引用本文： 张苍宇, 王栓科, 任广铁, 拓振合, 庾佳佳, 汪静, 安丽萍, 马婧琳, 赵琳. 组织工程骨膜同种异体体内成骨修复兔肩胛骨缺损的初步研究. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(3): 384-388. doi: 10.7507/1002-1892.20140085 复制
因创伤、骨病及肿瘤切除后引起的骨缺损修复是临床难题。组织工程为再生修复骨缺损提供了新思路和方法，但骨组织工程研究目前仍存在难以真正仿生骨组织天然结构及其微血管系统等问题，尤其缺乏大段、不规则骨缺损修复方面的突破性研究进展[1]。骨组织的形成分为软骨内化骨和膜内化骨（骨膜成骨）[2]。在成体骨折愈合过程中，骨膜可通过膜内化骨自发成骨，这为骨缺损通过骨膜成骨再生修复提供了一种新思路[3-4]。用骨膜修复骨缺损的可行性已被大量实验证实[5-6]，但因其来源有限，且存在抗原性问题，只能自体应用而不能同种异体应用，限制了其临床发展[7]。同时，目前罕见构建组织工程骨膜，并以其同种异体体内成骨修复大块骨缺损的研究报道。我们前期研究成功制备了组织工程骨膜，并模拟膜内化骨成骨模式修复同种异体兔长骨临界骨缺损，表明在理论上膜状组织工程骨膜修复大块骨缺损可行[8]。在此基础上，本次研究以猪小肠黏膜下层（small intestinal submucosa，SIS）为支架，复合兔BMSCs构建组织工程骨膜，并在同种异体体内成骨修复兔肩胛骨缺损，探讨组织工程骨膜修复大块骨缺损的可行性，为临床开发可修复各种骨缺损的人工骨膜产品奠定研究基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
2周～1月龄清洁级新西兰大白兔6只，体重约150 g，雌雄不限；6月龄普通级新西兰大白兔18只，体重2.5～3.0 kg，雌雄不限；均由兰州大学医学院动物房提供。经过检疫的健康成年猪屠宰4 h内的新鲜近端空肠，由兰州肉联厂提供。
Percoll分离液（深圳达科为生物技术有限公司）；L/H-DMEM、FBS（HyClone公司，美国）；地塞米松、维生素C、β-磷酸甘油钠、胰蛋白酶、EDTA-2Na（AmreSCO公司，美国）；PBS（北京中杉金桥生物技术有限公司）。CKX3倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；低温冰箱（SANYO公司，日本）；6孔板、96孔板（上海普飞生物技术有限公司）； JSM-6380LV扫描电镜（JEOL公司，日本）；5810台式高速冷冻离心机（Eppendorf公司，德国）。
1.2 兔BMSCs分离、培养及成骨诱导
取2周～1月龄新西兰大白兔，根据文献[9]方法分离培养BMSCs。取原代BMSCs，用成骨诱导培养液[10]（含0.1 μmol/ L地塞米松、50 μg/L维生素C、10 mmol/L β-磷酸甘油钠及10%FBS的H-DMEM）诱导培养，倒置相差显微镜下见细胞长满90%后，用0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA消化2～3 min后继续传代培养[11]。倒置相差显微镜观察细胞形态、贴附及增殖情况。
1.3 SIS的制备
按Abraham等[12]的方法制备SIS。取猪近端空肠，40℃水持续冲洗，清除小肠内外壁黏附物质，挑选管腔粗细均匀、管壁无破损及淋巴结的部分，用裹有纱布的刀柄刮除小肠浆膜层和肌层，室温下行脱细胞和消毒灭菌处理，冻干后切成3 cm × 3 cm大小，无菌袋包装，γ射线照射消毒，备用。扫描电镜观察SIS微观结构。
