引用本文： 马林, 唐康来, 周兵华, 杨广华, 陈万, 穆米多, 袁成松. 机械牵伸对体外大鼠肌腱干细胞RhoA/Rho相关蛋白激酶分子表达的影响. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(5): 639-643. doi: 10.7507/1002-1892.20140141 复制
肌腱病是一种运动损伤性疾病，目前认为肌腱过度不合理使用是导致该病的主要原因。肌腱病的组织发生了大量异位骨化和脂肪化，其发生机制尚不明确。有学者发现，肌腱中存在具有干细胞性质的细胞，命名为肌腱干细胞（tendon stem cells，TSCs）[1-3]。当TSCs受到机械牵伸时，可向肌腱细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化，参与肌腱病的发生发展[4-6]。
小GTP蛋白RhoA和其主要的效应分子Rho相关蛋白激酶（Rho associated protein kinases，ROCK）为机械敏感性分子，参与多种生物学效应，机械牵伸下可诱导细胞骨架的重塑[7-8]，引起细胞产生不同的生物学效应[9-10]。本研究通过对大鼠TSCs体外加载不同机械牵伸力，观察细胞中RhoA/ROCK分子变化情况，以期为肌腱病发病机制研究提供新思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
2～3月龄雄性SD大鼠3只，体重200～250 g，由第三军医大学实验动物中心提供。H-DMEM培养基、胰蛋白酶（HyClone公司，美国）；FBS（GIBCO公司，美国）；纤维连接蛋白、分散酶、Ⅰ型胶原酶（Sigma公司，美国）；抗RhoA抗体（Abcam公司，英国）；抗ROCK抗体、Western blot相关试剂盒、HiFi-MMLV cDNA第1链合成试剂盒、UltraSYBR Mixture、细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、ECL试剂盒、BCA试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技术研究所）。倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；Quantity One软件（Bio-Rad公司，美国）。微沟槽培养皿由本科室自制。
1.2 细胞牵伸器
细胞牵伸器由本科室自行研制，包括机械部分和电子控制部分[11]。电子控制部分控制牵伸的频率和时间，采用可编程控制器配以专用程序，通过调节步进电机转速来改变细胞培养皿的牵拉频率。步进电机转轴输出的扭矩通过齿轮传递带动主轴以设定的频率及时间旋转，主轴上的凸轮驱动硅树脂细胞培养皿支架作往复运动，从而使贴附于培养皿表面的细胞获得体外机械牵伸。不同牵伸应变量（4%、8%、12%）以牵伸位移距离表示，通过更换不同规格的机械凸轮实现（相应的凸轮位移距离分别为2.4、4.8、7.2 mm）。
1.3 大鼠TSCs分离培养
参照文献[1, 12] 进行TSCs分离培养。取3只SD大鼠，无菌条件下取出跟腱组织，剪去腱鞘，PBS清洗3次；将肌腱组织剪碎，在37℃条件下，以3 mg/mL Ⅰ型胶原酶和4 mg/mL分散酶混合液消化1 h。收集细胞悬液，以300 × g离心8 min，弃上清，以含20%FBS的H-DMEM重悬细胞，按50个/cm2密度接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，每3天换液1次，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。当细胞融合达90%时进行传代，取第2～3 代细胞进行实验。经检测干细胞表面标志物CD90、CD44、Oct-4、核干细胞因子和诱导成骨、成软骨和成脂分化鉴定培养细胞为TSCs。
1.4 实验分组及方法
为使TSCs更好地在微沟槽培养皿中贴壁生长，并防止牵伸后细胞脱落，接种细胞前微沟槽培养皿预铺纤维连接蛋白。取2 mL纤维连结蛋白（10 μg/mL）加入微沟槽培养皿中，静置30 min，吸出纤维连接蛋白，PBS溶液冲洗后备用[11]。
实验分为3组，分别为4%牵伸组、8%牵伸组及对照组。取TSCs单细胞悬液，以2 ×104个/cm2密度接种于预铺纤维连接蛋白的微沟槽培养皿中，37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h，待细胞完全贴壁后沿培养皿长轴，对细胞进行单轴机械牵伸。根据不同应变量对TSCs分化方向影响的不同[4]，分别以牵伸应变量4%、8%（4%牵伸组、8%牵伸组）、牵伸频率1 Hz、牵伸时间4 h/d进行牵伸，倒置相差显微镜下观察牵伸后细胞形态变化。牵伸1、2、3 d后收集细胞，静置24 h后进行观测。对照组为未牵伸的TSCs，于对应时间点收集细胞进行以下观测。
