引用本文： 邓玖征, 张友乐, 李翔. 低温冻存同种异体骨膜和骨髓移植免疫原性研究. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(5): 649-653. doi: 10.7507/1002-1892.20140143 复制
同种异体关节移植用于修复重建创伤、骨软骨疾病及骨恶性肿瘤术后关节缺损已经历百余年，应用早期因基础及临床研究水平有限效果不佳[1]。20世纪80年代后，随着低温冻存技术及免疫抑制药物的应用，同种异体关节移植取得长足发展，但免疫排斥反应仍是限制其应用的主要因素[2]。关节组织成分复杂，了解不同组织的免疫原性，可指导同种异体关节的制备，以获得低免疫原性、可长期存活的同种异体关节。本研究采用低温冻存处理骨膜、骨髓后，将其注入同种异体兔腹腔内，通过检测血清IL-2、IL-6、TNF-α浓度和外周静脉血CD4+ T细胞与CD8+ T细胞比例，以期获得较为全面的免疫原性数据，为探索同种异体关节合适的制备方法提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
6月龄清洁级新西兰白兔5只作为供体，雌性3只，雄性2只，体重2.6～3.0 kg；6月龄清洁级青紫蓝兔18只作为受体，雌雄各半，体重2.1～2.8 kg；均由北京欣绿安实验动物中心提供。
兔IL-2 ELISA试剂盒、兔IL-6 ELISA试剂盒、兔TNF-α ELISA试剂盒（R&D公司，美国）；FITC标记抗兔CD4抗体、FITC标记抗兔CD8抗体（Antigenix公司，美国）；L-DMEM培养液（GIBCO公司，美国）；FBS（Clark公司，美国）；DMSO（北京优博奥生物科技有限公司）。
红细胞裂解液配制：去离子水100 mL、NH4Cl 155 mmol（8.219 g）、EDTA 0.1 mmol（0.037 g）、KHCO3 10 mmol（1.012 g）混合后搅拌均匀，调整pH值为7.5，得到10倍浓度红细胞裂解液100 mL，使用时加入900 mL去离子水定容至1 000 mL。低温保护剂配制：依据说明书配置DMEM培养液，将DMEM培养液、FBS、DMSO按照7∶2∶1混合[3]。
发光检测仪（Berthold公司，德国）；离心机（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；FACS Caluber流式细胞仪、Cellquest软件（BD公司，美国）。
1.2 实验方法
1.2.1 供体处理
取5只新西兰白兔，耳缘静脉注射空气处死。取双侧膝关节正中切口，分离皮下组织，暴露膝关节及周围肌肉，自前内侧切开并剥离肌肉组织，暴露股骨及胫骨，用线锯由膝关节上、下端各约2 cm处截骨，取出膝关节。取关节上存留骨膜，纱布过滤、生理盐水漂洗，漂洗液经0.22 μm过滤器过滤，收集所有骨膜备用；冲洗髓腔，取出骨髓，同法过滤后备用。将收集的骨膜及骨髓分别用低温保护剂浸泡30 min，置入无菌广口瓶内，4℃冰箱冷平衡30 min；以1℃/ min速率降至- 20℃，平衡2 h；以1℃/min速率降至- 80℃，平衡1 d后液氮冻存。1个月后取出骨膜、 骨髓组织，无菌条件下37℃水浴复温2 min，解冻后室温下生理盐水漂洗5 min，过滤器收集组织。将骨膜剪碎，放入无菌研磨皿中研磨，称重；取6 g组织，加入生理盐水至12 mL，配制成0.5 g/mL悬浊液，分装至6只 2 mL 无菌注射器备用。同法制备骨髓悬浊液。
1.2.2 受体处理
取18只青紫蓝兔随机分成A、B、C 3组（n=6），分别于兔中下腹旁中线2 cm处注射2 mL生理盐水、骨膜悬浊液、骨髓悬浊液。注射器穿透腹壁时有突破感，回抽无异物后缓慢注射，观察注射部位无出血。注射完毕后将兔放回饲养笼内，自由活动。
1.3 检测指标