1.4 组织工程骨膜构建及观察
复合培养前将6孔板置于紫外灯下照射40 min；从- 80℃冰箱中取出SIS，无菌条件下按6孔板孔径大小剪取SIS，单层铺满孔底；紫外灯下照射30 min后，每孔加入适量FBS，将SIS润湿；置于37℃、5%CO2及饱和湿度孵箱中过夜。取成骨诱导后的第3代细胞，胰蛋白酶消化后调整细胞浓度为2.0 ×105个 / mL，用沉淀法将细胞悬液加入预孵过夜的SIS上（200 μL/ 孔），于37℃、5%CO2及饱和湿度孵箱中培养4～6 h，加成骨诱导培养液3～5 mL，于相同孵育条件继续培养。分别于诱导培养3、5、7、11 d取出组织工程骨膜，扫描电镜观察BMSCs在SIS上的附着、生长、分裂及增殖情况。
1.5 兔肩胛骨缺损模型制备及实验分组
取6月龄新西兰大白兔18只，3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，右侧肩胛骨区域备皮，侧卧位固定。顺肩胛冈方向作纵形切口，逐层暴露肩胛骨，自肩胛颈处切除整块肩胛骨及其骨膜（留取关节盂和部分肩胛颈以备与肱骨头形成关节，术后不明显影响动物活动并便于固定组织工程骨膜），制备约大小3 cm × 3 cm肩胛骨次全切、不规则骨缺损模型。
造模后将动物随机分为两组，每组9只。实验组于骨缺损区植入与肩胛骨大小、形状基本一致的组织工程骨膜，对照组植入相同大小的SIS。植入物边缘与四周肌肉、筋膜及锁骨、残余肩胛颈等以丝线缝合固定，使其张紧保持肩胛骨的三角形状。术后逐层缝合切口，黑色丝线“十”字标记植入手术区，以“人”字石膏固定伤肢（石膏开槽以便换药及观察）。术后动物分笼饲养，肌肉注射青霉素（30万U/d），连续3 d；4周拆除石膏。
1.6 观测指标
1.6.1 一般情况
观察术后动物饮食、行为；切口有无红肿、异常渗出；拆除石膏后患肢负重行走情况 等。
1.6.2 大体观察
术后8周将动物以空气栓塞法处死，原手术入路观察新生骨表面、骨缺损修复情况及周围组织反应情况。
1.6.3 X线片观察
术后8周处死动物后，采用DR数字正位X线片检查，投射部位为肩胛骨，投照距离为100 cm；投射条件：50 kV，4 mA/s。观察两组骨缺损修复情况，并根据Lane-Sandhu X 线片评分标准[13]评分。
1.6.4 组织学观察
X线片观察后，按标记丝线找到手术区，切除骨缺损区组织并随机选取5个测试点组织作为标本，以4%甲醛固定3 d，标本常规脱钙、脱水、包埋、切片，厚约30 μm，行HE及Masson染色观察。
1.7 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 BMSCs形态观察
倒置相差显微镜下观察示，原代细胞形态呈长梭形（图 1 a）；经成骨诱导传至第3代后，部分细胞由梭形变为多角形和立方形，体积变大（图 1 b）。
图1
倒置相差显微镜观察BMSCs形态变化 ⓐ 原代细胞培养3 d（× 40） ⓑ 成骨诱导传至第3代细胞（×100） 2.2 SIS及组织工程骨膜扫描电镜观察
单纯SIS主要结构为单一的平行于小肠长轴的纤维，偶有与长轴交错的纤维（图 2 a）。组织工程骨膜成骨诱导培养3 d时，BMSCs细胞间连接少；培养5 d，部分细胞变形，细胞间连接增多；培养7 d后细胞变形明显，胞体表面有大量突起，微丝形成并附着于材料表面，部分细胞相连接，有些细胞进入材料孔隙；培养11 d后细胞形状更不规则，大量细胞相互连接，胞体向外突出铺满材料表面，部分细胞重叠生长（图 2 b）。
2.3 一般情况
