引用本文： 庄淑波, 柴家科, 郁永辉, 段红杰, 刘玲英, 樊军, 侯玉森, 王一贺. 烧伤血清对3T3-L1前脂肪细胞增殖活性和成脂分化能力的影响. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(6): 763-767. doi: 10.7507/1002-1892.20140169 复制
烧伤后机体组织破坏严重，长时间的负氮平衡导致蛋白质、脂肪、糖类和能量等物质储备严重损耗，使机体处于严重营养不良状态[1]。脂肪消耗过度会引起机体能量供应不足，免疫力下降，感染率增加，创面愈合延迟，严重影响患者的生存和预后[2-6]。本研究应用烧伤大鼠血清模拟烧伤环境，体外培养3T3-Ll前脂肪细胞，观察烧伤血清对细胞增殖及成脂分化能力的影响，为指导临床调控脂肪分解代谢提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
清洁级成年雄性SD大鼠48只，体重（250 ± 10） g，由中国医学科学院实验动物研究所提供。3T3-Ll前脂肪细胞由北京老年医学研究所提供。胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松（Sigma公司，美国）；MTT（北京华美生物工程公司）；过氧化物酶体增殖物激活受体γ（preoxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ）单克隆抗体、脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；RNA提取试剂盒（Invitrogen公司，美国）；蛋白裂解液测定液试剂盒（PiereBiotee公司，美国）。CO2培养箱（SANYO公司，日本）；倒置显微镜、荧光显微镜（Leica公司，德国）；450型自动酶标仪系统（Bio-Rad公司，美国）。
1.2 大鼠烧伤血清制备
将48 只大鼠随机分为6组，分别为假伤组及烧伤1、4、7、14、21 d组，每组8只。实验前12 h禁食，自由饮水。所有大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉，背部去毛。各烧伤组大鼠背部置于94℃热水中12 s，制成30%总体表面积的Ⅲ度烫伤模型[7-8]；假伤组置于37℃热水中12 s。造模后立即腹腔注射生理盐水（40 mL/kg）抗休克，单笼饲养。
假伤组于造模后4 d、各烧伤组于伤后对应时间点，取大鼠同上法麻醉后，打开腹腔，分离腹主动脉，10 mL注射器穿刺收集全血。4℃以离心半径13.5 cm、3 000 r/min离心15 min，收集血清，-70℃保存。
1.3 烧伤血清对3T3-Ll前脂肪细胞增殖能力的影响
取3T3-Ll前脂肪细胞，经0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，按1 ×105个/孔接种于96孔板，分别加入含10%血清（1.2中制备的各组血清）的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2 培养箱中培养。培养后1、2、3 d采用MTT法检测细胞增殖活性。各时间点各组取1块96孔板，每孔加入MTT（5 mg/mL）20 μL，37℃孵育4 h，弃上清，加入DMSO 150 μL，振荡10 min，使结晶充分溶解。在酶标仪上于490 nm波长处测量吸光度（A）值，绘制生长曲线。选择增殖能力最低组血清进行后续实验。
1.4 烧伤血清对3T3-Ll前脂肪细胞成脂分化能力的影响
1.4.1 实验分组及方法
