引用本文： 王永成, 孟昊业, 袁雪凌, 彭江, 郭全义, 卢世璧, 汪爱媛. 兔骨软骨缺损自发性修复模型中软骨下骨重塑与软骨再生的关系. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(6): 681-686. doi: 10.7507/1002-1892.20140151 复制
关节软骨和软骨下骨是相互依赖又相互作用、既独立又统一的功能单位，软骨下骨承受着来自软骨向下传导的应力负荷，两者在解剖结构上紧密相连，在生物学功能上相互影响[1]。软骨下骨的完整性是否受到破坏是骨软骨损伤的标志[2]。既往研究表明，软骨下骨在骨关节炎（osteoarthritis，OA）的发生发展中与软骨退变密切联系，两种组织均发生变化且在空间结构上相关，骨量的最大改变位于骨-软骨界面处[1, 3-5]。目前已有实验研究关注到骨软骨损伤模型或进行骨髓刺激技术后发生的自发性软骨修复[6-8]，但关于两者反应关系的机制尚不明确。仅有少数动物实验研究描述了骨软骨损伤中软骨下骨板的迁移现象[6, 8]，但缺乏体内软骨下骨重塑的定量研究。因此，本实验通过监测不同时期兔骨软骨缺损自发性修复模型中软骨下骨的微观结构变化，探讨软骨下骨重塑在骨软骨损伤中的作用以及与软骨再生之间的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
6月龄健康雄性新西兰大白兔24只，体重1.8～ 2.5 kg，由解放军总医院动物实验中心提供，实验方案经解放军总医院动物实验管理委员会批准。
番红O、甲苯胺蓝染色剂（Sigma公司，美国）；鼠抗兔Ⅱ型胶原单克隆抗体（Calbiochem公司，美国）；免疫组织化学试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。BX-51显微镜、DP70图像采集系统（Olympus 公司，日本）；Locus eXplore micro-CT、MicroView图像分析处理软件（GE公司，美国）。
1.2 骨软骨缺损自发性修复模型建立
取大白兔24只，术前30 min肌肉注射抗生素。肌肉注射20%盐酸塞拉嗪注射液（2 mL/kg）麻醉，沿单侧膝部髌骨内侧缘行2 cm纵切口，将髌骨牵向外侧，显露髌股关节面。检查膝关节腔无积液或粘连，关节软骨平坦、色泽正常后，用直径4 mm环钻在膝关节屈曲90°时髌骨所对应股骨内、外侧髁间关节面中部作一直径4 mm、深约3 mm的骨软骨缺损。术中见缺损区出血即可，不作任何干预，将髌骨复位后，逐层闭合关节囊和皮肤切口。术后动物单笼饲养，不行术肢外固定，自由活动、取食；术后第 2 天使用抗生素，防止腹泻及感染。于术后1、4、12、24周，采用耳缘静脉空气栓塞法各处死6只动物，进行以下观测。
1.3 观测指标
1.3.1 大体观察
剖开关节腔，显露髌股关节面，观察缺损填充、边缘修复情况、软骨表面平整度、新生软骨颜色等，评价术后自发性修复效果。
1.3.2 micro-CT扫描
大体观察后对标本行micro-CT扫描，分辨率27 μm，扫描时间40 min/次。对扫描结果用标准体模校准后，以缺损区为中心，建立圆柱体（直径4 mm、高3 mm）三维兴趣区（region of interest，ROI），保证ROI内均为缺损区的修复组织。再次重建图像后输入MicroView图像分析处理软件，选取断层扫描中软骨下骨缺损最大的层面采集二维图像，对相应的ROI进行三维重建后获得三维图像，并计算软骨下骨组织形态计量学参数：骨体积分数（bone volume fraction，BVF）、骨矿物质密度（bone mineral density，BMD）、组织矿化密度（tissue mineralized density，TMD）、骨小梁厚度（trabecula thickness，Tb.Th）、骨小梁间隙宽度（trabecula spacing，Tb.Sp）、骨小梁数量（trabecula number，Tb.N）。