两组动物术后饮食及日常行为基本正常；切口无红肿、渗液等。术后4周拆除石膏后，伤肢基本能负重行走。
2.4 大体观察
术后8周，实验组标本外骨痂增多但生长紊乱，将材料部分包裹，可见植入材料大部分已降解，两端桥接部已形成骨性愈合，部分骨缺损区已被新生骨填充（图 3 a）；对照组骨缺损中央被软组织填充，无骨组织形成（图 3 b）。
2.5 X线片观察
术后8周，实验组植入物两断端模糊，骨缺损处密度与正常骨相似，呈斑片状阴影，新生骨与自体残留骨边缘连接（图 4 a），外骨痂增多但生长紊乱，未形成完整骨组织。对照组骨缺损中央区域无骨形成征象，密度与周围软组织影相似（图 4 b）。根据Lane-Sandhu X线片评分标准[13]，实验组为（6.67 ± 0.32）分，对照组为（0.32 ± 0.04）分，两组比较差异有统计学意义（t=19.871，P=0.001）。
2.6 组织学观察
术后8周，HE染色示实验组骨缺损区可见大量新骨形成，骨细胞丰富，毛细血管及骨陷窝多见，骨髓腔不规则，未见明显淋巴细胞及巨噬细胞浸润（图 5 a）；对照组骨缺损区仅见胶原瘢痕组织形成（图 5 b）。Masson染色示实验组骨缺损区为大量均质蓝染组织，与自体残留骨染色颜色不同，提示有新骨形成（图 6 a）；对照组为疏松纤维结缔组织，无骨组织形成（图 6 b）。
3 讨论
目前有关骨缺损修复的动物模型报道较多，但大多仅限于临界骨缺损的修复[14-15]。而在临床实践中，骨缺损往往是呈不规则形状和大小，因此现有研究与临床实践仍有较大距离，这正是本研究的切入点，也是亟待解决的问题。
肩胛骨由扁骨（肩胛体）、不规则骨及诸多突体（肩胛骨、肩胛颈、喙突、肩峰）组成，能较好代表各种不规则骨[16]，同时其位置表浅、易于整块切除和进行修复手术。此外，我们在制备尽可能接近临床整块骨缺损模型的同时，考虑到人工骨膜的固定及术后动物活动问题，注意了实验动物的创伤承受程度、活动影响、实验实际可操作性和可行性，制备了兔肩胛骨次全切模型。
BMSCs具有很强的自我更新和高度增殖能力，在不同诱导条件下，可分化为骨、软骨、脂肪组织和肌肉等间质组织，且具有免疫排斥反应小及不受伦理限制等优点[17]，是组织工程研究理想种子细胞。SIS是由猪空肠黏膜下层组织经脱细胞等一系列生物及理化处理后制备的一种膜状材料，是一种天然细胞外基质，具有良好的组织相容性及低免疫原性[18]。本研究将经成骨诱导的BMSCs与SIS复合构建组织工程骨膜，既含有成骨细胞，又含有骨膜具有的胶原成分和生长因子，实现了生理意义上的仿生骨膜构建。将其植入同种异体兔体内后，以期通过膜内化骨的方式修复肩胛骨缺 损。
目前，限制骨组织工程研究的主要问题是组织工程内植物中细胞的成活及工程组织的血管化[19-20]。在体内，组织液通过弥散渗透能为细胞提供营养的组织厚度不超过0.5 mm，提示大块支架材料中的细胞植入体内后成活困难，降低了采用三维立体支架构建大块骨组织的可行性[21]。本实验所选择的支架材料为种间低免疫原性的生物衍生材料SIS，厚度约100 μm，因此其表面及空隙内黏附的细胞均可通过弥散渗透方式从组织液中获得营养，随着体内骨组织的再生，机体会再生出新的血管系统，支架材料也同步降解，其释放的VEGF也可促进血管化过程[22]。我们前期研究也表明组织工程骨膜在修复骨缺损的同时再生出了完备的血管系统[14-15]。本实验结果显示：随着时间延长，植入组织工程骨膜的缺损部位形成新生骨组织，并以爬行方式逐渐覆盖骨缺损；同时，在体外难以构建的骨组织微血管系统也随新骨组织形成而形成。而对照组未见骨缺损修复征象。