1.5 观测指标
1.5.1 实时定量
PCR检测RhoA、ROCK基因表达按照HiFi-MMLV cDNA第1链合成试剂盒和UltraSYBR Mixture说明书进行操作。RhoA上游引物：
5'-ATTGGCGCTTTTGGGTACATG-3'，下游引物：5'-GGCACCCCGACTTTTTCTTC-3'；ROCK上游引物：5'-AACGGAAGAACAGCAGAAATGG-3'，下游引物：5'-GCCGAATGGACTGGTTTTGTT-3'； β-actin上游引物：5'-TACCAGAAGGGCAGGATACAG-3'，下游引物：5'-TCCCGGCCAGCCAGGTCCA-3'。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
按以下条件扩增：95℃预变性8 min；95℃变性15 s、60℃退火、延伸1 min，35个循环。溶解曲线分析为95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s，60℃、15 s。采用2-ΔΔCt法分析目的基因相对表达量。实验重复3次。
1.5.2 Western
blot检测RhoA、ROCK蛋白表达参照RIPA裂解液说明书提取细胞蛋白，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE凝胶电泳，聚偏氟乙烯膜转膜，脱脂奶粉封闭，兔抗鼠一抗（1∶1 000）4℃过夜孵育，二抗室温孵育2 h，洗膜，用ECL试剂盒显影，应用Quantity One软件分析蛋白表达水平。实验重复3次。
1.5.3 细胞增殖检测
参照CCK-8试剂盒说明书操作，在96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液（含4 000个细胞），然后每孔加入10 μL CCK-8溶液，每个样品6 个复孔。置于37℃、5%CO2细胞培养箱内孵育2 h，应用酶标仪在450 nm波长测定吸光度（A）值。实验重复3次。
1.6 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey HSD法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 大鼠TSCs形态观察
倒置相差显微镜下观察示，第2代TSCs呈鹅卵石样，聚集生长；接种于微沟槽培养皿后呈杂乱生长；牵伸后细胞贴壁良好，无脱落，并沿受力方向排列。见图 1。
图1
大鼠TSCs形态观察 ⓐ 第2代细胞培养3 d（倒置相差显微镜× 40） ⓑ 第2代细胞培养3 d（倒置相差显微镜× 400） ⓒ 牵伸前细胞在微沟槽培养皿中杂乱生长（倒置相差显微镜× 400） ⓓ 8%牵伸组牵伸后1 d细胞沿微沟槽生长（倒置相差显微镜× 400） 2.2 不同机械牵伸条件对TSCs中RhoA、ROCK基因表达的影响
各时间点，TSCs中RhoA、ROCK基因相对表达量均随牵伸应变量的增加呈递增趋势，组间比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见图 2。
2.3 不同机械牵伸条件对TSCs中RhoA、ROCK蛋白表达的影响
牵伸1 d时，3组间RhoA、ROCK蛋白表达水平相似，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。2、3 d时，4%、8%牵伸组RhoA、ROCK蛋白表达水平显著高于对照组，且随牵伸应变量增加呈递增趋势；组间比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见图 3、4。
图3
Western blot检测各组RhoA、ROCK蛋白表达 Mr：相对分子质量 1：对照组 2：4%牵伸组 3：8%牵伸组 ⓐ 牵伸1 d ⓑ 牵伸2 d ⓒ 牵伸3 d 2.4 不同机械牵伸条件对细胞增殖的影响
各时间点，8%牵伸组细胞增殖显著低于4%牵伸组及对照组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；4%牵伸组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。见图 5。
3 讨论