1.3.3 组织学及免疫组织化学染色观察
micro-CT扫描结束后用4%多聚甲醛固定标本1周，10%EDTA脱钙后，常规石蜡包埋，5 μm厚切片，行HE、番红O、甲苯胺蓝染色，并采用S-P法行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，光镜下观察，根据国际软骨修复协会（ICRS）组织学评分标准[9]评分。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；对各时间点软骨修复组织学评分与软骨下骨的组织形态计量学各参数进行Pearson相关分析；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 大体观察
实验动物切口愈合良好，无红肿及渗出。各时间点关节腔内无炎症、渗出，关节囊无增厚、挛缩，滑膜无粘连、水肿。术后1周，缺损区凹陷，被血凝块填充，与周边界限明显（图 1 a）；4周，缺损区大部分被填充，与周边仍有界限，表面不平整（图 1 b）；12周，缺损区已基本被修复组织填充，与周围软骨整合尚可，表面略粗糙，新生组织颜色暗淡（图 1 c）；24周，缺损区已完全被白色软骨样组织填充，与周围软骨整合较好，关节表面平整（图 1 d）。
图1
术后各时间点大体观察 ⓐ 1周 ⓑ 4周 ⓒ 12周 ⓓ 24周 2.2 micro-CT扫描观察
二维图像观察示，随着修复时间推移，缺损区内软骨下骨板逐渐向上迁移（图 2）。三维图像观察示，随着修复时间推移，BMD、BVF、TMD、Tb.N、Tb.Th均逐渐增加，而Tb.Sp逐渐下降，除Tb.Th术后4、12周间比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）外，其余各指标各时间点间比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见图 3、表 1。
2.3 组织学及免疫组织化学染色观察
组织学观察示，术后1周，缺损区下陷，软骨下骨未形成，基质染色无异染；4周，缺损区以纤维组织填充为主，表层不连续，交界处有裂隙，软骨基质染色浅，软骨下骨区以纤维组织为主；12周，缺损区仍以纤维软骨细胞为主，表层不规则，两侧整合良好，软骨基质染色淡，软骨下骨区出现颗粒状骨化现象；24周，修复组织以纤维软骨细胞为主，表层仍欠平滑，但在与正常软骨交界处有部分透明软骨形成，软骨基质染色中等，两侧整合良好，基质染色欠均匀，软骨厚度约为正常软骨的 2/3，软骨下骨重建加快，偶可见潮线形成或软骨下骨板重塑完成。免疫组织化学染色示，随着修复时间推移，Ⅱ型胶原染色逐渐开始表达，但24周时仍呈弱阳性。见图 4。
图4
术后各时间点组织学及免疫组织化学染色观察 （× 40） 从左至右依次为HE、番红O、甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原染色 ⓐ 1周 ⓑ 4周 ⓒ 12周 ⓓ 24周
Figure4.
