引用本文： 魏富鑫, 钟锐, 王乐, 崔尚斌, 刘少喻, 邹学农, 周治宇, 梁子建. 雌性恒河猴腰椎骨密度与椎间盘退变的相关关系分析. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(6): 718-722. doi: 10.7507/1002-1892.20140160 复制
临床研究表明脊柱退变常伴发骨质疏松，但关于骨质疏松与腰椎间盘退变间的相关性及其相互影响机制仍不清楚[1-4]。有学者通过大鼠实验发现，椎间盘退变与骨质疏松可能存在负相关[5]。但也有研究显示，骨质疏松与椎间盘退变间无明显相关性[6]。以上研究结果差异可能与导致骨质疏松与椎间盘退变的影响因素众多，以及目前缺乏与人类椎间盘退变过程相近的动物模型进行研究有关。直立爬行的灵长类动物恒河猴由于有接近人类的解剖生理，已用于脊柱退变动物模型构建研究。另外，近年出现的T1ρ-MRI技术可用于测量组织中蛋白多糖的含量，为量化评价椎间盘退变奠定了基础[7]。本研究拟采用恒河猴为实验动物，结合T1ρ-MRI技术分析并阐述骨密度与腰椎间盘退变的相关关系，为探讨骨质疏松以及腰椎退变性疾病的病因、发病机制提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要仪器
正常成年雌性恒河猴20只，年龄4～20岁，平均10.9岁；其中4～8岁6只、8～12岁5只、12～15岁5只、15～20岁4只。体重5.3～10.8 kg，平均7.4 kg。由广东蓝岛动物实验中心提供。单笼饲养，室温控制在25℃左右，正常光照，混合人工饲料加水果、蔬菜适应性饲养半年。
Osteocore双能X线骨密度测定仪（MEDILINK公司，法国）；1.5 Tesla 磁共振仪（Philips公司，荷兰）。
1.2 实验方法
1.2.1 骨密度测量
取20只实验动物，肌肉注射地西泮（2.5 mg/kg）和氯胺酮（10 mg/kg）混合麻醉。采用Osteocore双能X线骨密度测定仪，前后位法测量L4、5椎体及双髋ward三角区骨密度（g/cm2）。仪器由计算机控制，自动定位、测量和存储数据，重复测量误差 ＜ 1%。取L4、5椎体骨密度平均值作为腰椎骨密度值，双髋ward三角区骨密度平均值作为髋骨ward三角区骨密度值。
1.2.2 MRI测量
使用1.5 Tesla 磁共振仪进行L4、5椎间盘扫描，采用8通道腰椎线圈。T1WI和T2WI采用快速自旋回波脉冲序列，T2-mapping技术处理前的T2WI图像采集采用多回波自旋回波序列，T1ρ-mapping采用快速自旋锁定脉冲序列，动态增强MRI采用矢状位T1脂肪抑制快速自旋回波序列。扫描参数：T1WI：回波时间（time of echo，TE）12 ms，脉冲重复时间（time of repetition，TR）540 ms，视野（field of view，FOV）200 mm，层厚2～3 mm；T2WI：TE 100 ms，TR 1 900 ms；T1ρ-MRI扫描采用矢状位，FOV 28 cm × 28 cm，层厚3 cm，层间距0.3 cm，自旋锁定时间（time of spin-locking，TSL）设为15、30、45、60 ms，获取4组T1ρ-MRI图像。MRI扫描后，根据Pfirrmann分级标准[8]，对L4、5椎间盘进行分级（图 1）。Ⅰ级椎间盘组织信号均匀，呈白色高信号，椎间高度正常；Ⅱ级椎间盘组织信号不均匀，仍呈白色高信号或间有水平灰带，髓核和纤维环境界清楚，椎间高度正常；Ⅲ级椎间盘信号不均匀，呈暗灰色信号，髓核和纤维环境界不清，但是椎间高度正常或略有下降；Ⅳ级椎间盘组织信号不均匀，呈黑色低信号，髓核和纤维环境界消失，椎间高度丢失。Pfirrmann分级由3位放射科医师进行评估，数据收集后，对评估结果不同的椎间盘进行讨论，最终共同确定其Pfirrmann分级。
图1
