引用本文: 李刚, 张靖, 崔晓海, 赵阳, 曹培龙, 路璐, 李晓军. 聚四氟乙烯人工气管移植的形态学及病理学变化. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(7): 879-884. doi: 10.7507/1002-1892.20140194 复制
临床上由于各种原因引起的气管缺损或狭窄,治疗时需切除病变气管。理论上,气管切除后行一期端端吻合为最佳重建方式,但由于气管自身解剖结构的特殊性,该重建术成功率极低,当成人气管切除长度超过6 cm、儿童超过1 cm时,就必须植入气管替代物才能重建气管的连续性以维持气道通畅[1]。但在临床实践中,由于各种原因使得行一期端端吻合所需气管切除长度进一步缩短,当成人气管切除长度超过2 cm,端端吻合后均可能因吻合口张力过大而失败,故建议对于气管缺损> 2 cm患者尽量应用气管替代物修复重建[2]。目前研究较多的是人工气管替代物,聚四氟乙烯人工气管显示出良好应用前景[3-4]。本实验中,我们使用聚四氟乙烯微孔管包绕聚丙烯螺旋丝预制成人工气管,进行动物实验,从组织学、病理学及生物力学方面观察其替代效果,为临床研究奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康新西兰白兔40只,雌雄各半,体重4~5 kg,由西安交通大学医学院动物实验中心提供。动物常规饲养,术前1 d禁食。
1.2 人工气管制备
使用聚四氟乙烯微孔管(杜邦公司,美国),其外包绕聚丙烯螺旋丝作为支架,内径5~20 mm,长10~50 mm;内层作胶原蛋白涂层处理,提高其顺应性,有利于细胞黏附及生长,提高黏膜细胞及上皮细胞生长几率。最后采用环氧乙烷消毒,备用。见图 1。

1.3 实验分组及方法
取40只新西兰白兔,3%戊巴比妥钠腹腔注射(30 mg/mL)麻醉,颈部剃毛,行颈中线纵切口,显露并游离气管长约4 cm,注意保护颈部血管、神经、食管等重要组织,用血管系带牵引气管,切取环状软骨至胸骨段气管2 cm,制备气管缺损动物模型。注意保持残存气管内腔清洁。将实验动物随机分为2组,每组20只。实验组选用口径与兔气管一致的人工气管(长1.5 cm)进行端端吻合,用4-0 Prolene不可吸收缝线连续缝合,边距0.3 cm,针距0.3 cm,同时注意利用气管膜部的伸缩性逐针调整针距,使吻合口连接紧密;吻合完毕后聚维酮碘溶液冲洗并确认无漏气,缝合肌层和皮肤。正常对照组行一期气管端端吻合术。动物苏醒后放回笼中饲养。术后应用抗生素(头孢替氨1 g/d)3 d预防感 染。
1.4 观测指标
1.4.1 一般情况
术后观察实验动物存活情况,实验期间如有动物死亡,立即解剖明确死因及观察人工气管吻合口、内壁及外膜生长情况,同时行人工气管病理切片 观察。观察实验动物体温、活动、进食及伤口愈合情 况。
1.4.2 X线片观察
术后2、4、6个月每组随机取5 只动物,行X线片检查,观察气管位置及管腔大小等情 况。
1.4.3 大体观察
各时间点X线片观察后采用空气栓塞法处死动物,按原切口入路取出颈部气管,大体观察是否存在吻合口瘘,吻合口及表面组织生长情况以及是否存在狭窄及移位。
1.4.4 组织学观察
大体观察后取气管节段(吻合口上下各2 cm)组织,中线纵行切开,置于4%多聚甲醛中固定48 h后,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,4 μm厚切片,常规行HE染色,光镜下观察气管各层结构及新生组织类型。
1.4.5 生物力学检测
