引用本文： 李浙峰, 高伟阳, 陈时益, 李俊杰, 闫合德, 李志杰, 林丁盛. 吡格列酮药物延迟对大鼠跨区穿支皮瓣成活的影响. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(6): 701-706. doi: 10.7507/1002-1892.20140155 复制
某一源动脉呈树形分布的所有解剖学区域，包括皮肤、浅筋膜、深筋膜及其深层的各种组织称为血管体[1]，这些血管体的定位常被外科医生用于设计皮瓣。Cormack等[2]将皮瓣血管体分为3个区域：来自源动脉的解剖区、紧靠解剖区的动力区以及紧靠动力区的潜在区。choke血管指联系相邻血管体区域之间、管径逐渐变细的血管，是跨区穿支皮瓣获得血供的必经之路。因此，choke血管对穿支皮瓣，尤其是跨区穿支皮瓣的成活至关重要。目前关于choke血管扩张及形态学变化的了解大多来源于对手术延迟机制的研究[3-5]。随着皮瓣延迟方法的改进，药物延迟以安全、创伤小、痛苦小等优点逐渐成为皮瓣延迟的研究热点[6-7]。但关于药物延迟对choke血管的影响，目前研究甚少。
过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ）激动剂最先应用于糖尿病治疗领域，但研究表明这些激动剂对缺血再灌注以及炎症同样有效[8-9]。吡格列酮是一种PPAR-γ激动剂，它可同时调控NO生成及VEGF表达，促进血管扩张和血管新生，从而改善组织缺血[10-11]。本研究通过观察吡格列酮药物延迟对大鼠背部跨区穿支皮瓣成活及choke血管的影响，探讨其作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
清洁级健康雄性SD大鼠70只，体重250～ 300 g，由温州医科大学实验动物中心提供。吡格列酮（北京太阳药业有限公司）；红色氧化铅（上海化学试剂总厂）；小鼠抗大鼠VEGF抗体（Santa Cruz公司，美国）；山羊抗小鼠二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；NO试剂盒（南京建成生物工程研究所）。M2 Image Analysis System软件（Imaging Research公司，加拿大）；Image-Pro Plus v6.0软件（Media Cybernetics公司，美国）；Master Prep生物匀浆机（湖州海创生物科技有限公司）。
1.2 实验分组及方法
将70只大鼠随机分为吡格列酮组（实验组）和生理盐水组（对照组），每组35只。按照Miyamoto 等[12]的方法，在两组大鼠背部右侧建立以一侧旋髂深动脉穿支为蒂的三血管体穿支皮瓣，包括两个choke血管区域。实验组术前按照10 mg/（kg·d）剂量取吡格列酮，溶于1.5 mL生理盐水，连续灌胃5 d，最后1次灌胃于术前2 h完成[13]；对照组同时间点给予等量生理盐水。所有动物腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉，在背部右侧以后正中线为内侧缘，髂后上棘连线为下界，肩胛下角为上界，设计大小为9.0 cm × 2.5 cm皮瓣；切开皮肤后在深筋膜层完全游离皮瓣，皮瓣掀起后，用4-0慕斯线原位缝合（图 1）。
图1
大鼠背部皮瓣模型 ⓐ 皮瓣切取 DCI：旋髂深动脉穿支 IC：肋间后动脉穿支 TD：胸背动脉穿支 ⓑ 皮瓣原位缝合 1.3 观测指标
1.3.1 大体观察
术后肉眼观察皮瓣成活状况，包括皮瓣颜色、组织弹性、质地及坏死发生情况等。皮瓣坏死标准[14]：颜色发黑，组织回缩、弹性差，质地坚硬，切割组织不出血。术后7 d两组实验动物同上法麻醉后，皮瓣照相并导入M2 Image Analysis System软件，计算皮瓣成活面积百分比。