不同Pfirrmann分级T1ρ-mapping 图像 ⓐ Ⅰ级 ⓑ Ⅱ级 ⓒ Ⅲ级 ⓓ Ⅳ级 将4组TSL不同的T1ρ-MRI图像输入T1ρ图像处理程序（通过国际合作由丹麦奥胡斯大学协助在本院安装、测试与使用）自动处理，经T1ρ-mapping产生T1ρ图像，选定感兴趣区域（range of interest，ROI），ROI为直径5 mm圆圈，定位于髓核中央，测量并记录T1ρ弛豫时间，即T1ρ值（图 2）。T1ρ与TSL之间满足指数方程关系：S（x）=A（x）·e [7]，其中S表示MRI信号强度，x表示所测定物质，A为TSL为0时的信号强度。
1.3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。数据以均数± 标准差表示，腰椎与髋骨ward三角区骨密度值比较采用t检验；各年龄段间骨密度值比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。腰椎间盘 T1ρ值与年龄、体重、腰椎骨密度值、髋骨ward三角区骨密度值间的相关性采用Pearson相关分析，腰椎间盘Pfirrmann分级与年龄、体重、腰椎骨密度值、髋骨ward三角区骨密度值以及腰椎间盘T1ρ值之间的相关性采用Spearman相关分析；检验水准α=0.05。
2 结果
本组腰椎骨密度值为（0.64 ± 0.17）g/cm2，髋骨ward三角区骨密度值为（0.67 ± 0.19）g/cm2，比较差异无统计学意义（t=2.893，P=0.128）。除8～12岁与12～15岁年龄段腰椎及髋骨ward三角区差异无统计学意义（P＞ 0.05）外，其余各年龄段间比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05），见表 1。L4、5椎间盘按Pfirrmann分级标准：Ⅰ级7例，Ⅱ级8例，Ⅲ级5例。腰椎间盘T1ρ值为（104.08 ± 18.65）ms，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级分别为（121.31 ± 13.44）、（104.73 ± 15.01）、（77.41 ± 11.87） ms。
表1
各年龄段恒河猴腰椎及髋骨ward三角区骨密度值（g/cm2，腰椎间盘 T1ρ值与年龄、腰椎骨密度值以及髋骨ward三角区骨密度值间均成负相关。L4、5椎间盘Pfirrmann分级与年龄、腰椎骨密度值以及髋骨ward三角区骨密度值均成正相关；与腰椎间盘T1ρ值成负相关，详见表 2。
表2
腰椎间盘T1ρ值、Pfirrmann分级与年龄、体重、骨密度值相关关系分析
Table2.
Correlations of T1ρ value and Pfirrmann grading with age,weight,and BMD
3 讨论
椎间盘退变性疾病是临床常见病和多发病，也是下腰痛的主要原因[6]。但目前关于该病病因和病理生理机制尚未明确。有学者通过观察不同程度骨密度患者椎间盘形态学的改变，发现骨质疏松严重患者会出现椎间盘退变表现，且两者成正相关[2, 9]。因此，有学者认为骨质疏松与椎间盘退变可能存在相似的发病机制[3, 10]。研究发现，在突出椎间盘组织中IL-1、IL-6、TNF等炎性因子的含量明显高于正常椎间盘[10-11]。炎性因子过表达会影响椎间盘分解与合成代谢的平衡，导致降解酶增加和基质蛋白减少[12]。而炎性因子在骨质疏松过程中也起着重要调节作用[13]。有学者认为，骨质疏松导致椎体终板骨代谢改变以及终板力学性能的改变，进而导致椎体终板与椎间盘之间的营养交换发生改变，是其影响椎间盘退变的因素之一[1]。但也有研究结果表明，骨质疏松和腰椎间盘退变之间存在负相关关系[2, 14]。
为解决上述争议，首先需要建立一种可靠的椎间盘退变动物模型，并将其标准化。其不仅能为研究相互影响机制及相关关系提供有利条件，更可为治疗退变椎间盘的各种研究提供良好实验载体[15]。恒河猴属于人类近属动物，其解剖生理和脊柱生物力学特点与人类较接近，因此本研究选择其作为实验对象进行观测。根据恒河猴与人类1∶3.5的年龄换算，本研究选用了4～20岁的恒河猴，囊括了人类青少年到老年的年龄跨度，且骨密度测量结果显示，随着年龄增长（15岁以后），恒河猴椎体及髋骨ward三角区骨密度呈下降趋势，我们认为可能与内分泌代谢有关。这一现象与人类一致，因此本研究结论具有一定参考意义。