1.3.1 血清IL-2、IL-6、TNF-α浓度检测
分别于注射前及注射后1、2周耳缘静脉取血4 mL，静置20 min，以485 × g离心20 min，取上清，- 20℃恒温冻存，统一送检。按兔IL-2、IL-6、TNF-α ELISA试剂盒说明书方法检测血清IL-2、IL-6、TNF-α浓度。
1.3.2 T细胞亚群测定
分别于注射前及注射后1、2 周耳缘静脉取血4 mL，EDTA抗凝，4℃冰水浴中检测T细胞亚群。取2 mL静脉血，盛入离心管中，加入红细胞裂解液，混匀，静置5 min。以485 × g离心5 min。弃上清，PBS缓冲液冲洗2次，再加入适量PBS缓冲液，将细胞吹吸均匀（重悬）。显微镜下计数细胞，调整细胞混悬液浓度至1 ×107 个 / mL。取细胞混悬液100 μL，加入1 μL FITC标记抗体（CD4或CD8），4℃下静置染色30 min。以不加FITC标记抗体的细胞混悬液作为阴性对照。同上法离心并重悬至400 mL，转移至流式管内上机检测。采用Cellquest软件计数染色细胞数，分别得到CD4+ T细胞及CD8+ T细胞占有核细胞的百分比，再计算CD4+ T细胞/CD8+ T细胞比值。
1.4 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，采用重复测量方差分析，球形检验水准P=0.05，当P＜ 0.05时，认为重复测量数据之间存在相关性，采用Greenhouse-Geisser校正结果。
2 结果
2.1 血清IL-2、IL-6、TNF-α浓度检测
IL-2：球形检验P=0.039，不符合球形数据，采用Greenhouse-Geisser校正结果：采用时间为单一因素考虑时，F=1.492，P=0.241，说明IL-2浓度无时间变化趋势；时间和组别交互作用分析结果显示，F=1.726，P=0.192，说明时间因素的作用不随分组变化而发生变化；组间比较结果，F=3.552，P=0.055，说明各组间血清IL-2浓度变化差异无统计学意义。见表 1。
表1
各组各时间点血清IL-2、IL-6、TNF-α浓度及CD4+ T细胞/CD8+ T细胞比值测定（n=6，IL-6：球形检验P=0.004，不符合球形数据，采用Greenhouse-Geisser校正结果：采用时间为单一因素考虑时，F=4.422，P=0.040，说明IL-6浓度变化存在时间变化趋势，注射后1周各组均值下降，2周时A、B组略回升；时间和组别交互作用分析结果显示，F=0.670，P=0.561，说明时间因素的作用不随分组变化而变化；组间比较结果，F=1.106，P=0.357，说明各组间血清IL-6浓度变化差异无统计学意义。见表 1。
TNF-α：球形检验P=0.338，符合球形数据，采用单变量方差分析结果：采用时间为单一因素考虑时，F=0.078，P=0.925，说明TNF-α浓度无时间变化趋势；时间和组别交互作用分析结果显示，F=1.343，P=0.277，说明时间因素的作用不随分组变化而变化；组间比较结果显示，F=5.381，P=0.017，说明各组间血清TNF-α变化差异有统计学意义，两两比较采用LSD法，结果显示B组显著高于A、C组（P＜ 0.05），A、C组间差异无统计学意义（P＞ 0.05）。见表 1。
2.2 CD4+ T细胞/CD8+ T细胞比值测定
球形检验P=0.013，不符合球形数据，采用Greenhouse-Geisser校正结果：采用时间为单一因素考虑时，F=1.471，P=0.248，说明CD4+ T细胞/CD8+ T细胞比值无时间变化趋势；时间与组别交互作用分析结果显示，F=1.987，P=0.151，说明时间因素的作用不随分组变化而发生变化；组间比较结果显示，F=0.450，P=0.646，说明各组间CD4+ T细胞/CD8+ T细胞比值差异无统计学意义。见表 1。