综上述，用组织工程骨膜修复兔肩胛骨次全切骨缺损是可行的，为临床实践中修复各种原因造成的大块不规则骨缺损奠定了理论基础。但本研究存在无空白对照组、缺乏成骨定量评价指标等不足，影响了研究的科学性，尚需在下一步实验中改进。
因创伤、骨病及肿瘤切除后引起的骨缺损修复是临床难题。组织工程为再生修复骨缺损提供了新思路和方法，但骨组织工程研究目前仍存在难以真正仿生骨组织天然结构及其微血管系统等问题，尤其缺乏大段、不规则骨缺损修复方面的突破性研究进展[1]。骨组织的形成分为软骨内化骨和膜内化骨（骨膜成骨）[2]。在成体骨折愈合过程中，骨膜可通过膜内化骨自发成骨，这为骨缺损通过骨膜成骨再生修复提供了一种新思路[3-4]。用骨膜修复骨缺损的可行性已被大量实验证实[5-6]，但因其来源有限，且存在抗原性问题，只能自体应用而不能同种异体应用，限制了其临床发展[7]。同时，目前罕见构建组织工程骨膜，并以其同种异体体内成骨修复大块骨缺损的研究报道。我们前期研究成功制备了组织工程骨膜，并模拟膜内化骨成骨模式修复同种异体兔长骨临界骨缺损，表明在理论上膜状组织工程骨膜修复大块骨缺损可行[8]。在此基础上，本次研究以猪小肠黏膜下层（small intestinal submucosa，SIS）为支架，复合兔BMSCs构建组织工程骨膜，并在同种异体体内成骨修复兔肩胛骨缺损，探讨组织工程骨膜修复大块骨缺损的可行性，为临床开发可修复各种骨缺损的人工骨膜产品奠定研究基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
2周～1月龄清洁级新西兰大白兔6只，体重约150 g，雌雄不限；6月龄普通级新西兰大白兔18只，体重2.5～3.0 kg，雌雄不限；均由兰州大学医学院动物房提供。经过检疫的健康成年猪屠宰4 h内的新鲜近端空肠，由兰州肉联厂提供。
Percoll分离液（深圳达科为生物技术有限公司）；L/H-DMEM、FBS（HyClone公司，美国）；地塞米松、维生素C、β-磷酸甘油钠、胰蛋白酶、EDTA-2Na（AmreSCO公司，美国）；PBS（北京中杉金桥生物技术有限公司）。CKX3倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；低温冰箱（SANYO公司，日本）；6孔板、96孔板（上海普飞生物技术有限公司）； JSM-6380LV扫描电镜（JEOL公司，日本）；5810台式高速冷冻离心机（Eppendorf公司，德国）。
1.2 兔BMSCs分离、培养及成骨诱导
取2周～1月龄新西兰大白兔，根据文献[9]方法分离培养BMSCs。取原代BMSCs，用成骨诱导培养液[10]（含0.1 μmol/ L地塞米松、50 μg/L维生素C、10 mmol/L β-磷酸甘油钠及10%FBS的H-DMEM）诱导培养，倒置相差显微镜下见细胞长满90%后，用0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA消化2～3 min后继续传代培养[11]。倒置相差显微镜观察细胞形态、贴附及增殖情况。
1.3 SIS的制备
按Abraham等[12]的方法制备SIS。取猪近端空肠，40℃水持续冲洗，清除小肠内外壁黏附物质，挑选管腔粗细均匀、管壁无破损及淋巴结的部分，用裹有纱布的刀柄刮除小肠浆膜层和肌层，室温下行脱细胞和消毒灭菌处理，冻干后切成3 cm × 3 cm大小，无菌袋包装，γ射线照射消毒，备用。扫描电镜观察SIS微观结构。
1.4 组织工程骨膜构建及观察
