引用本文： 张复文, 刘德宝, 王刚, 任振华. 微骨折技术联合IGF-1修复兔关节软骨缺损的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(5): 591-596. doi: 10.7507/1002-1892.20140132 复制
关节软骨缺损是膝关节常见损伤类型，因软骨愈合能力有限，难以自行修复[1]。传统的理疗、药物治疗和外科手术均不能实现关节软骨修复，因此关节软骨缺损修复成为近年研究热点[2]。微骨折技术是在骨面钻孔使含有MSCs的骨髓血渗出修复软骨，目前已广泛用于治疗膝、髋、肘及肩关节等软骨缺损修复[3-5]。但由于新生成的是纤维软骨而非透明软骨，该技术也不能完全修复损伤软骨[6]。有研究表明，生长因子在软骨缺损修复中发挥了重要作用[7-9]，其中IGF-1参与了软骨细胞的增殖和分化。为此，本研究采用微骨折技术联合IGF-1修复兔股骨髁全层创伤性关节软骨缺损，观察修复效果，以期为临床关节软骨缺损修复提供一种新方法。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
4～6 月龄健康新西兰大白兔26只，体重2.5～ 3.5 kg，雌雄不限，由安徽医科大学实验动物中心提供。重组人IGF-1（recombinant human IGF-1，rhIGF-1）、鼠抗人Ⅱ型胶原单克隆抗体（Roche 公司，美国）；鼠/兔通用型SP免疫组织化学检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；羟脯氨酸（hydroxyproline，HPR；上海泛美生物技术有限公司）。透射电镜、扫描电镜（日本电子株氏会社）。
1.2 实验分组及方法
取24只大白兔随机分为4组（n=6）：微骨折技术联合rhIGF-1组（A 组）、微骨折技术对照组（B 组）、rhIGF-1对照组（C 组）和空白对照组（D 组）。各组大白兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（1 mL/kg）麻醉后，于双后肢膝关节内侧作长约3 cm切口，选择髌股关节股骨侧关节面中心，用手术刀片制备8 mm × 6 mm全层关节软骨缺损，深度以点状出血为标准（图 1 a）。 关节软骨缺损模型制备后，A、B 组用1 mm 克氏针在软骨缺损区钻孔，造成软骨下微骨折，横向3 孔、纵向5 孔，孔间距基本相等，深度以有骨髓血渗出为标准（约0.7 cm），关闭切口（图 1 b）。C、D组不作处理，直接拉拢缝合切口。术后各组动物均单笼饲养，活动不限，常规预防性应用抗生素。A、C 组术后每侧关节腔内注射0.1 mL rhIGF-1（0.01 μg/μL），每周3次，连续4周；B、D 组对应时间点关节腔内注射等量生理盐水。
图1
动物模型制备示意图 ⓐ 关节软骨缺损（箭头） ⓑ 微骨折手术箭头示钻孔 术后4、12、24 周，各组各取2只动物采用空气栓塞法处死，原切口入路取材进行以下观测。
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
观察实验动物术后存活、手术切口愈合及后肢活动情况。
1.3.2 大体观察
各时间点观察膝关节有无挛缩、粘连和新生物，有无滑液增多、软骨侵蚀、软骨赘或骨赘等关节病变，以及修复组织的平整性、光泽度、厚度及其与周围组织的结合情况。
1.3.3 组织学观察
