引用本文： 宋志芳, 刘德伍. 微小RNA在皮肤发育再生及创面愈合中的作用. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(7): 913-918. doi: 10.7507/1002-1892.20140200 复制
微小RNA（microRNA，miRNA）作为内源性单链非编码RNA，在机体发育、细胞增殖分化与凋亡、肿瘤形成及疾病发生发展等许多生物过程中发挥重要作用。越来越多研究表明[1-3]，miRNA参与调控皮肤及其附属器的形成和稳态，且与皮肤再生修复显著相关。本文就miRNA在皮肤发育、再生与创面愈合各环节中的作用作一综述。
1 miRNA的生物合成及功能概述
miRNA是一类由19～24个核苷酸组成的单链非编码RNA分子，其基因位于内含子或非编码区的外显子或间隔区。大多数miRNA基因是孤立的，并在自身启动子的控制下表达，少数miRNA基因是成簇的，可以共表达[4]。在哺乳动物的基因组中，miRNA基因占基因总数的1%～3%[5]。miRNA的加工过程如下：首先，在细胞核内，RNA聚合酶Ⅱ将编码miRNA的基因转录成含有几千个碱基、具备茎环结构的分子，即初级miRNA（pri-miRNA）；pri-miRNA与信使核糖核酸（mRNA）分子类似，亦含有5'帽子结构和 3'多聚A尾巴。然后，pri-miRNA的茎部被RNA酶ⅢDrosha及其辅助因子DGCR8非对称地切割，形成约70个核苷酸长度的前体miRNA（pre-miRNA）。接着，pre-miRNA被核转运受体Exportin-5及核蛋白RanGTP输送至细胞质中，由RNA酶ⅢDicer切割其环部，产生一个短的双链分子，其中一条单链为成熟miRNA，能结合到靶mRNA的3'非翻译区来调节基因的表达；另一条为与之互补的miRNA*，miRNA*一般被降解，在某些情况下miRNA*可不被降解，亦靶向结合某些特定的基因[6]。研究发现，miRNA与靶基因的结合位点位于其自身5'端的第2～8个核苷酸，即由7个核苷酸组成的“种子序列”，并且是通过RNA诱导的沉默复合物（RNA induced silencing complex，RISC）发挥作用[7]。虽然miRNA通过RISC调节基因表达的精确机制仍不清楚，但一般认为miRNA和靶基因之间的互补程度是调节基因表达的主要机制[8]，即两者如果高度互补，近乎完美，靶基因则被降解；如果互补程度低，则对靶基因进行翻译抑制。据估计，超过1/3编码蛋白的基因受miRNA调控[9]，miRNA通过转录后调控基因表达影响细胞蛋白质的合成[10]。因此，miRNA是动物发育及许多生物过程的重要调控者，如信号转导、细胞增殖与分化、细胞凋亡、衰老与死亡、免疫调节、炎性反应、脂肪代谢[11]、器官发育、肿瘤形成及疾病的发生发展等。皮肤的形态发生是一个复杂过程，受一系列信号通路调节，已有许多研究证实稳定的miRNA调控网络在这一过程发挥极其重要的作用，miRNA异常必将导致皮肤形态发生障碍[1-3]。
2 miRNA在皮肤发育中的作用
初次探讨miRNA在皮肤中的作用是通过缺失miRNA生物合成所需的关键酶和蛋白来进行的。小鼠胚胎发育早期组成性缺失Dicer[12]或DGCR8[13]可导致胚胎在皮肤发育之前死亡，而在小鼠胚胎发育晚期条件性缺失Dicer可以更好地研究miRNA功能。Yi等[2]在表皮特异性启动子角蛋白14的介导下将胚胎皮肤祖细胞的Dicer条件性敲除，即胚胎发育17.5 d时皮肤相关的miRNA缺失，晚于表皮分化时间（胚胎发育13.5 d）及毛发初步发育时间（胚胎发育15.5 d）[3]。Dicer敲除后新生小鼠的表型基本正常，但出生后 1～2 d体重开始下降，4～6 d出现明显脱水，在毛被发育前死亡。组织学检查示，小鼠皮肤毛囊发育不全及错位，凋亡增加，毛囊形成过程中不向内陷，而是向表皮外翻、退化，表皮层形成囊状结构，表皮屏障功能丧失，导致Dicer缺失小鼠脱水和早期死亡。且毛囊外根鞘膨凸部的干细胞标志物，如角蛋白15和CD34缺失，提示毛囊发育缺陷是由于毛囊干细胞的早期缺失所致。