Histological and immunohistochemical observations at each time point after operation (× 40) Displayed staining from left to right: HE,safranin O,toluidine blue,and collagen type Ⅱ ⓐ One week ⓑ Four weeks ⓒ Twelve weeks ⓓ Twenty-four weeks
随修复时间推移，术后标本ICRS组织学评分逐渐增加，除4周与12周比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）外，其余各时间点间比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见表 1。软骨下骨组织形态计量学参数中，除Tb.Sp与ICRS组织学评分成负相关（r= -0.584，P=0.039）外，BVF（r=0.680，P=0.042）、BMD（r=0.759，P=0.036）、TMD（r=0.792，P=0.034）、Tb.Th（r=0.714，P=0.030）及Tb.N（r=0.891，P=0.011）均与其成正相关。
表1
术后各时间点关节软骨修复组织形态计量学参数及组织学评分（n=6，3 讨论
关节软骨损伤大体分为3种类型：部分软骨损伤、全层软骨损伤和骨软骨损伤。其中部分软骨损伤只涉及关节透明软骨，全层软骨损伤则会影响到钙化软骨水平，而软骨下骨完整性是否受到破坏是骨软骨损伤的标志[2]。临床关节软骨损伤的患者中，骨软骨损伤约占5%[10]，其主要由4种独立病因引起，包括创伤性骨软骨骨折、骨关节炎、骨坏死和剥脱性骨软骨炎[11]。基于病因的多样化及其修复过程的复杂性，迄今为止，临床上虽有多种方法治疗，但仍未获得满意远期疗效。
本研究通过构建兔骨软骨缺损模型，采用连续时间点观察缺损区的自发性修复效果。结果显示，骨软骨损伤自然修复进程中，软骨下骨重塑具有显著的时序性。随着修复时间推移，骨组织形态计量学相关参数均表明软骨下骨重塑逐渐增加，微观结构存在显著变化。在修复初期，软骨下骨板位于正常位置下方，至24周时已恢复至正常水平；软骨组织的修复也随时间推移逐步改善，但最终并未恢复至正常形态，以纤维组织覆盖为主，透明软骨少见；从而表明在自发性修复模型中软骨下骨重塑与软骨再生修复的进程并不同步。另一方面，本研究也发现，关节软骨的修复与软骨下骨重塑的形态计量学各指标间均具有显著相关性。既往有研究表明[8]，兔软骨损伤模型中行软骨下骨钻孔术组比未处理组软骨下骨板显著增厚，认为这种现象是由于软骨深层的组织化生所致。另外也有研究证实[12-13]，骨软骨损伤区内的骨再生是由于新生血管形成和生长因子的作用，如TGF-β1、BMP、VEGF等。另外，Lyons等[14]指出，潮线是骨软骨界面形成的标志，对软骨下骨重塑也存在重要影响。而在本实验模型中，由于骨软骨缺损已破坏了潮线，此时损伤一般会累及骨小梁，并深达骨髓，软骨下骨渗透的血液会填充缺损区，从而启动炎性修复进程；同时局部凝血形成纤维蛋白凝集，可在修复过程中起支架作用，骨髓血中的BMSCs也将分化为软骨细胞进行修复。而这种修复方式是一种“自下而上”的修复，下层软骨下骨重塑一旦完成，上层获得的干细胞、生长因子和营养物质将逐渐减少，导致软骨修复不能顺利完成[15]。此外有临床研究显示，既往接受过骨髓刺激技术治疗的软骨损伤患者，远期会发生软骨下骨硬化，导致自体软骨细胞移植术失败率增加[16]。