1.3.2 皮瓣血管造影观察
术后7 d两组各取5只实验动物进行皮瓣血管造影术。同上法麻醉后，取仰卧位固定，分离一侧颈动脉，将留置针穿入颈动脉，排尽大鼠体内血液，同时注入1%肝素1.5 mL；将配置的明胶-氧化铅混合物（40～50 L/ kg）注入颈动脉，待大鼠巩膜及四肢末端出现点状、斑片状灌注液颜色时，停止灌注。然后置于4℃冰箱冷藏过夜，以便明胶凝结。隔日解剖分离皮瓣，平铺摄X线片（40 kV、5 mA、0.1 s 曝光时间）。观察皮瓣成活区与坏死区的血管结构以及相连血管体之间choke血管扩张情况的变化，计数choke Ⅰ、Ⅱ区真性吻合数。
1.3.3 组织学观察
术后7 d两组各取5只实验动物，过量麻醉处死后，取chokeⅡ区中央区域的皮瓣组织，大小约2.0 cm × 0.5 cm，置于10%甲醛溶液固定，常规脱水包埋，3～4 μm厚切片，取部分切片行HE染色。光镜下观察肉芽组织层厚度、组织水肿、坏死、炎性细胞浸润等情况。在低倍镜下找到微血管密集区，然后在20 × 10倍镜下随意选取5个视野，计数血管数，取均值，计算单位面积微血管数目（个/mm2），作为评价微血管密度（microvessel density，MVD）的指标。
1.3.4 免疫组织化学染色观察
取其余部分切片采用二步法行免疫组织化学染色，检测VEGF表达及分布情况。呈棕黄色颗粒为阳性表达，选择染色均匀的区域，于40 × 10倍光镜下进行观察，每张切片取5个视野照相。将图片导入Image-Pro Plus v6.0软件，测量图片阳性表达的积分吸光度（IA）值，作为评价VEGF表达的指标。
1.3.5 NO表达测定
分别于术后即刻（术后1 h内）及1、3、5、7 d，两组各取5只实验动物，过量麻醉处死后，取chokeⅠ区及Ⅱ区中央区域皮瓣组织（大小为0.5 cm × 0.5 cm），采用生物匀浆机匀浆组织。按照NO试剂盒说明书，采用硝酸酶还原法测定组织NO含量。
1.4 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；组内比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 大体观察
两组大鼠均存活至实验完成。术后两组皮瓣大体变化相似，1 d时皮瓣均出现不同程度肿胀，皮瓣远端呈暗紫色，但无明显坏死；3 d时皮瓣远端出现局部灶状、小片状坏死，坏死部分多呈红褐色，有瘀血；7 d时皮瓣远端坏死部分均趋于融合，有黑色痂壳，质硬，呈干性坏死，界线清晰（图 2）。掀起皮瓣观察，坏死组织位于潜在区。术后7 d实验组皮瓣成活面积百分比为87.73% ± 3.25%，显著高于对照组的76.07% ± 2.92%，差异有统计学意义（t= -10.338，P=0.000）。
2.2 皮瓣血管造影观察
对照组：皮瓣蒂部穿支与肋间后动脉穿支之间相连的chokeⅠ区choke血管出现部分扩张，部分管径逐渐减小的choke血管吻合变成管径不减小的真性吻合；而chokeⅡ区的choke血管扩张不明显，潜在区血管结构较紊乱，远端坏死区显示胸背动脉穿支在入皮点附近及远端部分血管结构紊乱或消失。实验组：各供区血管结构较完整，chokeⅡ区血管结构清晰；chokeⅠ、Ⅱ区出现了大量真性吻合；远端坏死区显示胸背动脉穿支入皮点以远血管结构仅部分紊乱或消失（图 3）。实验组chokeⅠ、Ⅱ区真性吻合数分别为（5.40 ± 1.14）、（3.00 ± 0.71）个，显著高于对照组的（3.20 ± 0.84）、（0.80 ± 0.84）个，比较差异均有统计学意义（t= -3.479，P=0.008；t= -4.491，P=0.002）。