分别取术前及术后2、4、6个月实验组人工气管及对照组气管长约2 cm,采用Instron 1342型电液伺服控制材料试验机(Instron公司,英国;精确度0.5%)进行纵向拉伸试验及径向支撑试验。纵向拉伸试验:测试时,试验机以规定速率(10 mm/min)均匀拉伸试样,直至断裂。测定最大应力、最大伸长率显示材料的应力-应变关系并测定峰值载荷,以弹性模量评价气管的拉伸性能。径向支撑试验:将样本置入试验机的压缩夹具上以5 mm/min压缩速率压缩试样,至应变为70%时停止,记录此时压力,描绘各样本径向支撑载荷-应变曲线。
1.5 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示,组内各时间点间比较采用单因素方差分析,两两比较采用Tukey HSD法;两组间比较采用独立样本t检验;检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
实验过程中正常对照组动物全部存活,仅见仰头不利,动物体温、活动、进食及伤口愈合均未见异常,亦无其他并发症。实验组死亡5只动物,其中1只因麻醉过量死亡;2只分别于术后5 d和8 d开始出现轻度气促,颈部皮下有捻发感,给予抗感染治疗无好转并逐渐加重,于术后20 d和28 d死亡,解剖发现主支气管内有少量痰液,支气管内可见大量分泌物,并发生肺实变,病理检查见大量淋巴结细胞浸润,考虑为肺部感染;1只术后21 d因人工气管移位窒息死亡;1只术后1 个月颈部术区出现皮下积脓,于皮肤表面形成窦道,经抗感染治疗无好转,于术后50 d处死,解剖发现人工气管上吻合口轻度裂开,导致气管内的炎性分泌物漏至气管周围间隙引起皮下积脓,上、下吻合口均有肉芽肿增生致管腔轻度狭窄。余15只动物存活超过2个月并保持人工气管通畅,体温、活动、进食及伤口愈合均未见异常。
2.2 X线片观察
术后2、4、6个月,实验组人工气管均无明显移位,位置保持良好,无狭窄;正常对照组均未见气管狭窄。见图 2。
2.3 大体观察
术后各时间点正常对照组气管均无明显狭窄及肉芽组织增生。术后2个月,实验组自体组织与人工气管紧密贴合,两者融为一体;取出的人工气管结构完整,无变形或塌陷、漏气,管腔通畅。4个月,自体组织和人工气管融合较好,两者紧密贴合,吻合口处有少量肉芽肿形成;人工气管无变形。6个月,人工气管内壁基本被上皮细胞覆盖,吻合口处有少量肉芽肿形成,人工气管和自体气管紧密贴合。见图 3。
2.4 组织学观察
术后各时间点正常对照组均无明显肉芽组织增生。术后2个月,实验组人工气管内壁无明显上皮组织,内壁可见薄层黏液覆盖,吻合口无肉芽肿形成,气管上皮越过吻合口向人工气管内壁有少量生长(3~5 mm)。4个月,人工气管内壁有部分上皮细胞覆盖,未完全内皮化,未见气管纤毛柱状上皮,气管各层次不完整。6个月,人工气管内壁基本被上皮细胞覆盖,并出现部分气管纤毛柱状上皮,已基本具备了气管的生理功能。见图 4。
2.5 生物力学检测
2.5.1 纵向拉伸试验
正常对照组及实验组人工气管移植前后弹性模量和最大应力比较,差异均无统计学意义(P> 0.05)。正常对照组气管的峰值载荷和最大伸长率均显著高于各时间点实验组人工气管,差异有统计学意义(P< 0.05);实验组内各时间点间比较,差异均无统计学意义(P> 0.05)。见表 1。

2.5.2 径向支撑试验
实验组各时间点人工气管压缩70%时均未被压碎,能恢复原状且保持良好结构。实验组移植前后各时间点载荷值差异无统计学意义(P> 0.05),但与正常对照组比较差异均有统计学意义(P< 0.05)。见图 5。

3 讨论