以往研究常根据MRI扫描T1、T2信号的变化来评估椎间盘退变情况，存在准确度不高、误差较大等缺点。T1ρ-MRI技术能探测组织器官中蛋白多糖，并可量化分析其含量[16-17]，而蛋白多糖是腰椎间盘退变的分子标记。因此，该技术可以无创监测腰椎间盘退变的发展过程、评价其退变程度。Zuo等[18]应用T1ρ-MRI技术对26例椎间盘突出患者椎间盘进行评估，发现T1ρ值与椎间盘蛋白多糖含量成正相关。Zobel等[19]采用T1ρ-MRI技术对63例受试者椎间盘进行评估发现，T1ρ值与椎间盘退变Pfirrmann分级存在显著相关性，因此认为其可作为临床量化评价椎间盘退变的影像学方法。Wang等[20]分别应用T1ρ-MRI技术与传统T2-mapping序列评价椎间盘退变，结果发现，与T2弛豫时间相比，T1ρ值的灵敏度更高，认为其在评价早期椎间盘退变方面具有显著优势。为此，本研究应用T1ρ-MRI技术量化评价恒河猴的腰椎间盘T1ρ值，并分析其与腰椎骨密度的相关关系。
结果显示，恒河猴腰椎及髋骨ward三角区骨密度值与腰椎间盘T1ρ值成负相关。有学者认为椎间盘退变患者腰椎骨密度之所以高于同龄人群，与椎间盘退变导致椎间生物力学环境发生改变，进而导致椎体骨质增生有关[21]。提示椎体骨密度变化可能是临床评价椎间盘退变发生、发展以及预后的指标之一。此外，椎间盘T1ρ值与Pfirrmann分级也成负相关，进一步明确其作为椎间盘退变的量化评价指标可靠。但由于实验动物数量有限，且尚未建立各级腰椎间盘退变与T1ρ值的相关关系，有待进一步研究明确其在不同程度椎间盘退变中的评价作用。既往文献报道，年龄是椎间盘退变的重要影响因素之一[22-23]。本研究结果显示，年龄与椎间盘T1ρ值成负相关，提示年龄是椎间盘退变进程中不可忽略的一个因素。但是不同年龄段恒河猴骨密度存在显著差异，且随着年龄增长（15岁以后），骨密度呈明显下降趋势。因此，上述三者如何相互影响、相互作用，尚需进一步临床及实验研究加以明确。
综上述，本研究进一步证实了骨质疏松与椎间盘退变间存在负相关关系，明确了骨质疏松与椎间盘退变的相互影响机制，为腰椎退变性疾患的预防和诊治提供了新思路。
临床研究表明脊柱退变常伴发骨质疏松，但关于骨质疏松与腰椎间盘退变间的相关性及其相互影响机制仍不清楚[1-4]。有学者通过大鼠实验发现，椎间盘退变与骨质疏松可能存在负相关[5]。但也有研究显示，骨质疏松与椎间盘退变间无明显相关性[6]。以上研究结果差异可能与导致骨质疏松与椎间盘退变的影响因素众多，以及目前缺乏与人类椎间盘退变过程相近的动物模型进行研究有关。直立爬行的灵长类动物恒河猴由于有接近人类的解剖生理，已用于脊柱退变动物模型构建研究。另外，近年出现的T1ρ-MRI技术可用于测量组织中蛋白多糖的含量，为量化评价椎间盘退变奠定了基础[7]。本研究拟采用恒河猴为实验动物，结合T1ρ-MRI技术分析并阐述骨密度与腰椎间盘退变的相关关系，为探讨骨质疏松以及腰椎退变性疾病的病因、发病机制提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要仪器
正常成年雌性恒河猴20只，年龄4～20岁，平均10.9岁；其中4～8岁6只、8～12岁5只、12～15岁5只、15～20岁4只。体重5.3～10.8 kg，平均7.4 kg。由广东蓝岛动物实验中心提供。单笼饲养，室温控制在25℃左右，正常光照，混合人工饲料加水果、蔬菜适应性饲养半年。
Osteocore双能X线骨密度测定仪（MEDILINK公司，法国）；1.5 Tesla 磁共振仪（Philips公司，荷兰）。
1.2 实验方法
1.2.1 骨密度测量
取20只实验动物，肌肉注射地西泮（2.5 mg/kg）和氯胺酮（10 mg/kg）混合麻醉。采用Osteocore双能X线骨密度测定仪，前后位法测量L4、5椎体及双髋ward三角区骨密度（g/cm2）。仪器由计算机控制，自动定位、测量和存储数据，重复测量误差 ＜ 1%。取L4、5椎体骨密度平均值作为腰椎骨密度值，双髋ward三角区骨密度平均值作为髋骨ward三角区骨密度值。
1.2.2 MRI测量