研究发现，TSCs在适度机械牵伸条件下可向肌腱方向分化，过度牵伸条件下向非肌腱方向分化，但机械牵伸是如何将力学信号转化为细胞内的化学信号诱导TSCs分化尚不清楚[13-15]。我们前期研究发现，肌腱细胞在异常牵伸条件下可分泌前列腺素E2、磷脂酶A2、环氧合酶等，引起细胞外基质的改变，这些改变可诱导TSCs向不同方向分化[16]。然而TSCs在机械牵伸条件下是如何产生生物学应答的呢？
研究显示，机械牵伸可引起细胞外基质改变，作用于整合素家族，通过细胞RhoA/ROCK信号分子的改变引起一系列生物学应答。RhoA为一种小GTP蛋白，参与细胞的收缩、黏附及运动，尤其在细胞应力纤维装配和黏附斑信号传导中处于重要地位[17]。ROCK是Rho家族GTP激酶的主要下游效应物，有两种亚型（ROCKⅠ和ROCKⅡ），广泛参于细胞黏附、增殖、代谢、凋亡及细胞周期的调节等。RhoA/ROCK分子具有机械敏感性[18]，循环牵伸可使心肌细胞、成纤维细胞、MSCs的RhoA/ROCK分子表达水平上调。当受到外界应力时，RhoA/ROCK通过调节肌动蛋白和肌球蛋白，导致干细胞形状变化，使干细胞向不同方向分化。Chen 等[19]研究发现，机械牵伸诱导BMSCs向成骨细胞表型分化过程中，RhoA/ROCK是重要的调节因子，参与介导细胞骨架肌动蛋白的组装、细胞形态及软骨细胞相关基因的表达。Shi等[20]对TSCs研究发现，在体外2%机械牵伸条件下，RhoA参与了细胞成骨分化的过程。Keung等[21]对神经干细胞研究发现，RhoA参与了神经干细胞的机械化学信号转导和细胞分化的调节。
本研究采用自行研制的细胞循环牵伸系统，对TSCs采用不同的机械牵伸应变量，在不同时间点观察RhoA/ROCK分子表达情况，初步分析RhoA/ROCK分子表达与不同机械牵伸条件的关系。结果提示，牵伸1 d后即引起RhoA、ROCK基因表达上调，并随牵伸应变量的增加而增加，蛋白表达水平在牵伸2、3 d时增高，并且8%应变量变化较大。表明RhoA、ROCK信号分子的表达水平与牵伸应变量有关，但是更多的牵伸条件还需进一步研究。4%牵伸应变量在3 d的牵伸过程中对细胞增殖无显著影响，而8%牵伸应变量抑制了细胞增殖。表明8%牵伸应变量对TSCs产生了过度牵伸的效果，影响了细胞增殖。
综上述，体外循环牵伸可使TSCs中 RhoA/ROCK分子表达显著增高，并且8%牵伸应变量对TSCs产生了过度牵伸的效果。然而牵伸时间对RhoA/ROCK分子表达的影响还不清楚，机械牵伸是否通过RhoA/ROCK分子影响TSCs增殖和分化尚需进一步研究。RhoA/ROCK分子表达调控有可能成为肌腱病发病机制研究领域新的信号分子。
肌腱病是一种运动损伤性疾病，目前认为肌腱过度不合理使用是导致该病的主要原因。肌腱病的组织发生了大量异位骨化和脂肪化，其发生机制尚不明确。有学者发现，肌腱中存在具有干细胞性质的细胞，命名为肌腱干细胞（tendon stem cells，TSCs）[1-3]。当TSCs受到机械牵伸时，可向肌腱细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化，参与肌腱病的发生发展[4-6]。
小GTP蛋白RhoA和其主要的效应分子Rho相关蛋白激酶（Rho associated protein kinases，ROCK）为机械敏感性分子，参与多种生物学效应，机械牵伸下可诱导细胞骨架的重塑[7-8]，引起细胞产生不同的生物学效应[9-10]。本研究通过对大鼠TSCs体外加载不同机械牵伸力，观察细胞中RhoA/ROCK分子变化情况，以期为肌腱病发病机制研究提供新思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
2～3月龄雄性SD大鼠3只，体重200～250 g，由第三军医大学实验动物中心提供。H-DMEM培养基、胰蛋白酶（HyClone公司，美国）；FBS（GIBCO公司，美国）；纤维连接蛋白、分散酶、Ⅰ型胶原酶（Sigma公司，美国）；抗RhoA抗体（Abcam公司，英国）；抗ROCK抗体、Western blot相关试剂盒、HiFi-MMLV cDNA第1链合成试剂盒、UltraSYBR Mixture、细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、ECL试剂盒、BCA试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技术研究所）。倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；Quantity One软件（Bio-Rad公司，美国）。微沟槽培养皿由本科室自制。
1.2 细胞牵伸器