3 讨论
同种异体关节因具有供体来源广泛、大小形状不受限制、有生物活性、与受体部位能产生生物结合等优点，经过多年发展与完善，成为修复严重关节缺损的可行技术，并取得一定疗效[4-5]。低温冻存技术的发展在提高软骨细胞成活率基础上，降低了同种异体材料的免疫原性，使移植后材料更易成活[6-8]。关节周围组织成分主要包括骨骼、韧带、骨膜、骨髓、纤维囊、滑膜等，其中同种异体骨、肌腱移植已广泛应用于临床，其免疫原性也得到比较充分的认识。滑膜及纤维囊结构多位于关节腔内，剔除操作需切开关节，会损伤关节囊及周围软组织，在小关节移植中影响关节稳定[9]，因而制备过程中难以剔除，故未纳入研究。目前，针对低温冻存后同种异体骨膜及骨髓的免疫原性研究较少。通过确定同种异体骨膜、骨髓免疫原性强度，可明确高免疫原性的软组织成分，改进制备过程，以获得低免疫原性、易于成活的同种异体关节。为此，我们进行了本次研究。
青紫蓝兔和新西兰白兔属于哺乳纲、兔形目、兔科、真兔属、家兔下的两个不同品系，采用不同品系作为供体与受体，可避免因近亲造成的同种异体移植免疫排斥反应较弱的问题[10]。骨膜、骨髓冻存采用的低温保护剂浸泡、程序降温方法，利于保存细胞的生物活性，并降低移植物的免疫原性，便于存储和运输，是目前成熟并广泛采用的同种异体移植材料处理方法[11-12]。通过腹腔注射组织悬浊液制作动物模型，可分别针对骨膜、骨髓进行研究，便于探索单一成分的免疫原性特点，并可统一注射剂量，增强各组数据间的可比性。采用静脉血IL-2、IL-6、TNF-α浓度及T细胞亚群作为检测指标，对受体损伤小，进而对兔免疫系统干扰小，利于对同一实验个体进行多次重复测量，达到动态观测指标变化的目的。
同种异体移植免疫排斥反应的靶抗原主要是共显性表达于移植物细胞表面的主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）分子，其基因位于第6号染色体。免疫排斥反应的本质是T细胞介导的免疫应答过程。同种异体移植免疫排斥反应效应机制主要包括：① CD4+ T细胞（Th细胞）活化和巨噬细胞动员，引起迟发型超敏反应；② CD8+ T细胞的直接杀伤作用；③ 抗原抗体复合物形成，激活补体系统，损害移植物血管。当移植物植入受体体内后，通过直接和间接途径刺激CD4+ T细胞，产生多种细胞因子，成为Th0细胞，Th0细胞在不同细胞因子作用下向Th1和Th2细胞分化。Th1细胞主要分泌IL-2、INF-g等细胞因子，促进细胞毒性T细胞和迟发型超敏反应T细胞成熟，促进细胞介导的免疫应答。而IL-1、IL-2又对淋巴细胞进行自分泌或旁分泌调节，与抗原的特异性刺激一起，共同激活T细胞，从而介导移植物的排斥反应。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-10，促进B细胞成熟及抗体生成，其中IL-6主要刺激B细胞产生IgG抗体，增强抗体介导的免疫应答。CD4+ T细胞识别MHCⅡ类分子，主要是Th细胞，诱导免疫应答；CD8+ T细胞识别MHCⅠ类分子，主要为细胞毒性T细胞和抑制T细胞，对同种异体细胞造成直接杀伤，并可下调免疫应答水平。CD4+ T细胞/CD8+ T细胞比值的变化反映了家兔细胞免疫系统的稳定水平及细胞免疫的强度[13-14]。对于初次进入体内的同种异体组织，急性免疫排斥反应一般发生在植入后10～13 d，且在2～3周达峰值，采集该时间段的数据可以比较敏感反映急性免疫排斥反应[15-17]。