使用1.5 Tesla 磁共振仪进行L4、5椎间盘扫描，采用8通道腰椎线圈。T1WI和T2WI采用快速自旋回波脉冲序列，T2-mapping技术处理前的T2WI图像采集采用多回波自旋回波序列，T1ρ-mapping采用快速自旋锁定脉冲序列，动态增强MRI采用矢状位T1脂肪抑制快速自旋回波序列。扫描参数：T1WI：回波时间（time of echo，TE）12 ms，脉冲重复时间（time of repetition，TR）540 ms，视野（field of view，FOV）200 mm，层厚2～3 mm；T2WI：TE 100 ms，TR 1 900 ms；T1ρ-MRI扫描采用矢状位，FOV 28 cm × 28 cm，层厚3 cm，层间距0.3 cm，自旋锁定时间（time of spin-locking，TSL）设为15、30、45、60 ms，获取4组T1ρ-MRI图像。MRI扫描后，根据Pfirrmann分级标准[8]，对L4、5椎间盘进行分级（图 1）。Ⅰ级椎间盘组织信号均匀，呈白色高信号，椎间高度正常；Ⅱ级椎间盘组织信号不均匀，仍呈白色高信号或间有水平灰带，髓核和纤维环境界清楚，椎间高度正常；Ⅲ级椎间盘信号不均匀，呈暗灰色信号，髓核和纤维环境界不清，但是椎间高度正常或略有下降；Ⅳ级椎间盘组织信号不均匀，呈黑色低信号，髓核和纤维环境界消失，椎间高度丢失。Pfirrmann分级由3位放射科医师进行评估，数据收集后，对评估结果不同的椎间盘进行讨论，最终共同确定其Pfirrmann分级。
图1
不同Pfirrmann分级T1ρ-mapping 图像 ⓐ Ⅰ级 ⓑ Ⅱ级 ⓒ Ⅲ级 ⓓ Ⅳ级 将4组TSL不同的T1ρ-MRI图像输入T1ρ图像处理程序（通过国际合作由丹麦奥胡斯大学协助在本院安装、测试与使用）自动处理，经T1ρ-mapping产生T1ρ图像，选定感兴趣区域（range of interest，ROI），ROI为直径5 mm圆圈，定位于髓核中央，测量并记录T1ρ弛豫时间，即T1ρ值（图 2）。T1ρ与TSL之间满足指数方程关系：S（x）=A（x）·e [7]，其中S表示MRI信号强度，x表示所测定物质，A为TSL为0时的信号强度。
1.3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。数据以均数± 标准差表示，腰椎与髋骨ward三角区骨密度值比较采用t检验；各年龄段间骨密度值比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。腰椎间盘 T1ρ值与年龄、体重、腰椎骨密度值、髋骨ward三角区骨密度值间的相关性采用Pearson相关分析，腰椎间盘Pfirrmann分级与年龄、体重、腰椎骨密度值、髋骨ward三角区骨密度值以及腰椎间盘T1ρ值之间的相关性采用Spearman相关分析；检验水准α=0.05。
2 结果
本组腰椎骨密度值为（0.64 ± 0.17）g/cm2，髋骨ward三角区骨密度值为（0.67 ± 0.19）g/cm2，比较差异无统计学意义（t=2.893，P=0.128）。除8～12岁与12～15岁年龄段腰椎及髋骨ward三角区差异无统计学意义（P＞ 0.05）外，其余各年龄段间比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05），见表 1。L4、5椎间盘按Pfirrmann分级标准：Ⅰ级7例，Ⅱ级8例，Ⅲ级5例。腰椎间盘T1ρ值为（104.08 ± 18.65）ms，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级分别为（121.31 ± 13.44）、（104.73 ± 15.01）、（77.41 ± 11.87） ms。
表1
各年龄段恒河猴腰椎及髋骨ward三角区骨密度值（g/cm2，腰椎间盘 T1ρ值与年龄、腰椎骨密度值以及髋骨ward三角区骨密度值间均成负相关。L4、5椎间盘Pfirrmann分级与年龄、腰椎骨密度值以及髋骨ward三角区骨密度值均成正相关；与腰椎间盘T1ρ值成负相关，详见表 2。
表2
腰椎间盘T1ρ值、Pfirrmann分级与年龄、体重、骨密度值相关关系分析
Table2.