2.3 组织学观察
镜下观察示，与对照组相比，实验组chokeⅡ区组织轻度水肿，炎性细胞浸润较轻，肉芽组织较少，皮肤附属器存在，并见大量新生血管（图 4）。实验组和对照组MVD分别为（33.16 ± 7.73）、（23.29 ± 5.91） 个 / mm2，比较差异有统计学意义（t=5.073，P=0.000）。
图4
术后7 d两组皮瓣HE染色观察 ⓐ 实验组（× 40） ⓑ 实验组（× 200） ⓒ 对照组（× 40） ⓓ 对照组（× 200） 2.4 免疫组织化学染色观察
镜下观察示实验组chokeⅡ区的VEGF表达较强，对照组表达相对较弱，见图 5。实验组和对照组chokeⅡ区IA值分别为4 368.80 ± 458.23和2 241.24 ± 554.43，比较差异有统计学意义（t= -14.789，P=0.000）。
2.5 NO含量检测
除术后即刻外，其余各时间点实验组chokeⅠ、Ⅱ区NO含量均显著高于对照组，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。两组chokeⅠ区NO含量变化趋势一致，术后即刻开始逐渐升高，至3 d达峰值，之后逐渐下降，组内各时间点间比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。实验组chokeⅡ区NO含量变化趋势与Ⅰ区一致，除术后即刻外，组内各时间点间比较差异有统计学意义（P＜ 0.05）；对照组chokeⅡ区术后即刻NO含量即开始升高，1 d时达峰值，之后逐渐下降，组内各时间点间比较差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见图 6。
图6
术后各时间点两组NO含量 chokeⅠ区 chokeⅡ区
Figure6.
The content of NO in 2 groups after operation choke zone Ⅰ choke zone Ⅱ
3 讨论
药物延迟的目的是在皮瓣暴露于缺血时可诱导其反应，提高皮瓣成活率。choke血管是连接相连穿支血管体的桥梁，但其并未闭塞，而是管径逐渐减小的吻合血管。解剖学研究显示[12]，将皮瓣由解剖区向动力区乃至潜在区延伸，有望获取较大面积甚至巨大皮瓣的可能。但是，其必要前提是采取某种有效方法使这3 个不同供区之间的吻合血管开放、扩张及血管新生，进而建立新的血液循环体系，使3个不同的小供区变成1 个大供区。
NO在扩张血管、改善微循环及缺血再灌注损伤中起重要作用[15-16]。并且，皮瓣远端低血流量及坏死部分更依赖NO扩张血管的效应[17]。McDonald等[18]研究发现，NO在延迟皮瓣微循环中发挥了重要作用，它可以扩张choke血管，主要通过扩张血管和增加血流量来提高皮瓣成活率。而PPAR-γ激动剂可以直接改善血管内皮细胞功能及调控NO的产生[19]。本研究结果显示，除术后即刻外，其余各时间点实验组NO含量均较对照组明显提高；皮瓣血管造影显示在choke区，实验组较对照组出现了大量的真性吻合，而这种choke血管的扩张可能同样来自NO的作用。