本研究中，IL-2检测结果显示B、C组注射后1周血清IL-2水平均有所升高，C组于2周时降至注射前水平，但与A组比较差异无统计学意义，说明经低温冷冻处理后，骨膜、骨髓未引起明显特异性细胞免疫应答，这与文献报道结果一致[18]。因为经低温冻存处理后，骨膜成为一个可供吸收的生物膜，主要保存了胶原成分，本实验中采用利于细胞成活的冻存方法，即使同种异体细胞成活较多，仍未诱发显著细胞免疫应答。C组也未发生预期的明显免疫反应[19-20]，考虑原因主要是收集的是成年兔长管状骨髓腔内骨髓（也是通常材料处理时去除的部分），以黄骨髓为主，主要包含BMSCs及脂肪细胞，脂肪细胞相对于造血细胞、血管内皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞等[21]免疫原性弱，加之低温冻存处理，使其未产生更加明显的促进T细胞活化的作用。IL-6为诱导B细胞活化的重要细胞因子。各组间血清IL-6变化趋势差异无统计学意义，提示所注射的骨膜、骨髓未诱导明显的免疫应答；IL-6浓度存在时间变化趋势，表明同种异体骨关节移植中的排斥反应主要是细胞免疫过程，尤其在反应早期更为明显，这与文献报道[22-23]一致。TNF-α主要由活化的单核-巨噬细胞产生，因可诱导肿瘤细胞凋亡而得名，在人体内作为前炎性细胞因子，是启动炎性反应的关键因子，引起白细胞在炎性部位聚集[24]。各组间TNF-α变化趋势示，A组与C组无显著性差异，而B组与其余两组差异显著，其血清TNF-α浓度升高，说明同种异体骨膜经低温冻存处理后仍存在一定免疫原性，主要表现为可引起局部非特异性炎性反应。CD4+ T细胞/CD8+ T细胞比值在各组间未见明显差异，整体存在升高趋势，但增长并不明显。提示各组实验动物的细胞免疫水平处于稳定状态，外源性异物虽然激活了细胞免疫，但未造成其细胞免疫系统的强烈反应[25]。
综上述，经低温冻存处理的骨膜、骨髓总体无显著免疫原性。考虑到骨膜组织中成骨细胞成分较多，更利于骨愈合，而骨髓中成骨细胞成分较少，建议保留骨膜组织，去除骨髓，彻底冲洗红骨髓，以降低同种异体关节的免疫原性。
作为初步研究，本研究仅检测了血清免疫学指标，优点在于可多次重复测量，但缺乏同一时间点大体及组织学观察结果；同时由于样本量有限，也存在一定假阴性可能。在进一步研究中，可通过扩大样本量、分组、分期取材离体观察等方法，获得更加详细的研究数据，以优化同种异体关节的制备方法。
同种异体关节移植用于修复重建创伤、骨软骨疾病及骨恶性肿瘤术后关节缺损已经历百余年，应用早期因基础及临床研究水平有限效果不佳[1]。20世纪80年代后，随着低温冻存技术及免疫抑制药物的应用，同种异体关节移植取得长足发展，但免疫排斥反应仍是限制其应用的主要因素[2]。关节组织成分复杂，了解不同组织的免疫原性，可指导同种异体关节的制备，以获得低免疫原性、可长期存活的同种异体关节。本研究采用低温冻存处理骨膜、骨髓后，将其注入同种异体兔腹腔内，通过检测血清IL-2、IL-6、TNF-α浓度和外周静脉血CD4+ T细胞与CD8+ T细胞比例，以期获得较为全面的免疫原性数据，为探索同种异体关节合适的制备方法提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
6月龄清洁级新西兰白兔5只作为供体，雌性3只，雄性2只，体重2.6～3.0 kg；6月龄清洁级青紫蓝兔18只作为受体，雌雄各半，体重2.1～2.8 kg；均由北京欣绿安实验动物中心提供。
兔IL-2 ELISA试剂盒、兔IL-6 ELISA试剂盒、兔TNF-α ELISA试剂盒（R&D公司，美国）；FITC标记抗兔CD4抗体、FITC标记抗兔CD8抗体（Antigenix公司，美国）；L-DMEM培养液（GIBCO公司，美国）；FBS（Clark公司，美国）；DMSO（北京优博奥生物科技有限公司）。
红细胞裂解液配制：去离子水100 mL、NH4Cl 155 mmol（8.219 g）、EDTA 0.1 mmol（0.037 g）、KHCO3 10 mmol（1.012 g）混合后搅拌均匀，调整pH值为7.5，得到10倍浓度红细胞裂解液100 mL，使用时加入900 mL去离子水定容至1 000 mL。低温保护剂配制：依据说明书配置DMEM培养液，将DMEM培养液、FBS、DMSO按照7∶2∶1混合[3]。