各时间点取修复组织，置于10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，0.4 μm厚切片，常规行HE 染色、甲苯胺蓝染色、番红 O染色和Van Gieson染色。光镜下观察软骨细胞形态和排列情况，以及细胞外基质蛋白多糖和胶原生成情况。综合以上染色结果，按照Wakitani 等[10]评分标准进行组织学评分。
1.3.4 免疫组织化学染色观察
取1.3.3中制备的各组术后24周石蜡切片，脱蜡水化，微波修复，H2O2阻断，羊血清封闭，加入一抗（鼠抗人Ⅱ型胶原单克隆抗体），4℃过夜，加入二抗（链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液），DAB 显色，脱水透明，树胶封片。光镜下观察修复组织中的Ⅱ型胶原染色情况。
1.3.5 电镜观察
术后24 周，取A、B 组修复组织，切成1 mm × 1 mm × 1 mm的小块，加入1.5%多聚甲醛-戊二醛混合液，4℃下固定6 h，PBS浸泡3 h × 3 次，梯度乙醇脱水，环氧丙烷和环氧树脂包埋，置于烤箱60℃48 h，70 nm厚超薄切片，5%醋酸双氧铀染色5 min，双蒸水冲洗，枸橼酸铅染色5 min，双蒸水冲洗。透射电镜下观察软骨细胞的超微结构及细胞外胶原分泌情况。
取A、B 组修复组织，切成2 mm × 1 mm × 1 mm的小块，加入1.5%多聚甲醛-戊二醛混合液，4℃下固定6 h，PBS冲洗3次，冻干脱水，镀导电膜，扫描电镜观察其软骨面平整性及软骨陷窝分布情况。
1.3.6 胶原含量测定
术后24周，采用改良HPR法测定各组修复组织和正常兔后肢膝关节软骨的胶原含量。取各组修复组织和剩余2只正常兔后肢膝关节软骨切成0.4 μm薄片，按顺序加入丙酮和乙醚脱脂。剪碎软骨，置于50℃恒温箱中干燥4 h，用三氯醋酸提取胶原，提取液置于烤箱中120℃蒸干，加入6 mol/L HCl溶液，充分溶解后，120℃水浴中10 h，加蒸馏水振荡稀释，配成待测样品。参照文献[11]方法测定HPR：取待测样品1 mL，氧化显色，调节波长至560 nm，测量吸光度（A）值。以HPR 标准品作标准曲线，按以下公式计算胶原含量，胶原含量百分比=样品HPR浓度/组织质量（g）× 7.46 ×100%；样品HPR浓度=标准HPR浓度×所测样品A值/标准HPR浓度A值。
1.4 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
各组动物均存活至实验完成，切口愈合良好。术后24 h，各组动物一般状态较差，后肢无活动，少量进食、饮水；2 d，各组动物活动较前增加，饮水、进食已基本接近正常，后肢活动受限；4周，A组动物后肢活动基本恢复正常，B、C、D组仍有一定程度受限；A、B组动物12周时后肢活动已基本正常，但C、D组部分动物24周时后肢活动仍受限。
2.2 大体观察
术后各时间点各组动物膝关节均无挛缩、粘连和新生物，无滑液增多、滑膜肥厚、软骨侵蚀及软骨赘、骨赘形成等骨关节病变。
术后4周，各组软骨区均有不同程度白色修复组织生成。A 组修复组织大部分区域表面较平整，有光泽及弹性，但未达正常软骨厚度，与正常软骨界线模糊；B 组修复组织部分区域较平整，有一定光泽，但厚度及弹性较A组差，可见与正常软骨界线；C、D 组修复组织均不平整，无光泽，与正常软骨界线清晰。
术后12周，A 组修复组织平整，有光泽，已完全充填缺损区，与正常软骨界线消失；B 组修复组织部分区域平整，有光泽，厚度较邻近正常软骨组织薄，弹性差，与正常软骨界线模糊；C、D 组修复组织不平整，呈白色，无光泽，无明显弹性，与正常软骨界线清晰。
术后24周，A 组观察情况与12周时一致；B组修复组织较平整，部分有光泽，呈白色，有弹性，与正常软骨界线模糊；C、D 组修复组织不平整，呈白色，无光泽，弹性差，修复组织未填满缺损区，与正常软骨界线清晰。见图 2。