Dhar等[3]报道choke血管的扩张主要在术后早期发生，皮瓣掀起后choke血管首先是短暂的血管痉挛，然后血管管径逐渐扩张，2～3 d时扩张最明显，3～7 d趋于平稳。2012年，Zhuang等[20]通过皮窗技术在活体下动态观察chokeⅠ区choke血管形态学变化，发现choke血管于术后（60 ± 12）h发生管径扩张，之后持续扩张，（5.0 ± 0.5）d时管径达峰值，之后趋于平稳。以上研究结果表明，术后choke血管管径变化是一连续过程。为探讨NO对choke血管扩张的作用，本研究选择术后连续时间点测量NO含量。结果表明，实验组及对照组chokeⅠ区的NO含量均在术后即刻开始升高，3 d时达峰值；而在chokeⅡ区，对照组术后1 d达高峰后即下降，经吡格列酮药物延迟处理后的实验组NO高水平则维持在1～3 d。提示吡格列酮对皮瓣的延迟作用主要是在早期通过提高NO含量扩张choke血管，从而改善潜在区的血流灌注完成。
VEGF是调节血管新生的关键因子[21]，皮瓣移植术后VEGF表达水平与MVD成正相关，VEGF的表达可间接反映血供重建情况[22]。研究表明，体外应用VEGF局部促血管新生或应用药物促进内源性VEGF释放，均可改善皮瓣的成活 [23-24]。近年来，越来越多研究显示，PPAR-γ激动剂可促进VEGF表达而参与调节血管新生[11, 25]。跨区穿支皮瓣坏死常发生在潜在区[4, 26]，从而限制了该皮瓣的扩大切取。而chokeⅡ区正是联系动力区及潜在区之间的choke血管吻合区，其变化可能直接影响潜在区的成活。本研究中实验组chokeⅡ区血管新生及VEGF的表达较对照组有明显提高，提示吡格列酮可能是通过促进内源性VEGF释放，有效刺激了choke Ⅱ区的血管新生，从而改善了潜在区的成活。
综上述，本研究结果提示应用吡格列酮药物延迟能有效刺激大鼠背部跨区穿支皮瓣新生血管增生，扩张choke血管改善皮瓣血供，从而促进了跨区穿支皮瓣潜在区的成活。但本研究仅探讨了吡格列酮药物延迟后皮瓣NO、VEGF的表达情况，以及NO对choke血管变化的影响，对于PPAR-γ表达与NO、VEGF表达的关系有待进一步明确。此外，本研究仅观察了术后7 d chokeⅡ区VEGF表达情况，但术后VEGF表达也应是动态表达过程，因此下一步研究需要采用Western blot法或PCR法进行多时间点VEGF、NO、 PPAR-γ动态表达定量检测，进一步阐述吡格列酮药物延迟后PPAR-γ表达与NO、VEGF的关系。
某一源动脉呈树形分布的所有解剖学区域，包括皮肤、浅筋膜、深筋膜及其深层的各种组织称为血管体[1]，这些血管体的定位常被外科医生用于设计皮瓣。Cormack等[2]将皮瓣血管体分为3个区域：来自源动脉的解剖区、紧靠解剖区的动力区以及紧靠动力区的潜在区。choke血管指联系相邻血管体区域之间、管径逐渐变细的血管，是跨区穿支皮瓣获得血供的必经之路。因此，choke血管对穿支皮瓣，尤其是跨区穿支皮瓣的成活至关重要。目前关于choke血管扩张及形态学变化的了解大多来源于对手术延迟机制的研究[3-5]。随着皮瓣延迟方法的改进，药物延迟以安全、创伤小、痛苦小等优点逐渐成为皮瓣延迟的研究热点[6-7]。但关于药物延迟对choke血管的影响，目前研究甚少。
过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ）激动剂最先应用于糖尿病治疗领域，但研究表明这些激动剂对缺血再灌注以及炎症同样有效[8-9]。吡格列酮是一种PPAR-γ激动剂，它可同时调控NO生成及VEGF表达，促进血管扩张和血管新生，从而改善组织缺血[10-11]。本研究通过观察吡格列酮药物延迟对大鼠背部跨区穿支皮瓣成活及choke血管的影响，探讨其作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