目前长段气管缺损重建仍是胸外科研究热点。人工气管可定义为以医用高分子材料备生物材料制备的管状物,取代因癌症或意外伤害而切除的气管或部分支气管,并能很好替代其通气、分泌、防御及清洁等功能。无论是同种异体气管移植还是人工气管重建气道,均存在较多问题,如人工气管重建气道后吻合口瘘、吻合口狭窄、假体移位等[5]。人工气管材料应具备安全、低免疫原性及良好的组织相容性等特点。目前研制的具备上述条件的人工气管生物材料有刚性材料和柔性材料,前者如金属钛、聚丙烯纤维网、羟基磷灰石等;后者如聚四氟乙烯等各种高分子材料、硅胶等[6]。另外,气管组织工程应用的脱细胞基质,包括空肠、膀胱、主动脉和气管等,更好地解决了免疫原性、组织相容性等难题[7-10]。但是,气管的开放状态使得植入的人工气管始终处于与外环境接触状态,致使细菌污染几率大增,且目前人工气管相关研究均未能完全解决人工气管内皮化的问题,致使人工气管的替代性能变差、成功率降低[6, 11]。
目前,如何促进人工气管腔内表面上皮化及血管再生是人工气管研究的关键点。本实验中的人工气管是由聚四氟乙烯经聚合而成的高分子化合物,其结构简式为-(CF2-CF2-)n,具有优良的化学稳定性、耐腐蚀性,酸碱度呈中性,是目前耐腐蚀性能最佳材料之一,除三氟化氯、五氟化氯和液氟外,能耐其他一切化学药品,且具有密封性、高润滑不黏性、疏水性、电绝缘性和良好的抗老化能力,耐温优异(能在- 180~250℃下长期工作,允许骤冷骤热或冷热交替操作);另外,聚四氟乙烯对人无毒性,广泛应用于生物医学材料领域,其中应用最广泛的是人工血管。基于上述特点,本实验采用聚四氟乙烯微孔管作为人工气管原材料,其外包绕聚丙烯螺旋丝以增强管壁张力,对其组织适应性及安全性进行了初步观察[12]。
本实验旨在探讨一种能与受体气管融合成为一体的人工气管,故仅制备小段(2 cm长)气管缺损重建动物模型。结果显示,实验组15只(75%)动物存活超过2个月并保持人工气管通畅,人工气管外组织生成类似气管样组织,可填充缺损区域,但必须有足够时间(> 4 个月)。术后2个月组织学观察发现,人工气管内壁无明显上皮组织,表面仅少量黏液覆盖,说明人工气管无塌陷及移位等,其气道功能可充分实现,但人工气管仍无内皮覆盖。术后4个月人工气管内壁有部分上皮细胞覆盖,但未完全内皮化,未见气管纤毛柱状上皮,气管各层次不完整。术后6个月人工气管内壁气管各层结构仍不完整,但上皮范围较4个月进一步增大,其中出现部分气管纤毛柱状上皮,表明此时的人工气管基本具备气管的生理功能。
我们还对样本进行了纵向拉伸试验及径向支撑试验。拉伸试验是在承受轴向拉伸载荷下测定材料特性的方法,可测定材料的一系列强度指标和塑性指标,是材料机械性能试验的基本方法之一;径向支撑力是管道对径向外压的抗力或管道对作用于其外力的应变力,此特性决定人工气管能否发挥足够的支撑作用,直接影响其临床应用前景。结果显示,尽管人工气管在生物力学性能方面与正常兔气管有一定差距,但人工气管植入动物体内后,其原有结构保持良好,无塌陷、皱缩、变形、滑脱等现象,表明聚四氟乙烯材料的生物力学性能在动物体内基本适合气管移植。
关于人工气管的缝合方式,有的采用间断内嵌式缝合,可防止自体气管断端的收缩狭窄[13]。我们采用端端连续缝合,术后未发现自体气管断端收缩狭窄,Prolene不可吸收缝线保证了吻合的牢固性[14]。术后观察发现,气管吻合口能长时间保持张力,且缝线对组织的切割和异物反应均较轻,能有效防止吻合口漏气。虽然本实验中1例人工气管吻合口轻度裂开,并最终导致实验动物死亡,但吻合口裂开可能与实验动物本身愈合能力较差及合并感染有关。因此整体吻合效果尚可,Prolene不可吸收缝线是较适合吻合人工气管的缝线。
综上述,聚四氟乙烯人工气管基本达到气管重建的要求,具有良好的组织相容性和通气性能,并可诱导受体气管内外组织生成完整气管,气管各层次比较符合生理学状态,实验动物可短期存活;但参照国际公认的人工气管标准要求[15],其仍存在吻合口肉芽组织 增生严重、管腔不能完全上皮化、气管移位等问题,暂不能应用于临床。后期可考虑于管壁内侧涂抹干细胞或自体皮肤、心包、大网膜等组织[16-19];还可考虑将3-D打印技术应用于人工气管,有望解决上述问题[20]。