组织工程技术的发展为骨软骨损伤修复提供了新选择，然而有研究报道，应用该技术修复骨软骨缺损时常伴软骨细胞的“终末分化”现象，继而出现软骨内骨化导致新生软骨退变[12, 17]。另一方面，从骨髓腔募集至缺损区的BMSCs，经常发生不可控制的分化，从而上调相关生化标志物和基质酶表达，导致软骨细胞逐渐肥大、钙化、骨化及软骨基质降解[18-19]。有学者建议，在植入关节软骨细胞或其他移植物修复骨软骨缺损时，加入抗血管生成因子chondromodulin-1和thrombospondin-1，可能防止软骨下骨的过度生长，从而促进透明软骨再生[12, 20]。由此可见，软骨下骨的变化在骨软骨损伤的发生及修复进程中扮演着重要角色[21]。
综上述，本研究结果显示，软骨修复与软骨下骨重塑既密切相关又独立发生，软骨下骨的快速重塑可能负面影响关节软骨修复效果。我们强调软骨下骨在骨软骨缺损的自然进程及修复治疗中的临床重要性，但仍需要更长期的观察及力学性能评估。下一步将致力于应用组织工程策略构建含有骨软骨界面的一体化材料，结合药物调控软骨下骨重塑进程，以促进骨软骨损伤的功能性修复。
关节软骨和软骨下骨是相互依赖又相互作用、既独立又统一的功能单位，软骨下骨承受着来自软骨向下传导的应力负荷，两者在解剖结构上紧密相连，在生物学功能上相互影响[1]。软骨下骨的完整性是否受到破坏是骨软骨损伤的标志[2]。既往研究表明，软骨下骨在骨关节炎（osteoarthritis，OA）的发生发展中与软骨退变密切联系，两种组织均发生变化且在空间结构上相关，骨量的最大改变位于骨-软骨界面处[1, 3-5]。目前已有实验研究关注到骨软骨损伤模型或进行骨髓刺激技术后发生的自发性软骨修复[6-8]，但关于两者反应关系的机制尚不明确。仅有少数动物实验研究描述了骨软骨损伤中软骨下骨板的迁移现象[6, 8]，但缺乏体内软骨下骨重塑的定量研究。因此，本实验通过监测不同时期兔骨软骨缺损自发性修复模型中软骨下骨的微观结构变化，探讨软骨下骨重塑在骨软骨损伤中的作用以及与软骨再生之间的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
6月龄健康雄性新西兰大白兔24只，体重1.8～ 2.5 kg，由解放军总医院动物实验中心提供，实验方案经解放军总医院动物实验管理委员会批准。
番红O、甲苯胺蓝染色剂（Sigma公司，美国）；鼠抗兔Ⅱ型胶原单克隆抗体（Calbiochem公司，美国）；免疫组织化学试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。BX-51显微镜、DP70图像采集系统（Olympus 公司，日本）；Locus eXplore micro-CT、MicroView图像分析处理软件（GE公司，美国）。
1.2 骨软骨缺损自发性修复模型建立
取大白兔24只，术前30 min肌肉注射抗生素。肌肉注射20%盐酸塞拉嗪注射液（2 mL/kg）麻醉，沿单侧膝部髌骨内侧缘行2 cm纵切口，将髌骨牵向外侧，显露髌股关节面。检查膝关节腔无积液或粘连，关节软骨平坦、色泽正常后，用直径4 mm环钻在膝关节屈曲90°时髌骨所对应股骨内、外侧髁间关节面中部作一直径4 mm、深约3 mm的骨软骨缺损。术中见缺损区出血即可，不作任何干预，将髌骨复位后，逐层闭合关节囊和皮肤切口。术后动物单笼饲养，不行术肢外固定，自由活动、取食；术后第 2 天使用抗生素，防止腹泻及感染。于术后1、4、12、24周，采用耳缘静脉空气栓塞法各处死6只动物，进行以下观测。
1.3 观测指标
1.3.1 大体观察
剖开关节腔，显露髌股关节面，观察缺损填充、边缘修复情况、软骨表面平整度、新生软骨颜色等，评价术后自发性修复效果。
1.3.2 micro-CT扫描