实验分为4组，分别为假伤血清组（A组）、烧伤血清组（B组）、假伤血清成脂诱导组（C组）、烧伤血清成脂诱导组（D组）。首先将各组3T3-Ll前脂肪细胞按1 ×106个接种于培养皿中，采用含10%血清的DMEM培养基培养，其中A、C组采用假伤组大鼠血清，B、D组采用烧伤组大鼠血清（增殖能力最低组血清），每3天换液1次。按参考文献[9]方法制备含10%血清（C、D组对应血清）的DMEM成脂诱导培养基（1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1 μmol/L人胰岛素、1 μmol/L吲哚美辛）。C、D组细胞生长融合后更换为成脂诱导培养基继续培养，A、B组不更换培养基。倒置显微镜下观察各组细胞生长情况。培养7 d后取各组细胞进行以下观测。
1.4.2 油红O染色
取各组细胞爬片PBS冲洗2次，置于10%甲醛固定30 min，60%异丙醇固定30 min，油红O染液1 h，60%异丙醇固定3 s，蒸馏水冲洗弃液，Mayer苏木素染色5 min，1%盐酸分化退蓝，自来水漂洗10 min，晾干，甘油明胶封固[10]。光镜下观察脂肪细胞染色情况，每组随机选取5枚盖玻片，于200倍镜下计数脂肪细胞，取均值。
另取各组细胞置于10%甲醛固定30 min，60%异丙醇固定30 min，油红O染液1 h，60%异丙醇固定3 s，蒸馏水冲洗弃液，加入等量异丙醇，充分震荡摇匀后，以离心半径13.5 cm、3 000 r/min离心15 min。取上清，在酶标仪上于490 nm波长处测定A值，以A值表示脂肪细胞数量[9]。
1.4.3 实时定量PCR检测成脂特异性转录因子PPAR-γ、
LPL基因表达取各组细胞，按RNA提取试剂盒说明抽提总RNA。以随机引物（oligoDT）、 1.25 μL 10 mmol/L dNTP mix、25 μL RNA酶抑制剂、200 μL M-MLV酶、13.375 μL DEPC水反应体系进行cDNA逆转录。cDNA为模板，进行RT-PCR扩增。 引物序列（5'→3'）：PPAR-γ上游GCATGGTGCCTTCGCTGA，下游TGGCATCTCTGTGTCAACCATG；LPL 上游TGTACTTCCAGTGCGTCTC，下游TCCCTTCCGAAT-TATGCT；β-actin 上游 GGCAGGTCTACTTTGGAG，下游ACATTCGAGGCTCCAGTGTT。实时定量PCR总反应体系为20 μL。反应条件：95℃预变性 2 min； 95℃变性 15 s，60℃延伸60 s，循环40次。以β-actin作为内参照，计算PPAR-γ、LPL基因相对表达量。
1.4.4 Western
blot检测PPAR-γ、LPL蛋白表达取各组细胞，按蛋白裂解液测定液试剂盒说明书分别提取组织蛋白和测定蛋白浓度； 根据蛋白浓度加入loading buffer，煮沸5 min，蛋白变性；使用 12% 分离胶和5% 浓缩胶行PAGE凝胶电泳； 转膜，用 5%TBST 配制的牛奶封闭 1 h；分别加入PPAR-γ、LPL一抗、二抗，孵育。发光按照发光液试剂盒说明进行。用Quantity One 图像分析软件分析PPAR-γ及LPL蛋白表达量。
1.5 统计学方法
采用 SPSS16.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，方差齐时两两比较采用 LSD 法，方差不齐时采用秩和检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 3T3-Ll前脂肪细胞增殖能力检测
MTT检测示，烧伤4、7 d组3T3-Ll前脂肪细胞增殖能力显著低于其余各组（P＜ 0.05），其中7 d组细胞增殖能力最低（P＜ 0.05）。故选择烧伤7 d组大鼠血清进行后续实验。见图 1。
图1
各组细胞生长曲线
Figure1.