临床上由于各种原因引起的气管缺损或狭窄,治疗时需切除病变气管。理论上,气管切除后行一期端端吻合为最佳重建方式,但由于气管自身解剖结构的特殊性,该重建术成功率极低,当成人气管切除长度超过6 cm、儿童超过1 cm时,就必须植入气管替代物才能重建气管的连续性以维持气道通畅[1]。但在临床实践中,由于各种原因使得行一期端端吻合所需气管切除长度进一步缩短,当成人气管切除长度超过2 cm,端端吻合后均可能因吻合口张力过大而失败,故建议对于气管缺损> 2 cm患者尽量应用气管替代物修复重建[2]。目前研究较多的是人工气管替代物,聚四氟乙烯人工气管显示出良好应用前景[3-4]。本实验中,我们使用聚四氟乙烯微孔管包绕聚丙烯螺旋丝预制成人工气管,进行动物实验,从组织学、病理学及生物力学方面观察其替代效果,为临床研究奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康新西兰白兔40只,雌雄各半,体重4~5 kg,由西安交通大学医学院动物实验中心提供。动物常规饲养,术前1 d禁食。
1.2 人工气管制备
使用聚四氟乙烯微孔管(杜邦公司,美国),其外包绕聚丙烯螺旋丝作为支架,内径5~20 mm,长10~50 mm;内层作胶原蛋白涂层处理,提高其顺应性,有利于细胞黏附及生长,提高黏膜细胞及上皮细胞生长几率。最后采用环氧乙烷消毒,备用。见图 1。

1.3 实验分组及方法
取40只新西兰白兔,3%戊巴比妥钠腹腔注射(30 mg/mL)麻醉,颈部剃毛,行颈中线纵切口,显露并游离气管长约4 cm,注意保护颈部血管、神经、食管等重要组织,用血管系带牵引气管,切取环状软骨至胸骨段气管2 cm,制备气管缺损动物模型。注意保持残存气管内腔清洁。将实验动物随机分为2组,每组20只。实验组选用口径与兔气管一致的人工气管(长1.5 cm)进行端端吻合,用4-0 Prolene不可吸收缝线连续缝合,边距0.3 cm,针距0.3 cm,同时注意利用气管膜部的伸缩性逐针调整针距,使吻合口连接紧密;吻合完毕后聚维酮碘溶液冲洗并确认无漏气,缝合肌层和皮肤。正常对照组行一期气管端端吻合术。动物苏醒后放回笼中饲养。术后应用抗生素(头孢替氨1 g/d)3 d预防感 染。
1.4 观测指标
1.4.1 一般情况
术后观察实验动物存活情况,实验期间如有动物死亡,立即解剖明确死因及观察人工气管吻合口、内壁及外膜生长情况,同时行人工气管病理切片 观察。观察实验动物体温、活动、进食及伤口愈合情 况。
1.4.2 X线片观察
术后2、4、6个月每组随机取5 只动物,行X线片检查,观察气管位置及管腔大小等情 况。
1.4.3 大体观察
各时间点X线片观察后采用空气栓塞法处死动物,按原切口入路取出颈部气管,大体观察是否存在吻合口瘘,吻合口及表面组织生长情况以及是否存在狭窄及移位。
1.4.4 组织学观察
大体观察后取气管节段(吻合口上下各2 cm)组织,中线纵行切开,置于4%多聚甲醛中固定48 h后,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,4 μm厚切片,常规行HE染色,光镜下观察气管各层结构及新生组织类型。
1.4.5 生物力学检测
分别取术前及术后2、4、6个月实验组人工气管及对照组气管长约2 cm,采用Instron 1342型电液伺服控制材料试验机(Instron公司,英国;精确度0.5%)进行纵向拉伸试验及径向支撑试验。纵向拉伸试验:测试时,试验机以规定速率(10 mm/min)均匀拉伸试样,直至断裂。测定最大应力、最大伸长率显示材料的应力-应变关系并测定峰值载荷,以弹性模量评价气管的拉伸性能。径向支撑试验:将样本置入试验机的压缩夹具上以5 mm/min压缩速率压缩试样,至应变为70%时停止,记录此时压力,描绘各样本径向支撑载荷-应变曲线。