清洁级健康雄性SD大鼠70只，体重250～ 300 g，由温州医科大学实验动物中心提供。吡格列酮（北京太阳药业有限公司）；红色氧化铅（上海化学试剂总厂）；小鼠抗大鼠VEGF抗体（Santa Cruz公司，美国）；山羊抗小鼠二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；NO试剂盒（南京建成生物工程研究所）。M2 Image Analysis System软件（Imaging Research公司，加拿大）；Image-Pro Plus v6.0软件（Media Cybernetics公司，美国）；Master Prep生物匀浆机（湖州海创生物科技有限公司）。
1.2 实验分组及方法
将70只大鼠随机分为吡格列酮组（实验组）和生理盐水组（对照组），每组35只。按照Miyamoto 等[12]的方法，在两组大鼠背部右侧建立以一侧旋髂深动脉穿支为蒂的三血管体穿支皮瓣，包括两个choke血管区域。实验组术前按照10 mg/（kg·d）剂量取吡格列酮，溶于1.5 mL生理盐水，连续灌胃5 d，最后1次灌胃于术前2 h完成[13]；对照组同时间点给予等量生理盐水。所有动物腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉，在背部右侧以后正中线为内侧缘，髂后上棘连线为下界，肩胛下角为上界，设计大小为9.0 cm × 2.5 cm皮瓣；切开皮肤后在深筋膜层完全游离皮瓣，皮瓣掀起后，用4-0慕斯线原位缝合（图 1）。
图1
大鼠背部皮瓣模型 ⓐ 皮瓣切取 DCI：旋髂深动脉穿支 IC：肋间后动脉穿支 TD：胸背动脉穿支 ⓑ 皮瓣原位缝合 1.3 观测指标
1.3.1 大体观察
术后肉眼观察皮瓣成活状况，包括皮瓣颜色、组织弹性、质地及坏死发生情况等。皮瓣坏死标准[14]：颜色发黑，组织回缩、弹性差，质地坚硬，切割组织不出血。术后7 d两组实验动物同上法麻醉后，皮瓣照相并导入M2 Image Analysis System软件，计算皮瓣成活面积百分比。
1.3.2 皮瓣血管造影观察
术后7 d两组各取5只实验动物进行皮瓣血管造影术。同上法麻醉后，取仰卧位固定，分离一侧颈动脉，将留置针穿入颈动脉，排尽大鼠体内血液，同时注入1%肝素1.5 mL；将配置的明胶-氧化铅混合物（40～50 L/ kg）注入颈动脉，待大鼠巩膜及四肢末端出现点状、斑片状灌注液颜色时，停止灌注。然后置于4℃冰箱冷藏过夜，以便明胶凝结。隔日解剖分离皮瓣，平铺摄X线片（40 kV、5 mA、0.1 s 曝光时间）。观察皮瓣成活区与坏死区的血管结构以及相连血管体之间choke血管扩张情况的变化，计数choke Ⅰ、Ⅱ区真性吻合数。
1.3.3 组织学观察
术后7 d两组各取5只实验动物，过量麻醉处死后，取chokeⅡ区中央区域的皮瓣组织，大小约2.0 cm × 0.5 cm，置于10%甲醛溶液固定，常规脱水包埋，3～4 μm厚切片，取部分切片行HE染色。光镜下观察肉芽组织层厚度、组织水肿、坏死、炎性细胞浸润等情况。在低倍镜下找到微血管密集区，然后在20 × 10倍镜下随意选取5个视野，计数血管数，取均值，计算单位面积微血管数目（个/mm2），作为评价微血管密度（microvessel density，MVD）的指标。
1.3.4 免疫组织化学染色观察
取其余部分切片采用二步法行免疫组织化学染色，检测VEGF表达及分布情况。呈棕黄色颗粒为阳性表达，选择染色均匀的区域，于40 × 10倍光镜下进行观察，每张切片取5个视野照相。将图片导入Image-Pro Plus v6.0软件，测量图片阳性表达的积分吸光度（IA）值，作为评价VEGF表达的指标。
1.3.5 NO表达测定
分别于术后即刻（术后1 h内）及1、3、5、7 d，两组各取5只实验动物，过量麻醉处死后，取chokeⅠ区及Ⅱ区中央区域皮瓣组织（大小为0.5 cm × 0.5 cm），采用生物匀浆机匀浆组织。按照NO试剂盒说明书，采用硝酸酶还原法测定组织NO含量。