发光检测仪（Berthold公司，德国）；离心机（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；FACS Caluber流式细胞仪、Cellquest软件（BD公司，美国）。
1.2 实验方法
1.2.1 供体处理
取5只新西兰白兔，耳缘静脉注射空气处死。取双侧膝关节正中切口，分离皮下组织，暴露膝关节及周围肌肉，自前内侧切开并剥离肌肉组织，暴露股骨及胫骨，用线锯由膝关节上、下端各约2 cm处截骨，取出膝关节。取关节上存留骨膜，纱布过滤、生理盐水漂洗，漂洗液经0.22 μm过滤器过滤，收集所有骨膜备用；冲洗髓腔，取出骨髓，同法过滤后备用。将收集的骨膜及骨髓分别用低温保护剂浸泡30 min，置入无菌广口瓶内，4℃冰箱冷平衡30 min；以1℃/ min速率降至- 20℃，平衡2 h；以1℃/min速率降至- 80℃，平衡1 d后液氮冻存。1个月后取出骨膜、 骨髓组织，无菌条件下37℃水浴复温2 min，解冻后室温下生理盐水漂洗5 min，过滤器收集组织。将骨膜剪碎，放入无菌研磨皿中研磨，称重；取6 g组织，加入生理盐水至12 mL，配制成0.5 g/mL悬浊液，分装至6只 2 mL 无菌注射器备用。同法制备骨髓悬浊液。
1.2.2 受体处理
取18只青紫蓝兔随机分成A、B、C 3组（n=6），分别于兔中下腹旁中线2 cm处注射2 mL生理盐水、骨膜悬浊液、骨髓悬浊液。注射器穿透腹壁时有突破感，回抽无异物后缓慢注射，观察注射部位无出血。注射完毕后将兔放回饲养笼内，自由活动。
1.3 检测指标
1.3.1 血清IL-2、IL-6、TNF-α浓度检测
分别于注射前及注射后1、2周耳缘静脉取血4 mL，静置20 min，以485 × g离心20 min，取上清，- 20℃恒温冻存，统一送检。按兔IL-2、IL-6、TNF-α ELISA试剂盒说明书方法检测血清IL-2、IL-6、TNF-α浓度。
1.3.2 T细胞亚群测定
分别于注射前及注射后1、2 周耳缘静脉取血4 mL，EDTA抗凝，4℃冰水浴中检测T细胞亚群。取2 mL静脉血，盛入离心管中，加入红细胞裂解液，混匀，静置5 min。以485 × g离心5 min。弃上清，PBS缓冲液冲洗2次，再加入适量PBS缓冲液，将细胞吹吸均匀（重悬）。显微镜下计数细胞，调整细胞混悬液浓度至1 ×107 个 / mL。取细胞混悬液100 μL，加入1 μL FITC标记抗体（CD4或CD8），4℃下静置染色30 min。以不加FITC标记抗体的细胞混悬液作为阴性对照。同上法离心并重悬至400 mL，转移至流式管内上机检测。采用Cellquest软件计数染色细胞数，分别得到CD4+ T细胞及CD8+ T细胞占有核细胞的百分比，再计算CD4+ T细胞/CD8+ T细胞比值。
1.4 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，采用重复测量方差分析，球形检验水准P=0.05，当P＜ 0.05时，认为重复测量数据之间存在相关性，采用Greenhouse-Geisser校正结果。
2 结果
2.1 血清IL-2、IL-6、TNF-α浓度检测
IL-2：球形检验P=0.039，不符合球形数据，采用Greenhouse-Geisser校正结果：采用时间为单一因素考虑时，F=1.492，P=0.241，说明IL-2浓度无时间变化趋势；时间和组别交互作用分析结果显示，F=1.726，P=0.192，说明时间因素的作用不随分组变化而发生变化；组间比较结果，F=3.552，P=0.055，说明各组间血清IL-2浓度变化差异无统计学意义。见表 1。
表1