2.3 组织学观察
2.3.1 镜下观察
术后4周，A 组见大量圆形、椭圆形细胞及类软骨细胞；B 组见少量椭圆形细胞，大量小梭形细胞，细胞核深染；C、D 组均为无序纤维组织。
术后12、24周，A 组见软骨细胞增生明显，位于陷窝，分化良好，排列较规则，其形态、分化排列与正常软骨细胞难以区分；基质较多，修复的软骨形态与正常关节软骨形态相似，与周围软骨结合紧密；修复组织含有大量基质和胶原纤维。B 组见大量梭形纤维细胞，并含有较多椭圆形类软骨细胞；与A 组相比，基质染色程度浅，胶原和蛋白多糖少。C、D 组为无序纤维组织，见少许小梭形纤维细胞，基质染色浅。见图 3～6。
图5
术后24周各组番红O染色观察（× 400） ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 ⓓ D组 2.3.2 组织学评分
按照Wakitani 等[10]评分标准，术后各时间点A组组织学评分明显优于其他各组，B组优于C、D组，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）；C、D组间差异无统计学意义（P＞ 0.05）。各组组内12、24周组织学评分均优于4周，比较差异有统计学意义（P＜ 0.05）；A、B组24周评分优于12周，差异有统计学意义（P＜ 0.05），C、D组12、24周比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）。见表 1。
表1
术后各时间点各组组织学评分比较（n=4，2.4 免疫组织化学染色观察
术后24周，A组见大量Ⅱ型胶原强阳性染色，B 组仅有少量Ⅱ型胶原阳性染色，C、D 组Ⅱ型胶原染色呈阴性。见图 7。
2.5 电镜观察
术后24 周，透射电镜观察示A 组软骨细胞位于陷窝内，细胞核均呈圆形，核染色质分布均一，有大量粗面内质网均匀分布，并呈扩张状，细胞质内含有糖原颗粒，游离核糖体丰富，高尔基复合体较发达，线粒体数量众多，软骨细胞周围可见细小的胶原纤维；B 组以幼稚软骨细胞为主，仅见少量成熟软骨细胞。见图 8。
扫描电镜观察示，A 组修复组织软骨面平整，软骨陷窝分布均匀，并有较丰富的细小胶原纤维；B组修复组织软骨面不平整，软骨陷窝数量较少，分布不均匀。见图 9。
2.6 胶原含量测定
术后24 周，A、B、C、D组修复组织胶原含量分别为48.52% ± 2.83%、41.52% ± 3.78%、36.52% ± 2.65%及37.52% ± 4.54%，均低于正常软骨组织的51.21% ± 0.39%，比较差异有统计学意义（P＜ 0.05）；但A 组胶原含量明显高于其余各组，B组高于C、D组，比较差异有统计学意义（P＜ 0.05）。C、D组间比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）
3 讨论
研究显示，骨髓基质细胞中含有少许具有多向分化潜能的BMSCs，可定向诱导分化成骨或成软骨[12]，当骨与软骨损伤后其周围环境诱导干细胞定向分化，修复损伤组织。关节软骨部分缺损或全层缺损直径＞ 4 mm 时不能自行愈合[13]；直径＜ 4 mm的全层软骨损伤以纤维软骨修复为主，可能是因软骨损伤后，软骨下骨板仍存在，影响了BMSCs向缺损处集中[14]。Shapiro 等[15]应用放射自显影方法证实，对于累及软骨下骨的软骨缺损，其周围软骨细胞不参与细胞再生，修复组织主要来源于髓腔内的基质细胞。之后Steadman 等[16]提出了微骨折技术，通过在软骨下骨板打孔，使骨髓基质细胞参与软骨修复。关节腔的缺氧环境和滑液中的各种活性因子促使骨髓基质细胞向软骨细胞方向分化，而缺损底部邻近髓腔较高的氧分压又促使骨髓基质细胞向成骨细胞转化，形成骨小梁，以利于修复组织与邻近组织的结合。本研究结果显示，与单纯软骨缺损的C、D组比较，微骨折术后A、B组修复组织表面较平整，有光泽，与邻近正常软骨无明显区别，提示软骨缺损后采用微骨折技术治疗能提高软骨组织的修复质量。