Growth curve of each group
2.2 烧伤血清对3T3-Ll前脂肪细胞成脂分化能力的影响
2.2.1 细胞形态学观察
倒置显微镜下观察示，正常3T3-Ll前脂肪细胞贴壁生长后呈长梭形，大部分呈平行排列。A、B组培养期间细胞形态无明显变化。诱导培养后3 d C组细胞胞质内出现高折光性小脂滴，主要集中于细胞核周围，随时间延长脂滴逐渐增多并聚集成大脂滴，细胞体积逐渐增大，由长梭形变为圆形或椭圆形。D组仅有少量细胞胞质内出现高折光性小脂滴，主要集中于细胞核周围，细胞形态变化与C组一致。见图 2。
图2
各组细胞形态学观察（倒置显微镜× 200） ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 ⓓ D组 2.2.2 油红O染色观测
油红O染色示，A、B组染色为阴性；C组可见细胞中有大小不等的橙红色脂滴堆积，细胞核呈淡蓝色，集中于细胞周围，提示为脂肪细胞；D组亦可见橙红色脂滴，但脂肪细胞少于C组。见图 3。油红O染色后各组脂肪细胞计数及A值比较示，A、B组间以及C、D组间比较，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见图 4。
2.3 PPAR-γ、LPL 基因及蛋白检测
B组PPAR-γ基因相对表达量明显低于A组（P＜ 0.05），但LPL基因相对表达量两组间差异无统计学意义（P＞ 0.05）；PPAR-γ、LPL蛋白表达量两组间比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）。D组PPAR-γ、LPL基因及蛋白表达量均显著低于C组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见图 5～7。
3 讨论
3T3-L1前脂肪细胞是从17～19 d小鼠胚胎Swiss3T3细胞中分离获得的前体细胞，具有单一分化潜能，经克隆扩增成为前脂肪细胞系，细胞本身无脂肪细胞的特性，但在适当诱导条件下可分化成脂肪细胞，与脂肪细胞的形成密切相关[11-12]。3T3-L1前脂肪细胞具有增殖能力，且其增殖也是体内脂肪沉积的主要因素[13]，故本实验通过3T3-L1前脂肪细胞来研究烧伤脂肪代谢。通过观察烧伤后1、4、7、14、21 d血清对3T3-L1前脂肪细胞增殖能力的影响，发现烧伤后7 d血清影响最大，细胞增殖能力最低。在临床中烧伤后第7天是烧伤高代谢阶段，该时期患者表现为发热、白细胞增多，体内糖、脂与肌肉代谢紊乱[14-16]。本研究细胞增殖研究结果与临床表现相符，故选用烧伤后7 d血清进行3T3-L1前脂肪细胞成脂分化能力的研究。
油红O染色定量实验是将细胞进行油红O染色后，使用异丙醇将脂肪细胞黏染的染料清洗后收集上清液，通过酶标仪对上清液进行A值检测分析，是较为公认的脂肪细胞定量检测方法之一。因此，本研究选择染色后细胞计数及检测上清液A值两种方法，明确各组成脂诱导后的细胞数量。结果显示，C组经成脂诱导后形成大量脂肪细胞，而D组诱导成脂细胞量明显减少。
本研究对诱导后细胞中成脂特异性转录因子PPAR-γ和LPL基因及蛋白表达量进行了检测。PPAR-γ在成脂早期即表达，它还可调控其他脂肪细胞特异性基因的表达，从而调控成脂分化。PPAR-γ是脂肪细胞分化的决定性因子，无论是在体内还是体外实验都已证实PPAR-γ的表达是脂肪细胞形成所必需因素[17-23]。LPL是细胞分化为脂肪细胞经典而重要的标志，不仅在分化早期表达，在脂肪细胞分化前期及成熟脂肪细胞均可表达[24-26]。研究结果提示，在A组3T3-L1前脂肪细胞可见PPAR-γ基因表达，B组细胞PPAR-γ基因相对表达量较A组显著下降，提示烧伤血清通过基因水平调控3T3-L1前脂肪细胞的成脂分化。A、B组均未采用成脂诱导剂进行培养，故LPL基因相对表达量甚微，两组间比较也无明显差异。C组PPAR-γ基因及蛋白表达明均显著高于D组，进一步表明烧伤血清抑制了3T3-L1前脂肪细胞成脂分化。