复合培养前将6孔板置于紫外灯下照射40 min；从- 80℃冰箱中取出SIS，无菌条件下按6孔板孔径大小剪取SIS，单层铺满孔底；紫外灯下照射30 min后，每孔加入适量FBS，将SIS润湿；置于37℃、5%CO2及饱和湿度孵箱中过夜。取成骨诱导后的第3代细胞，胰蛋白酶消化后调整细胞浓度为2.0 ×105个 / mL，用沉淀法将细胞悬液加入预孵过夜的SIS上（200 μL/ 孔），于37℃、5%CO2及饱和湿度孵箱中培养4～6 h，加成骨诱导培养液3～5 mL，于相同孵育条件继续培养。分别于诱导培养3、5、7、11 d取出组织工程骨膜，扫描电镜观察BMSCs在SIS上的附着、生长、分裂及增殖情况。
1.5 兔肩胛骨缺损模型制备及实验分组
取6月龄新西兰大白兔18只，3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，右侧肩胛骨区域备皮，侧卧位固定。顺肩胛冈方向作纵形切口，逐层暴露肩胛骨，自肩胛颈处切除整块肩胛骨及其骨膜（留取关节盂和部分肩胛颈以备与肱骨头形成关节，术后不明显影响动物活动并便于固定组织工程骨膜），制备约大小3 cm × 3 cm肩胛骨次全切、不规则骨缺损模型。
造模后将动物随机分为两组，每组9只。实验组于骨缺损区植入与肩胛骨大小、形状基本一致的组织工程骨膜，对照组植入相同大小的SIS。植入物边缘与四周肌肉、筋膜及锁骨、残余肩胛颈等以丝线缝合固定，使其张紧保持肩胛骨的三角形状。术后逐层缝合切口，黑色丝线“十”字标记植入手术区，以“人”字石膏固定伤肢（石膏开槽以便换药及观察）。术后动物分笼饲养，肌肉注射青霉素（30万U/d），连续3 d；4周拆除石膏。
1.6 观测指标
1.6.1 一般情况
观察术后动物饮食、行为；切口有无红肿、异常渗出；拆除石膏后患肢负重行走情况 等。
1.6.2 大体观察
术后8周将动物以空气栓塞法处死，原手术入路观察新生骨表面、骨缺损修复情况及周围组织反应情况。
1.6.3 X线片观察
术后8周处死动物后，采用DR数字正位X线片检查，投射部位为肩胛骨，投照距离为100 cm；投射条件：50 kV，4 mA/s。观察两组骨缺损修复情况，并根据Lane-Sandhu X 线片评分标准[13]评分。
1.6.4 组织学观察
X线片观察后，按标记丝线找到手术区，切除骨缺损区组织并随机选取5个测试点组织作为标本，以4%甲醛固定3 d，标本常规脱钙、脱水、包埋、切片，厚约30 μm，行HE及Masson染色观察。
1.7 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 BMSCs形态观察
倒置相差显微镜下观察示，原代细胞形态呈长梭形（图 1 a）；经成骨诱导传至第3代后，部分细胞由梭形变为多角形和立方形，体积变大（图 1 b）。
图1
倒置相差显微镜观察BMSCs形态变化 ⓐ 原代细胞培养3 d（× 40） ⓑ 成骨诱导传至第3代细胞（×100） 2.2 SIS及组织工程骨膜扫描电镜观察
单纯SIS主要结构为单一的平行于小肠长轴的纤维，偶有与长轴交错的纤维（图 2 a）。组织工程骨膜成骨诱导培养3 d时，BMSCs细胞间连接少；培养5 d，部分细胞变形，细胞间连接增多；培养7 d后细胞变形明显，胞体表面有大量突起，微丝形成并附着于材料表面，部分细胞相连接，有些细胞进入材料孔隙；培养11 d后细胞形状更不规则，大量细胞相互连接，胞体向外突出铺满材料表面，部分细胞重叠生长（图 2 b）。
2.3 一般情况
两组动物术后饮食及日常行为基本正常；切口无红肿、渗液等。术后4周拆除石膏后，伤肢基本能负重行走。
2.4 大体观察