但随着微骨折技术的广泛开展，也出现了一系列问题。研究显示，对于老年、肥胖以及软骨缺损直径＞ 2.5 cm的患者，微骨折技术治疗效果较差[17]。此外，微骨折技术不能完全修复软骨损伤，新生成的是纤维软骨而非正常透明软骨，术后随着纤维软骨磨损，关节疼痛、活动受限等临床症状会复发，患者需再次接受关节软骨修复术。因此，在微骨折技术基础上寻找改进方案，以获得更好疗效成为学者们研究热点。
IGF-1由骨、软骨等多种组织分泌，对多种细胞具有促增殖作用，也是软骨合成代谢的主要因子[18-19]。研究显示，软骨组织受损后会刺激软骨细胞分泌IGF-1[20] ，软骨缺损自然修复过程中伴随着IGF-1基因表达增强[21]。IGF-1不仅能刺激软骨细胞增殖，也能促进蛋白多糖及Ⅱ型胶原合成[22]。本研究结果显示，A组通过微骨折技术联合关节腔内注射rhIGF-1治疗后，软骨缺损区修复组织与邻近正常软骨无明显区别；组织学及免疫组织化学染色示修复组织的软骨细胞均位于陷窝中，其形态、分化、排列与正常软骨细胞相似，且软骨细胞间基质较多，含有大量胶原纤维；组织学评分及修复组织胶原含量均显著高于其他各组。B组单纯微骨折技术治疗后，修复组织为不成熟的类透明软骨，细胞间基质较Ａ组少。表明采用微骨折技术联合IGF-1修复后，软骨组织更成熟，蛋白多糖和Ⅱ型胶原含量明显增加。
综上述，微骨折技术联合关节腔内注射IGF-1具有协同作用，能显著促进兔关节软骨缺损修复。但将其应用于临床仍需进一步研究，包括IGF-1注射剂量、注射次数等。
关节软骨缺损是膝关节常见损伤类型，因软骨愈合能力有限，难以自行修复[1]。传统的理疗、药物治疗和外科手术均不能实现关节软骨修复，因此关节软骨缺损修复成为近年研究热点[2]。微骨折技术是在骨面钻孔使含有MSCs的骨髓血渗出修复软骨，目前已广泛用于治疗膝、髋、肘及肩关节等软骨缺损修复[3-5]。但由于新生成的是纤维软骨而非透明软骨，该技术也不能完全修复损伤软骨[6]。有研究表明，生长因子在软骨缺损修复中发挥了重要作用[7-9]，其中IGF-1参与了软骨细胞的增殖和分化。为此，本研究采用微骨折技术联合IGF-1修复兔股骨髁全层创伤性关节软骨缺损，观察修复效果，以期为临床关节软骨缺损修复提供一种新方法。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
4～6 月龄健康新西兰大白兔26只，体重2.5～ 3.5 kg，雌雄不限，由安徽医科大学实验动物中心提供。重组人IGF-1（recombinant human IGF-1，rhIGF-1）、鼠抗人Ⅱ型胶原单克隆抗体（Roche 公司，美国）；鼠/兔通用型SP免疫组织化学检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；羟脯氨酸（hydroxyproline，HPR；上海泛美生物技术有限公司）。透射电镜、扫描电镜（日本电子株氏会社）。
1.2 实验分组及方法