综上述，本研究结果提示，采用大鼠烧伤血清培养3T3-L1前脂肪细胞，会降低细胞的成脂分化能力，而成脂分化能力下降是烧伤后脂肪分解代谢变化的主要原因之一。如何能有效的改善烧伤后脂肪代谢，有待更深入的研究。
烧伤后机体组织破坏严重，长时间的负氮平衡导致蛋白质、脂肪、糖类和能量等物质储备严重损耗，使机体处于严重营养不良状态[1]。脂肪消耗过度会引起机体能量供应不足，免疫力下降，感染率增加，创面愈合延迟，严重影响患者的生存和预后[2-6]。本研究应用烧伤大鼠血清模拟烧伤环境，体外培养3T3-Ll前脂肪细胞，观察烧伤血清对细胞增殖及成脂分化能力的影响，为指导临床调控脂肪分解代谢提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
清洁级成年雄性SD大鼠48只，体重（250 ± 10） g，由中国医学科学院实验动物研究所提供。3T3-Ll前脂肪细胞由北京老年医学研究所提供。胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松（Sigma公司，美国）；MTT（北京华美生物工程公司）；过氧化物酶体增殖物激活受体γ（preoxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ）单克隆抗体、脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；RNA提取试剂盒（Invitrogen公司，美国）；蛋白裂解液测定液试剂盒（PiereBiotee公司，美国）。CO2培养箱（SANYO公司，日本）；倒置显微镜、荧光显微镜（Leica公司，德国）；450型自动酶标仪系统（Bio-Rad公司，美国）。
1.2 大鼠烧伤血清制备
将48 只大鼠随机分为6组，分别为假伤组及烧伤1、4、7、14、21 d组，每组8只。实验前12 h禁食，自由饮水。所有大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉，背部去毛。各烧伤组大鼠背部置于94℃热水中12 s，制成30%总体表面积的Ⅲ度烫伤模型[7-8]；假伤组置于37℃热水中12 s。造模后立即腹腔注射生理盐水（40 mL/kg）抗休克，单笼饲养。
假伤组于造模后4 d、各烧伤组于伤后对应时间点，取大鼠同上法麻醉后，打开腹腔，分离腹主动脉，10 mL注射器穿刺收集全血。4℃以离心半径13.5 cm、3 000 r/min离心15 min，收集血清，-70℃保存。
1.3 烧伤血清对3T3-Ll前脂肪细胞增殖能力的影响
取3T3-Ll前脂肪细胞，经0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，按1 ×105个/孔接种于96孔板，分别加入含10%血清（1.2中制备的各组血清）的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2 培养箱中培养。培养后1、2、3 d采用MTT法检测细胞增殖活性。各时间点各组取1块96孔板，每孔加入MTT（5 mg/mL）20 μL，37℃孵育4 h，弃上清，加入DMSO 150 μL，振荡10 min，使结晶充分溶解。在酶标仪上于490 nm波长处测量吸光度（A）值，绘制生长曲线。选择增殖能力最低组血清进行后续实验。
1.4 烧伤血清对3T3-Ll前脂肪细胞成脂分化能力的影响
1.4.1 实验分组及方法