Correlations of T1ρ value and Pfirrmann grading with age,weight,and BMD
3 讨论
椎间盘退变性疾病是临床常见病和多发病，也是下腰痛的主要原因[6]。但目前关于该病病因和病理生理机制尚未明确。有学者通过观察不同程度骨密度患者椎间盘形态学的改变，发现骨质疏松严重患者会出现椎间盘退变表现，且两者成正相关[2, 9]。因此，有学者认为骨质疏松与椎间盘退变可能存在相似的发病机制[3, 10]。研究发现，在突出椎间盘组织中IL-1、IL-6、TNF等炎性因子的含量明显高于正常椎间盘[10-11]。炎性因子过表达会影响椎间盘分解与合成代谢的平衡，导致降解酶增加和基质蛋白减少[12]。而炎性因子在骨质疏松过程中也起着重要调节作用[13]。有学者认为，骨质疏松导致椎体终板骨代谢改变以及终板力学性能的改变，进而导致椎体终板与椎间盘之间的营养交换发生改变，是其影响椎间盘退变的因素之一[1]。但也有研究结果表明，骨质疏松和腰椎间盘退变之间存在负相关关系[2, 14]。
为解决上述争议，首先需要建立一种可靠的椎间盘退变动物模型，并将其标准化。其不仅能为研究相互影响机制及相关关系提供有利条件，更可为治疗退变椎间盘的各种研究提供良好实验载体[15]。恒河猴属于人类近属动物，其解剖生理和脊柱生物力学特点与人类较接近，因此本研究选择其作为实验对象进行观测。根据恒河猴与人类1∶3.5的年龄换算，本研究选用了4～20岁的恒河猴，囊括了人类青少年到老年的年龄跨度，且骨密度测量结果显示，随着年龄增长（15岁以后），恒河猴椎体及髋骨ward三角区骨密度呈下降趋势，我们认为可能与内分泌代谢有关。这一现象与人类一致，因此本研究结论具有一定参考意义。
以往研究常根据MRI扫描T1、T2信号的变化来评估椎间盘退变情况，存在准确度不高、误差较大等缺点。T1ρ-MRI技术能探测组织器官中蛋白多糖，并可量化分析其含量[16-17]，而蛋白多糖是腰椎间盘退变的分子标记。因此，该技术可以无创监测腰椎间盘退变的发展过程、评价其退变程度。Zuo等[18]应用T1ρ-MRI技术对26例椎间盘突出患者椎间盘进行评估，发现T1ρ值与椎间盘蛋白多糖含量成正相关。Zobel等[19]采用T1ρ-MRI技术对63例受试者椎间盘进行评估发现，T1ρ值与椎间盘退变Pfirrmann分级存在显著相关性，因此认为其可作为临床量化评价椎间盘退变的影像学方法。Wang等[20]分别应用T1ρ-MRI技术与传统T2-mapping序列评价椎间盘退变，结果发现，与T2弛豫时间相比，T1ρ值的灵敏度更高，认为其在评价早期椎间盘退变方面具有显著优势。为此，本研究应用T1ρ-MRI技术量化评价恒河猴的腰椎间盘T1ρ值，并分析其与腰椎骨密度的相关关系。
结果显示，恒河猴腰椎及髋骨ward三角区骨密度值与腰椎间盘T1ρ值成负相关。有学者认为椎间盘退变患者腰椎骨密度之所以高于同龄人群，与椎间盘退变导致椎间生物力学环境发生改变，进而导致椎体骨质增生有关[21]。提示椎体骨密度变化可能是临床评价椎间盘退变发生、发展以及预后的指标之一。此外，椎间盘T1ρ值与Pfirrmann分级也成负相关，进一步明确其作为椎间盘退变的量化评价指标可靠。但由于实验动物数量有限，且尚未建立各级腰椎间盘退变与T1ρ值的相关关系，有待进一步研究明确其在不同程度椎间盘退变中的评价作用。既往文献报道，年龄是椎间盘退变的重要影响因素之一[22-23]。本研究结果显示，年龄与椎间盘T1ρ值成负相关，提示年龄是椎间盘退变进程中不可忽略的一个因素。但是不同年龄段恒河猴骨密度存在显著差异，且随着年龄增长（15岁以后），骨密度呈明显下降趋势。因此，上述三者如何相互影响、相互作用，尚需进一步临床及实验研究加以明确。
综上述，本研究进一步证实了骨质疏松与椎间盘退变间存在负相关关系，明确了骨质疏松与椎间盘退变的相互影响机制，为腰椎退变性疾患的预防和诊治提供了新思路。