1.4 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；组内比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 大体观察
两组大鼠均存活至实验完成。术后两组皮瓣大体变化相似，1 d时皮瓣均出现不同程度肿胀，皮瓣远端呈暗紫色，但无明显坏死；3 d时皮瓣远端出现局部灶状、小片状坏死，坏死部分多呈红褐色，有瘀血；7 d时皮瓣远端坏死部分均趋于融合，有黑色痂壳，质硬，呈干性坏死，界线清晰（图 2）。掀起皮瓣观察，坏死组织位于潜在区。术后7 d实验组皮瓣成活面积百分比为87.73% ± 3.25%，显著高于对照组的76.07% ± 2.92%，差异有统计学意义（t= -10.338，P=0.000）。
2.2 皮瓣血管造影观察
对照组：皮瓣蒂部穿支与肋间后动脉穿支之间相连的chokeⅠ区choke血管出现部分扩张，部分管径逐渐减小的choke血管吻合变成管径不减小的真性吻合；而chokeⅡ区的choke血管扩张不明显，潜在区血管结构较紊乱，远端坏死区显示胸背动脉穿支在入皮点附近及远端部分血管结构紊乱或消失。实验组：各供区血管结构较完整，chokeⅡ区血管结构清晰；chokeⅠ、Ⅱ区出现了大量真性吻合；远端坏死区显示胸背动脉穿支入皮点以远血管结构仅部分紊乱或消失（图 3）。实验组chokeⅠ、Ⅱ区真性吻合数分别为（5.40 ± 1.14）、（3.00 ± 0.71）个，显著高于对照组的（3.20 ± 0.84）、（0.80 ± 0.84）个，比较差异均有统计学意义（t= -3.479，P=0.008；t= -4.491，P=0.002）。
2.3 组织学观察
镜下观察示，与对照组相比，实验组chokeⅡ区组织轻度水肿，炎性细胞浸润较轻，肉芽组织较少，皮肤附属器存在，并见大量新生血管（图 4）。实验组和对照组MVD分别为（33.16 ± 7.73）、（23.29 ± 5.91） 个 / mm2，比较差异有统计学意义（t=5.073，P=0.000）。
图4
术后7 d两组皮瓣HE染色观察 ⓐ 实验组（× 40） ⓑ 实验组（× 200） ⓒ 对照组（× 40） ⓓ 对照组（× 200） 2.4 免疫组织化学染色观察
镜下观察示实验组chokeⅡ区的VEGF表达较强，对照组表达相对较弱，见图 5。实验组和对照组chokeⅡ区IA值分别为4 368.80 ± 458.23和2 241.24 ± 554.43，比较差异有统计学意义（t= -14.789，P=0.000）。
2.5 NO含量检测
除术后即刻外，其余各时间点实验组chokeⅠ、Ⅱ区NO含量均显著高于对照组，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。两组chokeⅠ区NO含量变化趋势一致，术后即刻开始逐渐升高，至3 d达峰值，之后逐渐下降，组内各时间点间比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。实验组chokeⅡ区NO含量变化趋势与Ⅰ区一致，除术后即刻外，组内各时间点间比较差异有统计学意义（P＜ 0.05）；对照组chokeⅡ区术后即刻NO含量即开始升高，1 d时达峰值，之后逐渐下降，组内各时间点间比较差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见图 6。
图6
术后各时间点两组NO含量 chokeⅠ区 chokeⅡ区
Figure6.