实验分为4组，分别为假伤血清组（A组）、烧伤血清组（B组）、假伤血清成脂诱导组（C组）、烧伤血清成脂诱导组（D组）。首先将各组3T3-Ll前脂肪细胞按1 ×106个接种于培养皿中，采用含10%血清的DMEM培养基培养，其中A、C组采用假伤组大鼠血清，B、D组采用烧伤组大鼠血清（增殖能力最低组血清），每3天换液1次。按参考文献[9]方法制备含10%血清（C、D组对应血清）的DMEM成脂诱导培养基（1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1 μmol/L人胰岛素、1 μmol/L吲哚美辛）。C、D组细胞生长融合后更换为成脂诱导培养基继续培养，A、B组不更换培养基。倒置显微镜下观察各组细胞生长情况。培养7 d后取各组细胞进行以下观测。
1.4.2 油红O染色
取各组细胞爬片PBS冲洗2次，置于10%甲醛固定30 min，60%异丙醇固定30 min，油红O染液1 h，60%异丙醇固定3 s，蒸馏水冲洗弃液，Mayer苏木素染色5 min，1%盐酸分化退蓝，自来水漂洗10 min，晾干，甘油明胶封固[10]。光镜下观察脂肪细胞染色情况，每组随机选取5枚盖玻片，于200倍镜下计数脂肪细胞，取均值。
另取各组细胞置于10%甲醛固定30 min，60%异丙醇固定30 min，油红O染液1 h，60%异丙醇固定3 s，蒸馏水冲洗弃液，加入等量异丙醇，充分震荡摇匀后，以离心半径13.5 cm、3 000 r/min离心15 min。取上清，在酶标仪上于490 nm波长处测定A值，以A值表示脂肪细胞数量[9]。
1.4.3 实时定量PCR检测成脂特异性转录因子PPAR-γ、
LPL基因表达取各组细胞，按RNA提取试剂盒说明抽提总RNA。以随机引物（oligoDT）、 1.25 μL 10 mmol/L dNTP mix、25 μL RNA酶抑制剂、200 μL M-MLV酶、13.375 μL DEPC水反应体系进行cDNA逆转录。cDNA为模板，进行RT-PCR扩增。 引物序列（5'→3'）：PPAR-γ上游GCATGGTGCCTTCGCTGA，下游TGGCATCTCTGTGTCAACCATG；LPL 上游TGTACTTCCAGTGCGTCTC，下游TCCCTTCCGAAT-TATGCT；β-actin 上游 GGCAGGTCTACTTTGGAG，下游ACATTCGAGGCTCCAGTGTT。实时定量PCR总反应体系为20 μL。反应条件：95℃预变性 2 min； 95℃变性 15 s，60℃延伸60 s，循环40次。以β-actin作为内参照，计算PPAR-γ、LPL基因相对表达量。
1.4.4 Western
blot检测PPAR-γ、LPL蛋白表达取各组细胞，按蛋白裂解液测定液试剂盒说明书分别提取组织蛋白和测定蛋白浓度； 根据蛋白浓度加入loading buffer，煮沸5 min，蛋白变性；使用 12% 分离胶和5% 浓缩胶行PAGE凝胶电泳； 转膜，用 5%TBST 配制的牛奶封闭 1 h；分别加入PPAR-γ、LPL一抗、二抗，孵育。发光按照发光液试剂盒说明进行。用Quantity One 图像分析软件分析PPAR-γ及LPL蛋白表达量。
1.5 统计学方法
采用 SPSS16.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，方差齐时两两比较采用 LSD 法，方差不齐时采用秩和检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 3T3-Ll前脂肪细胞增殖能力检测
MTT检测示，烧伤4、7 d组3T3-Ll前脂肪细胞增殖能力显著低于其余各组（P＜ 0.05），其中7 d组细胞增殖能力最低（P＜ 0.05）。故选择烧伤7 d组大鼠血清进行后续实验。见图 1。
图1
各组细胞生长曲线
Figure1.