与之对比，滤泡间表皮未受到明显影响，保持其正常分化程序，表明一部分miRNAs（或它们的靶基因）作用于毛囊干细胞，而不是滤泡间表皮。除了Dicer，DGCR8也是miRNA生物合成过程中必不可少的辅酶。使用类似敲除Dicer的方法使表皮特异性缺失DGCR8，结果发现，DGCR8缺失的小鼠表型和Dicer缺失小鼠无太大差异，如毛囊外翻、毛球细胞凋亡增多、皮肤粗糙、脱水及新生小鼠致死现象等[14]。通过研究Dicer和DGCR8敲除的小鼠皮肤，揭示了miRNAs在皮肤形态发生、毛囊干细胞的维持、表皮细胞增殖和凋亡中具有重要作用。
3 单个miRNA在皮肤发育中的表达及功能
关于单个miRNA在皮肤调控机制中的研究也有很多报道，Andl等[15]对正常新生小鼠和转基因新生小鼠（即通过表达Wnt抑制剂DKK1干扰毛发发育的小鼠）全层皮肤的miRNA进行芯片扫描以辨别miRNA表达有无差异，结果发现，miR-200家族（miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141及 miR-149）、miR-19/20家族（miR-19b、miR-20、miR-17-5p及miR-93）在表皮中优先表达，而miR-199a、miR-214、miR-126、miR-143、miR-152在毛囊中优先表达。
许多miRNAs对皮肤有特定功能[1, 16]。miR-203是第一个被发现在表皮及毛囊丰富表达的miRNA。Sonkoly等[17]系统分析了miR-203在健康人皮肤及各器官中的表达，结果显示miR-203在皮肤中的表达比在其他器官中高出100倍，被称为是“皮肤特异性的miRNA”。另一项研究发现，miR-203在小鼠胚胎13.5 d时的皮肤（为单层上皮）中几乎检测不到，但胚胎15.5 d（表皮开始分层时）后成为皮肤中表达最丰富的miRNA，提示其表达与皮肤分化和分层密切相关[18]。成熟皮肤原位杂交实验发现[18]，miR-203高表达于分化后的细胞，如表皮基底上层或毛囊的内根鞘，但不表达于干/祖细胞，如表皮基底层、毛囊外根鞘隆突部。且miR-203这种在皮肤最外层高表达的方式在斑马鱼[19]和人[20]皮肤组织中也得到了证实，表示一种跨物种的保守功能。当角质形成细胞在体外被钙[21]、12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯[22]或维生素D[22]诱导分化时，miR-203表达迅速增加。在表皮基底层过表达miR-203的转基因小鼠出生后不久死亡，组织学检查显示表皮菲薄、基底层角蛋白5阳性细胞耗竭，提示miR-203过表达能诱导角质形成细胞分化，减少干细胞集落形成能力，并诱导基底层细胞退出细胞周期[18]。然而，miR-203诱导角质形成细胞分化是有限的，其主要任务是限制干细胞从基底层过渡至基底上层时的增殖潜能[23]。转录因子p63是表皮角质形成细胞中miR-203的重要靶基因，它是不同物种复层上皮组织中一个重要的干性维持者，若小鼠缺失p63会导致所有复层上皮灾难性损失[24]。p63和miR-203的表达是一种相互排斥的模式，生物信息学和实验表明，miR-203通过直接抑制p63表达，促进基底层细胞退出细胞周期且向基底上层过渡[25]。另外，p63亦受miR-720、miR-574-3p[26]靶向调控，与miR-203的表达模式及功能类似，miR-720、miR-574-3p也主要在人表皮基底上层表达，参与表皮分化。研究表明，p63调节角质形成细胞细胞周期进程的机制之一是通过抑制miR-34家族成员（miR-34a、miR-34c）实现的[27]，继而增加细胞周期蛋白D1、CDK4的表达，促进干细胞由G1期向S期转变，即促进小鼠干细胞增殖。p63还能通过转录调控Dicer和miR-130b从而达到抑制肿瘤及其转移的作用[28]。