The content of NO in 2 groups after operation choke zone Ⅰ choke zone Ⅱ
3 讨论
药物延迟的目的是在皮瓣暴露于缺血时可诱导其反应，提高皮瓣成活率。choke血管是连接相连穿支血管体的桥梁，但其并未闭塞，而是管径逐渐减小的吻合血管。解剖学研究显示[12]，将皮瓣由解剖区向动力区乃至潜在区延伸，有望获取较大面积甚至巨大皮瓣的可能。但是，其必要前提是采取某种有效方法使这3 个不同供区之间的吻合血管开放、扩张及血管新生，进而建立新的血液循环体系，使3个不同的小供区变成1 个大供区。
NO在扩张血管、改善微循环及缺血再灌注损伤中起重要作用[15-16]。并且，皮瓣远端低血流量及坏死部分更依赖NO扩张血管的效应[17]。McDonald等[18]研究发现，NO在延迟皮瓣微循环中发挥了重要作用，它可以扩张choke血管，主要通过扩张血管和增加血流量来提高皮瓣成活率。而PPAR-γ激动剂可以直接改善血管内皮细胞功能及调控NO的产生[19]。本研究结果显示，除术后即刻外，其余各时间点实验组NO含量均较对照组明显提高；皮瓣血管造影显示在choke区，实验组较对照组出现了大量的真性吻合，而这种choke血管的扩张可能同样来自NO的作用。
Dhar等[3]报道choke血管的扩张主要在术后早期发生，皮瓣掀起后choke血管首先是短暂的血管痉挛，然后血管管径逐渐扩张，2～3 d时扩张最明显，3～7 d趋于平稳。2012年，Zhuang等[20]通过皮窗技术在活体下动态观察chokeⅠ区choke血管形态学变化，发现choke血管于术后（60 ± 12）h发生管径扩张，之后持续扩张，（5.0 ± 0.5）d时管径达峰值，之后趋于平稳。以上研究结果表明，术后choke血管管径变化是一连续过程。为探讨NO对choke血管扩张的作用，本研究选择术后连续时间点测量NO含量。结果表明，实验组及对照组chokeⅠ区的NO含量均在术后即刻开始升高，3 d时达峰值；而在chokeⅡ区，对照组术后1 d达高峰后即下降，经吡格列酮药物延迟处理后的实验组NO高水平则维持在1～3 d。提示吡格列酮对皮瓣的延迟作用主要是在早期通过提高NO含量扩张choke血管，从而改善潜在区的血流灌注完成。
VEGF是调节血管新生的关键因子[21]，皮瓣移植术后VEGF表达水平与MVD成正相关，VEGF的表达可间接反映血供重建情况[22]。研究表明，体外应用VEGF局部促血管新生或应用药物促进内源性VEGF释放，均可改善皮瓣的成活 [23-24]。近年来，越来越多研究显示，PPAR-γ激动剂可促进VEGF表达而参与调节血管新生[11, 25]。跨区穿支皮瓣坏死常发生在潜在区[4, 26]，从而限制了该皮瓣的扩大切取。而chokeⅡ区正是联系动力区及潜在区之间的choke血管吻合区，其变化可能直接影响潜在区的成活。本研究中实验组chokeⅡ区血管新生及VEGF的表达较对照组有明显提高，提示吡格列酮可能是通过促进内源性VEGF释放，有效刺激了choke Ⅱ区的血管新生，从而改善了潜在区的成活。
综上述，本研究结果提示应用吡格列酮药物延迟能有效刺激大鼠背部跨区穿支皮瓣新生血管增生，扩张choke血管改善皮瓣血供，从而促进了跨区穿支皮瓣潜在区的成活。但本研究仅探讨了吡格列酮药物延迟后皮瓣NO、VEGF的表达情况，以及NO对choke血管变化的影响，对于PPAR-γ表达与NO、VEGF表达的关系有待进一步明确。此外，本研究仅观察了术后7 d chokeⅡ区VEGF表达情况，但术后VEGF表达也应是动态表达过程，因此下一步研究需要采用Western blot法或PCR法进行多时间点VEGF、NO、 PPAR-γ动态表达定量检测，进一步阐述吡格列酮药物延迟后PPAR-γ表达与NO、VEGF的关系。