取24只大白兔随机分为4组（n=6）：微骨折技术联合rhIGF-1组（A 组）、微骨折技术对照组（B 组）、rhIGF-1对照组（C 组）和空白对照组（D 组）。各组大白兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（1 mL/kg）麻醉后，于双后肢膝关节内侧作长约3 cm切口，选择髌股关节股骨侧关节面中心，用手术刀片制备8 mm × 6 mm全层关节软骨缺损，深度以点状出血为标准（图 1 a）。 关节软骨缺损模型制备后，A、B 组用1 mm 克氏针在软骨缺损区钻孔，造成软骨下微骨折，横向3 孔、纵向5 孔，孔间距基本相等，深度以有骨髓血渗出为标准（约0.7 cm），关闭切口（图 1 b）。C、D组不作处理，直接拉拢缝合切口。术后各组动物均单笼饲养，活动不限，常规预防性应用抗生素。A、C 组术后每侧关节腔内注射0.1 mL rhIGF-1（0.01 μg/μL），每周3次，连续4周；B、D 组对应时间点关节腔内注射等量生理盐水。
图1
动物模型制备示意图 ⓐ 关节软骨缺损（箭头） ⓑ 微骨折手术箭头示钻孔 术后4、12、24 周，各组各取2只动物采用空气栓塞法处死，原切口入路取材进行以下观测。
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
观察实验动物术后存活、手术切口愈合及后肢活动情况。
1.3.2 大体观察
各时间点观察膝关节有无挛缩、粘连和新生物，有无滑液增多、软骨侵蚀、软骨赘或骨赘等关节病变，以及修复组织的平整性、光泽度、厚度及其与周围组织的结合情况。
1.3.3 组织学观察
各时间点取修复组织，置于10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，0.4 μm厚切片，常规行HE 染色、甲苯胺蓝染色、番红 O染色和Van Gieson染色。光镜下观察软骨细胞形态和排列情况，以及细胞外基质蛋白多糖和胶原生成情况。综合以上染色结果，按照Wakitani 等[10]评分标准进行组织学评分。
1.3.4 免疫组织化学染色观察
取1.3.3中制备的各组术后24周石蜡切片，脱蜡水化，微波修复，H2O2阻断，羊血清封闭，加入一抗（鼠抗人Ⅱ型胶原单克隆抗体），4℃过夜，加入二抗（链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液），DAB 显色，脱水透明，树胶封片。光镜下观察修复组织中的Ⅱ型胶原染色情况。
1.3.5 电镜观察
术后24 周，取A、B 组修复组织，切成1 mm × 1 mm × 1 mm的小块，加入1.5%多聚甲醛-戊二醛混合液，4℃下固定6 h，PBS浸泡3 h × 3 次，梯度乙醇脱水，环氧丙烷和环氧树脂包埋，置于烤箱60℃48 h，70 nm厚超薄切片，5%醋酸双氧铀染色5 min，双蒸水冲洗，枸橼酸铅染色5 min，双蒸水冲洗。透射电镜下观察软骨细胞的超微结构及细胞外胶原分泌情况。
取A、B 组修复组织，切成2 mm × 1 mm × 1 mm的小块，加入1.5%多聚甲醛-戊二醛混合液，4℃下固定6 h，PBS冲洗3次，冻干脱水，镀导电膜，扫描电镜观察其软骨面平整性及软骨陷窝分布情况。
1.3.6 胶原含量测定
术后24周，采用改良HPR法测定各组修复组织和正常兔后肢膝关节软骨的胶原含量。取各组修复组织和剩余2只正常兔后肢膝关节软骨切成0.4 μm薄片，按顺序加入丙酮和乙醚脱脂。剪碎软骨，置于50℃恒温箱中干燥4 h，用三氯醋酸提取胶原，提取液置于烤箱中120℃蒸干，加入6 mol/L HCl溶液，充分溶解后，120℃水浴中10 h，加蒸馏水振荡稀释，配成待测样品。参照文献[11]方法测定HPR：取待测样品1 mL，氧化显色，调节波长至560 nm，测量吸光度（A）值。以HPR 标准品作标准曲线，按以下公式计算胶原含量，胶原含量百分比=样品HPR浓度/组织质量（g）× 7.46 ×100%；样品HPR浓度=标准HPR浓度×所测样品A值/标准HPR浓度A值。