细胞牵伸器由本科室自行研制，包括机械部分和电子控制部分[11]。电子控制部分控制牵伸的频率和时间，采用可编程控制器配以专用程序，通过调节步进电机转速来改变细胞培养皿的牵拉频率。步进电机转轴输出的扭矩通过齿轮传递带动主轴以设定的频率及时间旋转，主轴上的凸轮驱动硅树脂细胞培养皿支架作往复运动，从而使贴附于培养皿表面的细胞获得体外机械牵伸。不同牵伸应变量（4%、8%、12%）以牵伸位移距离表示，通过更换不同规格的机械凸轮实现（相应的凸轮位移距离分别为2.4、4.8、7.2 mm）。
1.3 大鼠TSCs分离培养
参照文献[1, 12] 进行TSCs分离培养。取3只SD大鼠，无菌条件下取出跟腱组织，剪去腱鞘，PBS清洗3次；将肌腱组织剪碎，在37℃条件下，以3 mg/mL Ⅰ型胶原酶和4 mg/mL分散酶混合液消化1 h。收集细胞悬液，以300 × g离心8 min，弃上清，以含20%FBS的H-DMEM重悬细胞，按50个/cm2密度接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，每3天换液1次，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。当细胞融合达90%时进行传代，取第2～3 代细胞进行实验。经检测干细胞表面标志物CD90、CD44、Oct-4、核干细胞因子和诱导成骨、成软骨和成脂分化鉴定培养细胞为TSCs。
1.4 实验分组及方法
为使TSCs更好地在微沟槽培养皿中贴壁生长，并防止牵伸后细胞脱落，接种细胞前微沟槽培养皿预铺纤维连接蛋白。取2 mL纤维连结蛋白（10 μg/mL）加入微沟槽培养皿中，静置30 min，吸出纤维连接蛋白，PBS溶液冲洗后备用[11]。
实验分为3组，分别为4%牵伸组、8%牵伸组及对照组。取TSCs单细胞悬液，以2 ×104个/cm2密度接种于预铺纤维连接蛋白的微沟槽培养皿中，37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h，待细胞完全贴壁后沿培养皿长轴，对细胞进行单轴机械牵伸。根据不同应变量对TSCs分化方向影响的不同[4]，分别以牵伸应变量4%、8%（4%牵伸组、8%牵伸组）、牵伸频率1 Hz、牵伸时间4 h/d进行牵伸，倒置相差显微镜下观察牵伸后细胞形态变化。牵伸1、2、3 d后收集细胞，静置24 h后进行观测。对照组为未牵伸的TSCs，于对应时间点收集细胞进行以下观测。
1.5 观测指标
1.5.1 实时定量
PCR检测RhoA、ROCK基因表达按照HiFi-MMLV cDNA第1链合成试剂盒和UltraSYBR Mixture说明书进行操作。RhoA上游引物：
5'-ATTGGCGCTTTTGGGTACATG-3'，下游引物：5'-GGCACCCCGACTTTTTCTTC-3'；ROCK上游引物：5'-AACGGAAGAACAGCAGAAATGG-3'，下游引物：5'-GCCGAATGGACTGGTTTTGTT-3'； β-actin上游引物：5'-TACCAGAAGGGCAGGATACAG-3'，下游引物：5'-TCCCGGCCAGCCAGGTCCA-3'。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
按以下条件扩增：95℃预变性8 min；95℃变性15 s、60℃退火、延伸1 min，35个循环。溶解曲线分析为95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s，60℃、15 s。采用2-ΔΔCt法分析目的基因相对表达量。实验重复3次。
1.5.2 Western
blot检测RhoA、ROCK蛋白表达参照RIPA裂解液说明书提取细胞蛋白，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE凝胶电泳，聚偏氟乙烯膜转膜，脱脂奶粉封闭，兔抗鼠一抗（1∶1 000）4℃过夜孵育，二抗室温孵育2 h，洗膜，用ECL试剂盒显影，应用Quantity One软件分析蛋白表达水平。实验重复3次。
1.5.3 细胞增殖检测
参照CCK-8试剂盒说明书操作，在96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液（含4 000个细胞），然后每孔加入10 μL CCK-8溶液，每个样品6 个复孔。置于37℃、5%CO2细胞培养箱内孵育2 h，应用酶标仪在450 nm波长测定吸光度（A）值。实验重复3次。
1.6 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey HSD法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 大鼠TSCs形态观察
