引起的免疫反应和炎性反应。脱细胞处理同时需要最大限度保存细胞外基质成分，从而保持材料特定的生物学结构和功能，以利种子细胞生长，并最终形成新的生物替代组织或器官。脂肪组织中脂肪细胞超过其体积的90%[12]，细胞内脂肪酸丰富，细胞破裂后溢出的脂肪酸会严重影响脱细胞溶剂的渗透，所以对脂肪组织采用单一脱细胞方法很难快速、有效地去除细胞成分。目前脂肪组织脱细胞方法主要有反复高速离心、生物酶制剂消化、有机溶剂溶解提取细胞、阴离子表面活性剂SDS等化学试剂破坏细胞膜等，不同方法脱脂程度不一，联合多种方式已成为发展趋势[7-8, 10, 13-18]。
文献报道异丙醇脱脂效果好，但它会与胶原蛋白和黏多糖发生交联反应，改变材料表面特性[19-20]；胰蛋白酶能有效脱细胞，但也会破坏细胞外基质中的胶原蛋白和弹力蛋白，影响材料黏弹性[20-22]。材料微结构改变会影响种子细胞的黏附、增殖等细胞相容性，并且此副反应与处理时间成正相关[20, 23]。2010年Flynn[7]通过联合物理方式、化学试剂和生物酶制剂脱细胞处理得到的脂肪脱细胞基质，基本保留了细胞外基质结构及有关生物活性物质，如层粘连蛋白和Ⅳ型胶原，且能诱导ADSCs成脂分化。该方法较简便，可重复性较好，但化学试剂及生物酶处理时间较长，可能影响材料的生物相容性。研究表明，在软骨、筋膜、骨等组织工程中采用冻融技术可有效脱细胞，整个过程对细胞外基质的结构和性能无显著影响，且与冻融循环次数无明显相关性[24-27]。因此，我们在进行脂肪组织脱细胞时，提出在Flynn法3次冻融基础上增加2次冻融过程，同时将对生物相容性有影响的胰蛋白酶处理时间22 h和异丙醇处理时间56 h，分别缩短到12 h和44 h，使人脂肪组织脱细胞处理的总时间从Flynn法的5 d缩短至4 d；并且除冻融以外的所有脱细胞过程均采用低速震荡，以加速脱细胞液均匀进入组织内部。经检测脂肪脱细胞基质的组织成分和细胞相容性，提示本研究改进的脱细胞方式可行。
3.2 脱细胞效果分析
目前对脱细胞材料的检测尚无明确统一标准，我们选择对制备的脂肪脱细胞基质进行组织学和生物相容性检测，分析脱细胞效果。正常脂肪组织主要由密集的脂肪细胞和少量细胞间质构成，脂肪细胞的细胞质大部分为脂滴，油红O染色显示成片的脂肪细胞呈红色，明显较间质细胞大，蓝色细胞核挤在细胞边缘。经脱细胞前后HE染色和DAPI染色比较，表明脱细胞处理后的细胞外基质未见明显细胞核，油红O染色示去脂完全，提示脱细胞方法有效。
目前对脱脂完全与否对支架材料的影响报道不一。Brown等[6]认为即使脱脂不完全，对材料诱导成脂分化作用亦无显著影响；但Young等[16]研究证实完全脱脂有利于后续去除细胞成分。本研究结果提示完全脱脂有利于后续脱细胞试剂的渗透和 hADSCs黏附，因此我们认为在脱细胞基质制备过程中完全脱脂是重要环节。研究表明，有利于细胞黏附和定植的生物活性蛋白有层粘连蛋白、纤连蛋白等[28-30]，免疫组织化学染色观察示，本研究制备的脂肪脱细胞基质不仅富含层粘连蛋白，还保留了丰富的纤连蛋白。
主要存在于细胞基膜和血管部位的Ⅳ型胶原蛋白，可能为下一步组织工程脂肪的血管再生提供有利条件[6]。Yu等[10]采用对胶原蛋白破坏较小的淀粉酶制备脂肪脱细胞基质，该基质泡沫在大鼠体内表现出明显促血管生成作用。本研究免疫组织化学染色示，脱细胞处理后的脂肪组织仍保留了大部分Ⅳ型胶原蛋白，提示制备的材料在促进血管生成上可能具有优越性，但有待进一步研究明确。种子细胞在支架材料中的黏附、增殖等与材料孔径相关[31-32]，Masson染色和天狼猩红染色示，脂肪脱细胞基质较完整地保留了Ⅰ 型胶原和与之垂直排列的Ⅲ型胶原，并维持了脂肪组织中由密集脂肪细胞间隙内少量胶原纤维和细胞间质中稠密胶原纤维组成的微结构，有利于复合hADSCs后较均匀地进入整个材料中特定位置。扫描电镜观察示，种子细胞通过与细的胶原纤维接触而黏附于材料表面，进一步与较粗大的胶原纤维接触而更好地融入材料内部。
脂肪脱细胞基质的制备方法决定了其保留细胞外基质天然功能结构的程度，在有效脱细胞前提下，尽量减少对细胞外基质生理结构和生物活性的影响，是制备脱细胞生物材料的不断追求。本研究制备的脂肪脱细胞基质生理结构保留良好，且富含有利于细胞黏附生长的活性蛋白，细胞相容性好，有望成为脂肪组织工程支架材料。