1.4 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
各组动物均存活至实验完成，切口愈合良好。术后24 h，各组动物一般状态较差，后肢无活动，少量进食、饮水；2 d，各组动物活动较前增加，饮水、进食已基本接近正常，后肢活动受限；4周，A组动物后肢活动基本恢复正常，B、C、D组仍有一定程度受限；A、B组动物12周时后肢活动已基本正常，但C、D组部分动物24周时后肢活动仍受限。
2.2 大体观察
术后各时间点各组动物膝关节均无挛缩、粘连和新生物，无滑液增多、滑膜肥厚、软骨侵蚀及软骨赘、骨赘形成等骨关节病变。
术后4周，各组软骨区均有不同程度白色修复组织生成。A 组修复组织大部分区域表面较平整，有光泽及弹性，但未达正常软骨厚度，与正常软骨界线模糊；B 组修复组织部分区域较平整，有一定光泽，但厚度及弹性较A组差，可见与正常软骨界线；C、D 组修复组织均不平整，无光泽，与正常软骨界线清晰。
术后12周，A 组修复组织平整，有光泽，已完全充填缺损区，与正常软骨界线消失；B 组修复组织部分区域平整，有光泽，厚度较邻近正常软骨组织薄，弹性差，与正常软骨界线模糊；C、D 组修复组织不平整，呈白色，无光泽，无明显弹性，与正常软骨界线清晰。
术后24周，A 组观察情况与12周时一致；B组修复组织较平整，部分有光泽，呈白色，有弹性，与正常软骨界线模糊；C、D 组修复组织不平整，呈白色，无光泽，弹性差，修复组织未填满缺损区，与正常软骨界线清晰。见图 2。
2.3 组织学观察
2.3.1 镜下观察
术后4周，A 组见大量圆形、椭圆形细胞及类软骨细胞；B 组见少量椭圆形细胞，大量小梭形细胞，细胞核深染；C、D 组均为无序纤维组织。
术后12、24周，A 组见软骨细胞增生明显，位于陷窝，分化良好，排列较规则，其形态、分化排列与正常软骨细胞难以区分；基质较多，修复的软骨形态与正常关节软骨形态相似，与周围软骨结合紧密；修复组织含有大量基质和胶原纤维。B 组见大量梭形纤维细胞，并含有较多椭圆形类软骨细胞；与A 组相比，基质染色程度浅，胶原和蛋白多糖少。C、D 组为无序纤维组织，见少许小梭形纤维细胞，基质染色浅。见图 3～6。
图5
术后24周各组番红O染色观察（× 400） ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 ⓓ D组 2.3.2 组织学评分
按照Wakitani 等[10]评分标准，术后各时间点A组组织学评分明显优于其他各组，B组优于C、D组，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）；C、D组间差异无统计学意义（P＞ 0.05）。各组组内12、24周组织学评分均优于4周，比较差异有统计学意义（P＜ 0.05）；A、B组24周评分优于12周，差异有统计学意义（P＜ 0.05），C、D组12、24周比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）。见表 1。
表1
术后各时间点各组组织学评分比较（n=4，2.4 免疫组织化学染色观察
术后24周，A组见大量Ⅱ型胶原强阳性染色，B 组仅有少量Ⅱ型胶原阳性染色，C、D 组Ⅱ型胶原染色呈阴性。见图 7。
2.5 电镜观察