1.5 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示,组内各时间点间比较采用单因素方差分析,两两比较采用Tukey HSD法;两组间比较采用独立样本t检验;检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
实验过程中正常对照组动物全部存活,仅见仰头不利,动物体温、活动、进食及伤口愈合均未见异常,亦无其他并发症。实验组死亡5只动物,其中1只因麻醉过量死亡;2只分别于术后5 d和8 d开始出现轻度气促,颈部皮下有捻发感,给予抗感染治疗无好转并逐渐加重,于术后20 d和28 d死亡,解剖发现主支气管内有少量痰液,支气管内可见大量分泌物,并发生肺实变,病理检查见大量淋巴结细胞浸润,考虑为肺部感染;1只术后21 d因人工气管移位窒息死亡;1只术后1 个月颈部术区出现皮下积脓,于皮肤表面形成窦道,经抗感染治疗无好转,于术后50 d处死,解剖发现人工气管上吻合口轻度裂开,导致气管内的炎性分泌物漏至气管周围间隙引起皮下积脓,上、下吻合口均有肉芽肿增生致管腔轻度狭窄。余15只动物存活超过2个月并保持人工气管通畅,体温、活动、进食及伤口愈合均未见异常。
2.2 X线片观察
术后2、4、6个月,实验组人工气管均无明显移位,位置保持良好,无狭窄;正常对照组均未见气管狭窄。见图 2。
2.3 大体观察
术后各时间点正常对照组气管均无明显狭窄及肉芽组织增生。术后2个月,实验组自体组织与人工气管紧密贴合,两者融为一体;取出的人工气管结构完整,无变形或塌陷、漏气,管腔通畅。4个月,自体组织和人工气管融合较好,两者紧密贴合,吻合口处有少量肉芽肿形成;人工气管无变形。6个月,人工气管内壁基本被上皮细胞覆盖,吻合口处有少量肉芽肿形成,人工气管和自体气管紧密贴合。见图 3。
2.4 组织学观察
术后各时间点正常对照组均无明显肉芽组织增生。术后2个月,实验组人工气管内壁无明显上皮组织,内壁可见薄层黏液覆盖,吻合口无肉芽肿形成,气管上皮越过吻合口向人工气管内壁有少量生长(3~5 mm)。4个月,人工气管内壁有部分上皮细胞覆盖,未完全内皮化,未见气管纤毛柱状上皮,气管各层次不完整。6个月,人工气管内壁基本被上皮细胞覆盖,并出现部分气管纤毛柱状上皮,已基本具备了气管的生理功能。见图 4。
2.5 生物力学检测
2.5.1 纵向拉伸试验
正常对照组及实验组人工气管移植前后弹性模量和最大应力比较,差异均无统计学意义(P> 0.05)。正常对照组气管的峰值载荷和最大伸长率均显著高于各时间点实验组人工气管,差异有统计学意义(P< 0.05);实验组内各时间点间比较,差异均无统计学意义(P> 0.05)。见表 1。

2.5.2 径向支撑试验
实验组各时间点人工气管压缩70%时均未被压碎,能恢复原状且保持良好结构。实验组移植前后各时间点载荷值差异无统计学意义(P> 0.05),但与正常对照组比较差异均有统计学意义(P< 0.05)。见图 5。

3 讨论