大体观察后对标本行micro-CT扫描，分辨率27 μm，扫描时间40 min/次。对扫描结果用标准体模校准后，以缺损区为中心，建立圆柱体（直径4 mm、高3 mm）三维兴趣区（region of interest，ROI），保证ROI内均为缺损区的修复组织。再次重建图像后输入MicroView图像分析处理软件，选取断层扫描中软骨下骨缺损最大的层面采集二维图像，对相应的ROI进行三维重建后获得三维图像，并计算软骨下骨组织形态计量学参数：骨体积分数（bone volume fraction，BVF）、骨矿物质密度（bone mineral density，BMD）、组织矿化密度（tissue mineralized density，TMD）、骨小梁厚度（trabecula thickness，Tb.Th）、骨小梁间隙宽度（trabecula spacing，Tb.Sp）、骨小梁数量（trabecula number，Tb.N）。
1.3.3 组织学及免疫组织化学染色观察
micro-CT扫描结束后用4%多聚甲醛固定标本1周，10%EDTA脱钙后，常规石蜡包埋，5 μm厚切片，行HE、番红O、甲苯胺蓝染色，并采用S-P法行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，光镜下观察，根据国际软骨修复协会（ICRS）组织学评分标准[9]评分。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；对各时间点软骨修复组织学评分与软骨下骨的组织形态计量学各参数进行Pearson相关分析；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 大体观察
实验动物切口愈合良好，无红肿及渗出。各时间点关节腔内无炎症、渗出，关节囊无增厚、挛缩，滑膜无粘连、水肿。术后1周，缺损区凹陷，被血凝块填充，与周边界限明显（图 1 a）；4周，缺损区大部分被填充，与周边仍有界限，表面不平整（图 1 b）；12周，缺损区已基本被修复组织填充，与周围软骨整合尚可，表面略粗糙，新生组织颜色暗淡（图 1 c）；24周，缺损区已完全被白色软骨样组织填充，与周围软骨整合较好，关节表面平整（图 1 d）。
图1
术后各时间点大体观察 ⓐ 1周 ⓑ 4周 ⓒ 12周 ⓓ 24周 2.2 micro-CT扫描观察
二维图像观察示，随着修复时间推移，缺损区内软骨下骨板逐渐向上迁移（图 2）。三维图像观察示，随着修复时间推移，BMD、BVF、TMD、Tb.N、Tb.Th均逐渐增加，而Tb.Sp逐渐下降，除Tb.Th术后4、12周间比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）外，其余各指标各时间点间比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见图 3、表 1。
2.3 组织学及免疫组织化学染色观察
组织学观察示，术后1周，缺损区下陷，软骨下骨未形成，基质染色无异染；4周，缺损区以纤维组织填充为主，表层不连续，交界处有裂隙，软骨基质染色浅，软骨下骨区以纤维组织为主；12周，缺损区仍以纤维软骨细胞为主，表层不规则，两侧整合良好，软骨基质染色淡，软骨下骨区出现颗粒状骨化现象；24周，修复组织以纤维软骨细胞为主，表层仍欠平滑，但在与正常软骨交界处有部分透明软骨形成，软骨基质染色中等，两侧整合良好，基质染色欠均匀，软骨厚度约为正常软骨的 2/3，软骨下骨重建加快，偶可见潮线形成或软骨下骨板重塑完成。免疫组织化学染色示，随着修复时间推移，Ⅱ型胶原染色逐渐开始表达，但24周时仍呈弱阳性。见图 4。
图4
术后各时间点组织学及免疫组织化学染色观察 （× 40） 从左至右依次为HE、番红O、甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原染色 ⓐ 1周 ⓑ 4周 ⓒ 12周 ⓓ 24周
Figure4.