鉴于miRNA在调节胚胎和成体干细胞的关键作用，可以预见其也能调节表皮干细胞。研究显示，miR-125b在小鼠的表皮干细胞高表达，而在早期子代细胞表达大幅下降，其通过转录后抑制靶基因Blimp1及VDR维持角质形成细胞“干性”[29]，若在转基因小鼠的皮肤干细胞及其子代细胞中持续过表达miR-125b可导致表皮增厚、皮脂腺增大，且未能产生毛被，说明了miR-125b能调节干细胞的自我更新，抑制干细胞分化。同样，在人表皮干细胞中高表达的miR-24通过转录后抑制细胞周期蛋白依赖激酶抑制蛋白P27、P16，促进干细胞由G1期向S期转变，细胞增殖；相反，拮抗miR-24可抑制表皮干细胞增殖[30] 。
毛囊周期分为生长期、退行期和静止期，同时伴有表皮和毛囊显微解剖、血管、神经的显著变化[31]。miR-31为控制毛发生长周期的一个关键因子，其在小鼠毛发生长期表达显著增加，在退行期和静止期下降，通过抑制靶基因Krt16、Dlx3、Fgf10来抑制毛发生长；相反，抑制miR-31的表达后，毛囊数量增加，毛球增多，毛囊外根鞘增生肥厚[32]。Peng等[33]研究还发现，在人或小鼠中miR-31通过负向调控缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1），继而激活Notch通路，促进表皮干细胞分化。
复制性细胞衰老是细胞分裂过程中不可避免地发生细胞损伤积累的结果，随着年龄增加，突变和损害几率也增加，细胞开始衰老，衰老时细胞周期停滞，细胞衰老可防止癌变，保护机体远离癌症。研究发现miR-137、miR-668[34]、miR-191[35]等与人角质形成细胞的复制性衰老有关，其通过转录后下调细胞周期调节基因SATB1、CDK6，阻止细胞从G1期进入S期，导致细胞周期停滞，增殖停止，诱导角质形成细胞进入衰老程 序。
4 miRNA与皮肤创面愈合
创面愈合涉及3个相互重叠的阶段[36]：炎性阶段，主要表现为血管扩张，毛细血管通透性增加，体液外渗及炎性细胞浸润；增殖阶段，主要表现为上皮化、血管形成及肉芽组织形成；重塑阶段，主要表现为胶原沉积。皮肤创面愈合的不同阶段中miRNA的表达各不相同，miRNA的异常表达在创面畸形愈合中起着关键作用[37]。
4.1 炎性阶段miRNA的作用
创面炎性反应始于中性粒细胞及其他白细胞通过受损血管被动渗漏入创面，接着创面的免疫细胞释放趋化因子、细胞因子及生长因子如巨噬细胞趋化蛋白、PDGF、血小板因子Ⅳ、IL-1β、TGF-β、TNF-α、Toll样受体（toll-like receptors，TLRs），继而吸引中性粒细胞和单核细胞聚集，聚集的中性粒细胞具有清洁作用，并杀死入侵的微生物；渗出的单核细胞成熟为巨噬细胞，发挥吞噬、促炎或抗炎和促血管生成等作用。
研究发现创面释放的炎性介质能诱导特异的miRNA表达，继而miRNA又能沉默大量促炎因子，即体内存在一个调节环。miR-146[38]、miR-155[38]、miR-21[39]及miR-125b[40]参与了创面炎症及免疫应答，这些miRNAs能被促炎因子，如IL-1β、TNF-α和TLRs等诱导表达。miR-146家族包括两个成员：miR-146a和miR-146b，启动子分析研究提示miR-146a为NF-κB依赖的基因，暴露于炎症环境下，促炎因子如TNF-α或IL-1β、或TLR-2、4、5能显著诱导其表达。IRAK1和TRAF6为其靶基因，miR-146a与靶基因结合通过负反馈循环机制调控TLR信号，抑制IL-8及正常T细胞表达和分泌的活性调节蛋白RANTES的释放。除了TRAF6和IRAK1，IRAK2为miR-146a的另一个靶基因，能调节干扰素的产生。miR-155同样能被许多炎性介质诱导表达，如TNF-α、聚肌苷酸-聚胞苷酸和IFN-β，通过作用于c/ebp靶基因促进IL-10发挥抗炎作用。miR-21亦是一种常见的受炎症诱导的miRNA，能转录后抑制多个靶基因。与炎症有关的靶基因是促炎因子程序性细胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4），miR-21通过抑制PDCD4使IL-10产生增加，从而抑制了脂多糖的促炎作用。炎症期间TLR-4亦能诱导miR-125b的表达，同时miR-125b能直接结合至TNF-α的3'非翻译区继而靶向沉默TNF-α的表 达。