各组各时间点血清IL-2、IL-6、TNF-α浓度及CD4+ T细胞/CD8+ T细胞比值测定（n=6，IL-6：球形检验P=0.004，不符合球形数据，采用Greenhouse-Geisser校正结果：采用时间为单一因素考虑时，F=4.422，P=0.040，说明IL-6浓度变化存在时间变化趋势，注射后1周各组均值下降，2周时A、B组略回升；时间和组别交互作用分析结果显示，F=0.670，P=0.561，说明时间因素的作用不随分组变化而变化；组间比较结果，F=1.106，P=0.357，说明各组间血清IL-6浓度变化差异无统计学意义。见表 1。
TNF-α：球形检验P=0.338，符合球形数据，采用单变量方差分析结果：采用时间为单一因素考虑时，F=0.078，P=0.925，说明TNF-α浓度无时间变化趋势；时间和组别交互作用分析结果显示，F=1.343，P=0.277，说明时间因素的作用不随分组变化而变化；组间比较结果显示，F=5.381，P=0.017，说明各组间血清TNF-α变化差异有统计学意义，两两比较采用LSD法，结果显示B组显著高于A、C组（P＜ 0.05），A、C组间差异无统计学意义（P＞ 0.05）。见表 1。
2.2 CD4+ T细胞/CD8+ T细胞比值测定
球形检验P=0.013，不符合球形数据，采用Greenhouse-Geisser校正结果：采用时间为单一因素考虑时，F=1.471，P=0.248，说明CD4+ T细胞/CD8+ T细胞比值无时间变化趋势；时间与组别交互作用分析结果显示，F=1.987，P=0.151，说明时间因素的作用不随分组变化而发生变化；组间比较结果显示，F=0.450，P=0.646，说明各组间CD4+ T细胞/CD8+ T细胞比值差异无统计学意义。见表 1。
3 讨论
同种异体关节因具有供体来源广泛、大小形状不受限制、有生物活性、与受体部位能产生生物结合等优点，经过多年发展与完善，成为修复严重关节缺损的可行技术，并取得一定疗效[4-5]。低温冻存技术的发展在提高软骨细胞成活率基础上，降低了同种异体材料的免疫原性，使移植后材料更易成活[6-8]。关节周围组织成分主要包括骨骼、韧带、骨膜、骨髓、纤维囊、滑膜等，其中同种异体骨、肌腱移植已广泛应用于临床，其免疫原性也得到比较充分的认识。滑膜及纤维囊结构多位于关节腔内，剔除操作需切开关节，会损伤关节囊及周围软组织，在小关节移植中影响关节稳定[9]，因而制备过程中难以剔除，故未纳入研究。目前，针对低温冻存后同种异体骨膜及骨髓的免疫原性研究较少。通过确定同种异体骨膜、骨髓免疫原性强度，可明确高免疫原性的软组织成分，改进制备过程，以获得低免疫原性、易于成活的同种异体关节。为此，我们进行了本次研究。
青紫蓝兔和新西兰白兔属于哺乳纲、兔形目、兔科、真兔属、家兔下的两个不同品系，采用不同品系作为供体与受体，可避免因近亲造成的同种异体移植免疫排斥反应较弱的问题[10]。骨膜、骨髓冻存采用的低温保护剂浸泡、程序降温方法，利于保存细胞的生物活性，并降低移植物的免疫原性，便于存储和运输，是目前成熟并广泛采用的同种异体移植材料处理方法[11-12]。通过腹腔注射组织悬浊液制作动物模型，可分别针对骨膜、骨髓进行研究，便于探索单一成分的免疫原性特点，并可统一注射剂量，增强各组数据间的可比性。采用静脉血IL-2、IL-6、TNF-α浓度及T细胞亚群作为检测指标，对受体损伤小，进而对兔免疫系统干扰小，利于对同一实验个体进行多次重复测量，达到动态观测指标变化的目的。