Histological and immunohistochemical observations at each time point after operation (× 40) Displayed staining from left to right: HE,safranin O,toluidine blue,and collagen type Ⅱ ⓐ One week ⓑ Four weeks ⓒ Twelve weeks ⓓ Twenty-four weeks
随修复时间推移，术后标本ICRS组织学评分逐渐增加，除4周与12周比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）外，其余各时间点间比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见表 1。软骨下骨组织形态计量学参数中，除Tb.Sp与ICRS组织学评分成负相关（r= -0.584，P=0.039）外，BVF（r=0.680，P=0.042）、BMD（r=0.759，P=0.036）、TMD（r=0.792，P=0.034）、Tb.Th（r=0.714，P=0.030）及Tb.N（r=0.891，P=0.011）均与其成正相关。
表1
术后各时间点关节软骨修复组织形态计量学参数及组织学评分（n=6，3 讨论
关节软骨损伤大体分为3种类型：部分软骨损伤、全层软骨损伤和骨软骨损伤。其中部分软骨损伤只涉及关节透明软骨，全层软骨损伤则会影响到钙化软骨水平，而软骨下骨完整性是否受到破坏是骨软骨损伤的标志[2]。临床关节软骨损伤的患者中，骨软骨损伤约占5%[10]，其主要由4种独立病因引起，包括创伤性骨软骨骨折、骨关节炎、骨坏死和剥脱性骨软骨炎[11]。基于病因的多样化及其修复过程的复杂性，迄今为止，临床上虽有多种方法治疗，但仍未获得满意远期疗效。
本研究通过构建兔骨软骨缺损模型，采用连续时间点观察缺损区的自发性修复效果。结果显示，骨软骨损伤自然修复进程中，软骨下骨重塑具有显著的时序性。随着修复时间推移，骨组织形态计量学相关参数均表明软骨下骨重塑逐渐增加，微观结构存在显著变化。在修复初期，软骨下骨板位于正常位置下方，至24周时已恢复至正常水平；软骨组织的修复也随时间推移逐步改善，但最终并未恢复至正常形态，以纤维组织覆盖为主，透明软骨少见；从而表明在自发性修复模型中软骨下骨重塑与软骨再生修复的进程并不同步。另一方面，本研究也发现，关节软骨的修复与软骨下骨重塑的形态计量学各指标间均具有显著相关性。既往有研究表明[8]，兔软骨损伤模型中行软骨下骨钻孔术组比未处理组软骨下骨板显著增厚，认为这种现象是由于软骨深层的组织化生所致。另外也有研究证实[12-13]，骨软骨损伤区内的骨再生是由于新生血管形成和生长因子的作用，如TGF-β1、BMP、VEGF等。另外，Lyons等[14]指出，潮线是骨软骨界面形成的标志，对软骨下骨重塑也存在重要影响。而在本实验模型中，由于骨软骨缺损已破坏了潮线，此时损伤一般会累及骨小梁，并深达骨髓，软骨下骨渗透的血液会填充缺损区，从而启动炎性修复进程；同时局部凝血形成纤维蛋白凝集，可在修复过程中起支架作用，骨髓血中的BMSCs也将分化为软骨细胞进行修复。而这种修复方式是一种“自下而上”的修复，下层软骨下骨重塑一旦完成，上层获得的干细胞、生长因子和营养物质将逐渐减少，导致软骨修复不能顺利完成[15]。此外有临床研究显示，既往接受过骨髓刺激技术治疗的软骨损伤患者，远期会发生软骨下骨硬化，导致自体软骨细胞移植术失败率增加[16]。
组织工程技术的发展为骨软骨损伤修复提供了新选择，然而有研究报道，应用该技术修复骨软骨缺损时常伴软骨细胞的“终末分化”现象，继而出现软骨内骨化导致新生软骨退变[12, 17]。另一方面，从骨髓腔募集至缺损区的BMSCs，经常发生不可控制的分化，从而上调相关生化标志物和基质酶表达，导致软骨细胞逐渐肥大、钙化、骨化及软骨基质降解[18-19]。有学者建议，在植入关节软骨细胞或其他移植物修复骨软骨缺损时，加入抗血管生成因子chondromodulin-1和thrombospondin-1，可能防止软骨下骨的过度生长，从而促进透明软骨再生[12, 20]。由此可见，软骨下骨的变化在骨软骨损伤的发生及修复进程中扮演着重要角色[21]。
综上述，本研究结果显示，软骨修复与软骨下骨重塑既密切相关又独立发生，软骨下骨的快速重塑可能负面影响关节软骨修复效果。我们强调软骨下骨在骨软骨缺损的自然进程及修复治疗中的临床重要性，但仍需要更长期的观察及力学性能评估。下一步将致力于应用组织工程策略构建含有骨软骨界面的一体化材料，结合药物调控软骨下骨重塑进程，以促进骨软骨损伤的功能性修复。