术后24 周，透射电镜观察示A 组软骨细胞位于陷窝内，细胞核均呈圆形，核染色质分布均一，有大量粗面内质网均匀分布，并呈扩张状，细胞质内含有糖原颗粒，游离核糖体丰富，高尔基复合体较发达，线粒体数量众多，软骨细胞周围可见细小的胶原纤维；B 组以幼稚软骨细胞为主，仅见少量成熟软骨细胞。见图 8。
扫描电镜观察示，A 组修复组织软骨面平整，软骨陷窝分布均匀，并有较丰富的细小胶原纤维；B组修复组织软骨面不平整，软骨陷窝数量较少，分布不均匀。见图 9。
2.6 胶原含量测定
术后24 周，A、B、C、D组修复组织胶原含量分别为48.52% ± 2.83%、41.52% ± 3.78%、36.52% ± 2.65%及37.52% ± 4.54%，均低于正常软骨组织的51.21% ± 0.39%，比较差异有统计学意义（P＜ 0.05）；但A 组胶原含量明显高于其余各组，B组高于C、D组，比较差异有统计学意义（P＜ 0.05）。C、D组间比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）
3 讨论
研究显示，骨髓基质细胞中含有少许具有多向分化潜能的BMSCs，可定向诱导分化成骨或成软骨[12]，当骨与软骨损伤后其周围环境诱导干细胞定向分化，修复损伤组织。关节软骨部分缺损或全层缺损直径＞ 4 mm 时不能自行愈合[13]；直径＜ 4 mm的全层软骨损伤以纤维软骨修复为主，可能是因软骨损伤后，软骨下骨板仍存在，影响了BMSCs向缺损处集中[14]。Shapiro 等[15]应用放射自显影方法证实，对于累及软骨下骨的软骨缺损，其周围软骨细胞不参与细胞再生，修复组织主要来源于髓腔内的基质细胞。之后Steadman 等[16]提出了微骨折技术，通过在软骨下骨板打孔，使骨髓基质细胞参与软骨修复。关节腔的缺氧环境和滑液中的各种活性因子促使骨髓基质细胞向软骨细胞方向分化，而缺损底部邻近髓腔较高的氧分压又促使骨髓基质细胞向成骨细胞转化，形成骨小梁，以利于修复组织与邻近组织的结合。本研究结果显示，与单纯软骨缺损的C、D组比较，微骨折术后A、B组修复组织表面较平整，有光泽，与邻近正常软骨无明显区别，提示软骨缺损后采用微骨折技术治疗能提高软骨组织的修复质量。
但随着微骨折技术的广泛开展，也出现了一系列问题。研究显示，对于老年、肥胖以及软骨缺损直径＞ 2.5 cm的患者，微骨折技术治疗效果较差[17]。此外，微骨折技术不能完全修复软骨损伤，新生成的是纤维软骨而非正常透明软骨，术后随着纤维软骨磨损，关节疼痛、活动受限等临床症状会复发，患者需再次接受关节软骨修复术。因此，在微骨折技术基础上寻找改进方案，以获得更好疗效成为学者们研究热点。
IGF-1由骨、软骨等多种组织分泌，对多种细胞具有促增殖作用，也是软骨合成代谢的主要因子[18-19]。研究显示，软骨组织受损后会刺激软骨细胞分泌IGF-1[20] ，软骨缺损自然修复过程中伴随着IGF-1基因表达增强[21]。IGF-1不仅能刺激软骨细胞增殖，也能促进蛋白多糖及Ⅱ型胶原合成[22]。本研究结果显示，A组通过微骨折技术联合关节腔内注射rhIGF-1治疗后，软骨缺损区修复组织与邻近正常软骨无明显区别；组织学及免疫组织化学染色示修复组织的软骨细胞均位于陷窝中，其形态、分化、排列与正常软骨细胞相似，且软骨细胞间基质较多，含有大量胶原纤维；组织学评分及修复组织胶原含量均显著高于其他各组。B组单纯微骨折技术治疗后，修复组织为不成熟的类透明软骨，细胞间基质较Ａ组少。表明采用微骨折技术联合IGF-1修复后，软骨组织更成熟，蛋白多糖和Ⅱ型胶原含量明显增加。
综上述，微骨折技术联合关节腔内注射IGF-1具有协同作用，能显著促进兔关节软骨缺损修复。但将其应用于临床仍需进一步研究，包括IGF-1注射剂量、注射次数等。