同种异体移植免疫排斥反应的靶抗原主要是共显性表达于移植物细胞表面的主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）分子，其基因位于第6号染色体。免疫排斥反应的本质是T细胞介导的免疫应答过程。同种异体移植免疫排斥反应效应机制主要包括：① CD4+ T细胞（Th细胞）活化和巨噬细胞动员，引起迟发型超敏反应；② CD8+ T细胞的直接杀伤作用；③ 抗原抗体复合物形成，激活补体系统，损害移植物血管。当移植物植入受体体内后，通过直接和间接途径刺激CD4+ T细胞，产生多种细胞因子，成为Th0细胞，Th0细胞在不同细胞因子作用下向Th1和Th2细胞分化。Th1细胞主要分泌IL-2、INF-g等细胞因子，促进细胞毒性T细胞和迟发型超敏反应T细胞成熟，促进细胞介导的免疫应答。而IL-1、IL-2又对淋巴细胞进行自分泌或旁分泌调节，与抗原的特异性刺激一起，共同激活T细胞，从而介导移植物的排斥反应。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-10，促进B细胞成熟及抗体生成，其中IL-6主要刺激B细胞产生IgG抗体，增强抗体介导的免疫应答。CD4+ T细胞识别MHCⅡ类分子，主要是Th细胞，诱导免疫应答；CD8+ T细胞识别MHCⅠ类分子，主要为细胞毒性T细胞和抑制T细胞，对同种异体细胞造成直接杀伤，并可下调免疫应答水平。CD4+ T细胞/CD8+ T细胞比值的变化反映了家兔细胞免疫系统的稳定水平及细胞免疫的强度[13-14]。对于初次进入体内的同种异体组织，急性免疫排斥反应一般发生在植入后10～13 d，且在2～3周达峰值，采集该时间段的数据可以比较敏感反映急性免疫排斥反应[15-17]。
本研究中，IL-2检测结果显示B、C组注射后1周血清IL-2水平均有所升高，C组于2周时降至注射前水平，但与A组比较差异无统计学意义，说明经低温冷冻处理后，骨膜、骨髓未引起明显特异性细胞免疫应答，这与文献报道结果一致[18]。因为经低温冻存处理后，骨膜成为一个可供吸收的生物膜，主要保存了胶原成分，本实验中采用利于细胞成活的冻存方法，即使同种异体细胞成活较多，仍未诱发显著细胞免疫应答。C组也未发生预期的明显免疫反应[19-20]，考虑原因主要是收集的是成年兔长管状骨髓腔内骨髓（也是通常材料处理时去除的部分），以黄骨髓为主，主要包含BMSCs及脂肪细胞，脂肪细胞相对于造血细胞、血管内皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞等[21]免疫原性弱，加之低温冻存处理，使其未产生更加明显的促进T细胞活化的作用。IL-6为诱导B细胞活化的重要细胞因子。各组间血清IL-6变化趋势差异无统计学意义，提示所注射的骨膜、骨髓未诱导明显的免疫应答；IL-6浓度存在时间变化趋势，表明同种异体骨关节移植中的排斥反应主要是细胞免疫过程，尤其在反应早期更为明显，这与文献报道[22-23]一致。TNF-α主要由活化的单核-巨噬细胞产生，因可诱导肿瘤细胞凋亡而得名，在人体内作为前炎性细胞因子，是启动炎性反应的关键因子，引起白细胞在炎性部位聚集[24]。各组间TNF-α变化趋势示，A组与C组无显著性差异，而B组与其余两组差异显著，其血清TNF-α浓度升高，说明同种异体骨膜经低温冻存处理后仍存在一定免疫原性，主要表现为可引起局部非特异性炎性反应。CD4+ T细胞/CD8+ T细胞比值在各组间未见明显差异，整体存在升高趋势，但增长并不明显。提示各组实验动物的细胞免疫水平处于稳定状态，外源性异物虽然激活了细胞免疫，但未造成其细胞免疫系统的强烈反应[25]。
综上述，经低温冻存处理的骨膜、骨髓总体无显著免疫原性。考虑到骨膜组织中成骨细胞成分较多，更利于骨愈合，而骨髓中成骨细胞成分较少，建议保留骨膜组织，去除骨髓，彻底冲洗红骨髓，以降低同种异体关节的免疫原性。
作为初步研究，本研究仅检测了血清免疫学指标，优点在于可多次重复测量，但缺乏同一时间点大体及组织学观察结果；同时由于样本量有限，也存在一定假阴性可能。在进一步研究中，可通过扩大样本量、分组、分期取材离体观察等方法，获得更加详细的研究数据，以优化同种异体关节的制备方法。