倒置相差显微镜下观察示，第2代TSCs呈鹅卵石样，聚集生长；接种于微沟槽培养皿后呈杂乱生长；牵伸后细胞贴壁良好，无脱落，并沿受力方向排列。见图 1。
图1
大鼠TSCs形态观察 ⓐ 第2代细胞培养3 d（倒置相差显微镜× 40） ⓑ 第2代细胞培养3 d（倒置相差显微镜× 400） ⓒ 牵伸前细胞在微沟槽培养皿中杂乱生长（倒置相差显微镜× 400） ⓓ 8%牵伸组牵伸后1 d细胞沿微沟槽生长（倒置相差显微镜× 400） 2.2 不同机械牵伸条件对TSCs中RhoA、ROCK基因表达的影响
各时间点，TSCs中RhoA、ROCK基因相对表达量均随牵伸应变量的增加呈递增趋势，组间比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见图 2。
2.3 不同机械牵伸条件对TSCs中RhoA、ROCK蛋白表达的影响
牵伸1 d时，3组间RhoA、ROCK蛋白表达水平相似，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。2、3 d时，4%、8%牵伸组RhoA、ROCK蛋白表达水平显著高于对照组，且随牵伸应变量增加呈递增趋势；组间比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见图 3、4。
图3
Western blot检测各组RhoA、ROCK蛋白表达 Mr：相对分子质量 1：对照组 2：4%牵伸组 3：8%牵伸组 ⓐ 牵伸1 d ⓑ 牵伸2 d ⓒ 牵伸3 d 2.4 不同机械牵伸条件对细胞增殖的影响
各时间点，8%牵伸组细胞增殖显著低于4%牵伸组及对照组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；4%牵伸组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。见图 5。
3 讨论
研究发现，TSCs在适度机械牵伸条件下可向肌腱方向分化，过度牵伸条件下向非肌腱方向分化，但机械牵伸是如何将力学信号转化为细胞内的化学信号诱导TSCs分化尚不清楚[13-15]。我们前期研究发现，肌腱细胞在异常牵伸条件下可分泌前列腺素E2、磷脂酶A2、环氧合酶等，引起细胞外基质的改变，这些改变可诱导TSCs向不同方向分化[16]。然而TSCs在机械牵伸条件下是如何产生生物学应答的呢？
研究显示，机械牵伸可引起细胞外基质改变，作用于整合素家族，通过细胞RhoA/ROCK信号分子的改变引起一系列生物学应答。RhoA为一种小GTP蛋白，参与细胞的收缩、黏附及运动，尤其在细胞应力纤维装配和黏附斑信号传导中处于重要地位[17]。ROCK是Rho家族GTP激酶的主要下游效应物，有两种亚型（ROCKⅠ和ROCKⅡ），广泛参于细胞黏附、增殖、代谢、凋亡及细胞周期的调节等。RhoA/ROCK分子具有机械敏感性[18]，循环牵伸可使心肌细胞、成纤维细胞、MSCs的RhoA/ROCK分子表达水平上调。当受到外界应力时，RhoA/ROCK通过调节肌动蛋白和肌球蛋白，导致干细胞形状变化，使干细胞向不同方向分化。Chen 等[19]研究发现，机械牵伸诱导BMSCs向成骨细胞表型分化过程中，RhoA/ROCK是重要的调节因子，参与介导细胞骨架肌动蛋白的组装、细胞形态及软骨细胞相关基因的表达。Shi等[20]对TSCs研究发现，在体外2%机械牵伸条件下，RhoA参与了细胞成骨分化的过程。Keung等[21]对神经干细胞研究发现，RhoA参与了神经干细胞的机械化学信号转导和细胞分化的调节。
本研究采用自行研制的细胞循环牵伸系统，对TSCs采用不同的机械牵伸应变量，在不同时间点观察RhoA/ROCK分子表达情况，初步分析RhoA/ROCK分子表达与不同机械牵伸条件的关系。结果提示，牵伸1 d后即引起RhoA、ROCK基因表达上调，并随牵伸应变量的增加而增加，蛋白表达水平在牵伸2、3 d时增高，并且8%应变量变化较大。表明RhoA、ROCK信号分子的表达水平与牵伸应变量有关，但是更多的牵伸条件还需进一步研究。4%牵伸应变量在3 d的牵伸过程中对细胞增殖无显著影响，而8%牵伸应变量抑制了细胞增殖。表明8%牵伸应变量对TSCs产生了过度牵伸的效果，影响了细胞增殖。
综上述，体外循环牵伸可使TSCs中 RhoA/ROCK分子表达显著增高，并且8%牵伸应变量对TSCs产生了过度牵伸的效果。然而牵伸时间对RhoA/ROCK分子表达的影响还不清楚，机械牵伸是否通过RhoA/ROCK分子影响TSCs增殖和分化尚需进一步研究。RhoA/ROCK分子表达调控有可能成为肌腱病发病机制研究领域新的信号分子。