Growth curve of each group
2.2 烧伤血清对3T3-Ll前脂肪细胞成脂分化能力的影响
2.2.1 细胞形态学观察
倒置显微镜下观察示，正常3T3-Ll前脂肪细胞贴壁生长后呈长梭形，大部分呈平行排列。A、B组培养期间细胞形态无明显变化。诱导培养后3 d C组细胞胞质内出现高折光性小脂滴，主要集中于细胞核周围，随时间延长脂滴逐渐增多并聚集成大脂滴，细胞体积逐渐增大，由长梭形变为圆形或椭圆形。D组仅有少量细胞胞质内出现高折光性小脂滴，主要集中于细胞核周围，细胞形态变化与C组一致。见图 2。
图2
各组细胞形态学观察（倒置显微镜× 200） ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 ⓓ D组 2.2.2 油红O染色观测
油红O染色示，A、B组染色为阴性；C组可见细胞中有大小不等的橙红色脂滴堆积，细胞核呈淡蓝色，集中于细胞周围，提示为脂肪细胞；D组亦可见橙红色脂滴，但脂肪细胞少于C组。见图 3。油红O染色后各组脂肪细胞计数及A值比较示，A、B组间以及C、D组间比较，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见图 4。
2.3 PPAR-γ、LPL 基因及蛋白检测
B组PPAR-γ基因相对表达量明显低于A组（P＜ 0.05），但LPL基因相对表达量两组间差异无统计学意义（P＞ 0.05）；PPAR-γ、LPL蛋白表达量两组间比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）。D组PPAR-γ、LPL基因及蛋白表达量均显著低于C组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见图 5～7。
3 讨论
3T3-L1前脂肪细胞是从17～19 d小鼠胚胎Swiss3T3细胞中分离获得的前体细胞，具有单一分化潜能，经克隆扩增成为前脂肪细胞系，细胞本身无脂肪细胞的特性，但在适当诱导条件下可分化成脂肪细胞，与脂肪细胞的形成密切相关[11-12]。3T3-L1前脂肪细胞具有增殖能力，且其增殖也是体内脂肪沉积的主要因素[13]，故本实验通过3T3-L1前脂肪细胞来研究烧伤脂肪代谢。通过观察烧伤后1、4、7、14、21 d血清对3T3-L1前脂肪细胞增殖能力的影响，发现烧伤后7 d血清影响最大，细胞增殖能力最低。在临床中烧伤后第7天是烧伤高代谢阶段，该时期患者表现为发热、白细胞增多，体内糖、脂与肌肉代谢紊乱[14-16]。本研究细胞增殖研究结果与临床表现相符，故选用烧伤后7 d血清进行3T3-L1前脂肪细胞成脂分化能力的研究。
油红O染色定量实验是将细胞进行油红O染色后，使用异丙醇将脂肪细胞黏染的染料清洗后收集上清液，通过酶标仪对上清液进行A值检测分析，是较为公认的脂肪细胞定量检测方法之一。因此，本研究选择染色后细胞计数及检测上清液A值两种方法，明确各组成脂诱导后的细胞数量。结果显示，C组经成脂诱导后形成大量脂肪细胞，而D组诱导成脂细胞量明显减少。
本研究对诱导后细胞中成脂特异性转录因子PPAR-γ和LPL基因及蛋白表达量进行了检测。PPAR-γ在成脂早期即表达，它还可调控其他脂肪细胞特异性基因的表达，从而调控成脂分化。PPAR-γ是脂肪细胞分化的决定性因子，无论是在体内还是体外实验都已证实PPAR-γ的表达是脂肪细胞形成所必需因素[17-23]。LPL是细胞分化为脂肪细胞经典而重要的标志，不仅在分化早期表达，在脂肪细胞分化前期及成熟脂肪细胞均可表达[24-26]。研究结果提示，在A组3T3-L1前脂肪细胞可见PPAR-γ基因表达，B组细胞PPAR-γ基因相对表达量较A组显著下降，提示烧伤血清通过基因水平调控3T3-L1前脂肪细胞的成脂分化。A、B组均未采用成脂诱导剂进行培养，故LPL基因相对表达量甚微，两组间比较也无明显差异。C组PPAR-γ基因及蛋白表达明均显著高于D组，进一步表明烧伤血清抑制了3T3-L1前脂肪细胞成脂分化。
综上述，本研究结果提示，采用大鼠烧伤血清培养3T3-L1前脂肪细胞，会降低细胞的成脂分化能力，而成脂分化能力下降是烧伤后脂肪分解代谢变化的主要原因之一。如何能有效的改善烧伤后脂肪代谢，有待更深入的研究。