目前长段气管缺损重建仍是胸外科研究热点。人工气管可定义为以医用高分子材料备生物材料制备的管状物,取代因癌症或意外伤害而切除的气管或部分支气管,并能很好替代其通气、分泌、防御及清洁等功能。无论是同种异体气管移植还是人工气管重建气道,均存在较多问题,如人工气管重建气道后吻合口瘘、吻合口狭窄、假体移位等[5]。人工气管材料应具备安全、低免疫原性及良好的组织相容性等特点。目前研制的具备上述条件的人工气管生物材料有刚性材料和柔性材料,前者如金属钛、聚丙烯纤维网、羟基磷灰石等;后者如聚四氟乙烯等各种高分子材料、硅胶等[6]。另外,气管组织工程应用的脱细胞基质,包括空肠、膀胱、主动脉和气管等,更好地解决了免疫原性、组织相容性等难题[7-10]。但是,气管的开放状态使得植入的人工气管始终处于与外环境接触状态,致使细菌污染几率大增,且目前人工气管相关研究均未能完全解决人工气管内皮化的问题,致使人工气管的替代性能变差、成功率降低[6, 11]。
目前,如何促进人工气管腔内表面上皮化及血管再生是人工气管研究的关键点。本实验中的人工气管是由聚四氟乙烯经聚合而成的高分子化合物,其结构简式为-(CF2-CF2-)n,具有优良的化学稳定性、耐腐蚀性,酸碱度呈中性,是目前耐腐蚀性能最佳材料之一,除三氟化氯、五氟化氯和液氟外,能耐其他一切化学药品,且具有密封性、高润滑不黏性、疏水性、电绝缘性和良好的抗老化能力,耐温优异(能在- 180~250℃下长期工作,允许骤冷骤热或冷热交替操作);另外,聚四氟乙烯对人无毒性,广泛应用于生物医学材料领域,其中应用最广泛的是人工血管。基于上述特点,本实验采用聚四氟乙烯微孔管作为人工气管原材料,其外包绕聚丙烯螺旋丝以增强管壁张力,对其组织适应性及安全性进行了初步观察[12]。
本实验旨在探讨一种能与受体气管融合成为一体的人工气管,故仅制备小段(2 cm长)气管缺损重建动物模型。结果显示,实验组15只(75%)动物存活超过2个月并保持人工气管通畅,人工气管外组织生成类似气管样组织,可填充缺损区域,但必须有足够时间(> 4 个月)。术后2个月组织学观察发现,人工气管内壁无明显上皮组织,表面仅少量黏液覆盖,说明人工气管无塌陷及移位等,其气道功能可充分实现,但人工气管仍无内皮覆盖。术后4个月人工气管内壁有部分上皮细胞覆盖,但未完全内皮化,未见气管纤毛柱状上皮,气管各层次不完整。术后6个月人工气管内壁气管各层结构仍不完整,但上皮范围较4个月进一步增大,其中出现部分气管纤毛柱状上皮,表明此时的人工气管基本具备气管的生理功能。
我们还对样本进行了纵向拉伸试验及径向支撑试验。拉伸试验是在承受轴向拉伸载荷下测定材料特性的方法,可测定材料的一系列强度指标和塑性指标,是材料机械性能试验的基本方法之一;径向支撑力是管道对径向外压的抗力或管道对作用于其外力的应变力,此特性决定人工气管能否发挥足够的支撑作用,直接影响其临床应用前景。结果显示,尽管人工气管在生物力学性能方面与正常兔气管有一定差距,但人工气管植入动物体内后,其原有结构保持良好,无塌陷、皱缩、变形、滑脱等现象,表明聚四氟乙烯材料的生物力学性能在动物体内基本适合气管移植。
关于人工气管的缝合方式,有的采用间断内嵌式缝合,可防止自体气管断端的收缩狭窄[13]。我们采用端端连续缝合,术后未发现自体气管断端收缩狭窄,Prolene不可吸收缝线保证了吻合的牢固性[14]。术后观察发现,气管吻合口能长时间保持张力,且缝线对组织的切割和异物反应均较轻,能有效防止吻合口漏气。虽然本实验中1例人工气管吻合口轻度裂开,并最终导致实验动物死亡,但吻合口裂开可能与实验动物本身愈合能力较差及合并感染有关。因此整体吻合效果尚可,Prolene不可吸收缝线是较适合吻合人工气管的缝线。
综上述,聚四氟乙烯人工气管基本达到气管重建的要求,具有良好的组织相容性和通气性能,并可诱导受体气管内外组织生成完整气管,气管各层次比较符合生理学状态,实验动物可短期存活;但参照国际公认的人工气管标准要求[15],其仍存在吻合口肉芽组织 增生严重、管腔不能完全上皮化、气管移位等问题,暂不能应用于临床。后期可考虑于管壁内侧涂抹干细胞或自体皮肤、心包、大网膜等组织[16-19];还可考虑将3-D打印技术应用于人工气管,有望解决上述问题[20]。