术后8周，实验组标本外骨痂增多但生长紊乱，将材料部分包裹，可见植入材料大部分已降解，两端桥接部已形成骨性愈合，部分骨缺损区已被新生骨填充（图 3 a）；对照组骨缺损中央被软组织填充，无骨组织形成（图 3 b）。
2.5 X线片观察
术后8周，实验组植入物两断端模糊，骨缺损处密度与正常骨相似，呈斑片状阴影，新生骨与自体残留骨边缘连接（图 4 a），外骨痂增多但生长紊乱，未形成完整骨组织。对照组骨缺损中央区域无骨形成征象，密度与周围软组织影相似（图 4 b）。根据Lane-Sandhu X线片评分标准[13]，实验组为（6.67 ± 0.32）分，对照组为（0.32 ± 0.04）分，两组比较差异有统计学意义（t=19.871，P=0.001）。
2.6 组织学观察
术后8周，HE染色示实验组骨缺损区可见大量新骨形成，骨细胞丰富，毛细血管及骨陷窝多见，骨髓腔不规则，未见明显淋巴细胞及巨噬细胞浸润（图 5 a）；对照组骨缺损区仅见胶原瘢痕组织形成（图 5 b）。Masson染色示实验组骨缺损区为大量均质蓝染组织，与自体残留骨染色颜色不同，提示有新骨形成（图 6 a）；对照组为疏松纤维结缔组织，无骨组织形成（图 6 b）。
3 讨论
目前有关骨缺损修复的动物模型报道较多，但大多仅限于临界骨缺损的修复[14-15]。而在临床实践中，骨缺损往往是呈不规则形状和大小，因此现有研究与临床实践仍有较大距离，这正是本研究的切入点，也是亟待解决的问题。
肩胛骨由扁骨（肩胛体）、不规则骨及诸多突体（肩胛骨、肩胛颈、喙突、肩峰）组成，能较好代表各种不规则骨[16]，同时其位置表浅、易于整块切除和进行修复手术。此外，我们在制备尽可能接近临床整块骨缺损模型的同时，考虑到人工骨膜的固定及术后动物活动问题，注意了实验动物的创伤承受程度、活动影响、实验实际可操作性和可行性，制备了兔肩胛骨次全切模型。
BMSCs具有很强的自我更新和高度增殖能力，在不同诱导条件下，可分化为骨、软骨、脂肪组织和肌肉等间质组织，且具有免疫排斥反应小及不受伦理限制等优点[17]，是组织工程研究理想种子细胞。SIS是由猪空肠黏膜下层组织经脱细胞等一系列生物及理化处理后制备的一种膜状材料，是一种天然细胞外基质，具有良好的组织相容性及低免疫原性[18]。本研究将经成骨诱导的BMSCs与SIS复合构建组织工程骨膜，既含有成骨细胞，又含有骨膜具有的胶原成分和生长因子，实现了生理意义上的仿生骨膜构建。将其植入同种异体兔体内后，以期通过膜内化骨的方式修复肩胛骨缺 损。
目前，限制骨组织工程研究的主要问题是组织工程内植物中细胞的成活及工程组织的血管化[19-20]。在体内，组织液通过弥散渗透能为细胞提供营养的组织厚度不超过0.5 mm，提示大块支架材料中的细胞植入体内后成活困难，降低了采用三维立体支架构建大块骨组织的可行性[21]。本实验所选择的支架材料为种间低免疫原性的生物衍生材料SIS，厚度约100 μm，因此其表面及空隙内黏附的细胞均可通过弥散渗透方式从组织液中获得营养，随着体内骨组织的再生，机体会再生出新的血管系统，支架材料也同步降解，其释放的VEGF也可促进血管化过程[22]。我们前期研究也表明组织工程骨膜在修复骨缺损的同时再生出了完备的血管系统[14-15]。本实验结果显示：随着时间延长，植入组织工程骨膜的缺损部位形成新生骨组织，并以爬行方式逐渐覆盖骨缺损；同时，在体外难以构建的骨组织微血管系统也随新骨组织形成而形成。而对照组未见骨缺损修复征象。
综上述，用组织工程骨膜修复兔肩胛骨次全切骨缺损是可行的，为临床实践中修复各种原因造成的大块不规则骨缺损奠定了理论基础。但本研究存在无空白对照组、缺乏成骨定量评价指标等不足，影响了研究的科学性，尚需在下一步实验中改进。