4.2 增殖阶段miRNA的作用
增殖阶段重要特征之一是血管形成。内皮细胞增殖迁移和毛细血管形成是血管形成的早期表现，毛细血管进入创面床是支持组织再生的关键，若抑制创面血管生成，会严重影响创面愈合[41]。研究发现敲除Dicer、Drosha后抑制了内皮细胞毛细血管发芽、迁移和血管生成，提示miRNA参与血管生成[42]。Dicer对鼠胚胎血管生成也是必需的[43]，耗竭内皮细胞的miRNA将抑制出生后各种刺激诱导血管生成的反应，如外源性VEGF、肿瘤、肢体缺血和创面。已发现的促血管生成的miRNA有miR-17-92[44]、miR-126[45]、miR-130a[46]、miR-210[47-48]、miR-296[49]、miR-378[50]等。研究发现，miR-17-92在创面增殖阶段往往表达增加，其靶基因血小板反应蛋白1（thrombospondin 1，TSP-1）及结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）为抗血管生成因子，miR-17-92通过抑制TSP-1及CTGF，发挥促血管生成作用。有报道[45]miR-126能促进血管内皮细胞对VEGF的反应性，在对斑马鱼的研究中发现，敲除miR-126后导致胚胎发育过程中血管完整性丧失，出血增加。其靶基因Spred1及PIK3R2能抑制VEGF的表达，miR-126通过抑制Spred1及PIK3R2 实现调节血管完整性和血管生成的作用。已发现GAX、HOXA5基因有抑制血管内皮细胞的血管生成作用，而miR-130a通过抑制GAX、HOXA5基因表达，从而促进血管内皮细胞发挥血管生成作用。另有研究发现[47-48]当血管内皮细胞暴露于缺氧环境下，miR-210的表达逐渐增加，其通过抑制靶基因EFNA3促进基底膜毛细管样结构的形成及内皮细胞迁移；相反，拮抗miR-210则抑制血管内皮细胞生长及诱导细胞凋亡。炎症环境下生长因子能诱导miR-296显著升高，其通过抑制靶基因HGS降低了生长因子受体VEGFR-2和PDGFR-β的降解，最终血管生成增加。另外miR-378通过抑制靶基因Fus-1、Sufu的表达促进血管生成。抑制血管生成的miRNA有miR-92a[51-52]、miR-17[53]、miR-15b、miR-16、miR-20a[54]、miR-221、miR-222[55]、miR-320[56]等。miR-92a主要表达于人内皮细胞，在心肌梗死小鼠模型中，内皮细胞过表达miR-92a，通过抑制整合素α5的表达能阻断血管发生；相反，抑制miR-92a能促进血管生长和损伤组织的功能恢复。有报道[53]创面局部缺血能上调miR-17，通过抑制靶基因Janus Kinase1，从而抑制血管内皮细胞芽的形成，最终血管数量减少。同样，缺氧条件下，miR-15b、miR-16、miR-20a表达上调，能直接抑制VEGF的表达，从而减少血管生成。研究报道[56]miR-320表达于微血管内皮细胞，通过抑制促血管生成作用的IGF-1表达，影响血管内皮细胞的增殖与迁移，血管生成减少。miR-221、miR-222亦表达于血管内皮细胞，通过抑制血管生成因子c-kit的表达来控制内皮细胞形成新的毛细血管。
增殖阶段另一个重要特征是表皮细胞再生，表现为创面边缘角质形成细胞的迁移和增殖[57]。沉默SHIP2和增强AKT信号能加速角质形成细胞迁移，miR-205通过抑制SHIP2的转录促进角质形成细胞迁移，并拮抗角质形成细胞凋亡，有利于上皮的稳定及创面愈合；拮抗miR-205后，可使创面的丝状肌动蛋白减少，细胞黏附力增加，焦点接触增强，从而创面愈合延迟[58]。而miR-205在体内受miR-184的制约，miR-184能拮抗miR-205的抗SHIP2能力，从而使角质形成细胞凋亡、死亡增加[59]。miR-210也通过调控角质形成细胞的增殖影响创面闭合，Biswas等[60]研究发现miR-210在体内缺血性创面中表达上调，miR-210属于对缺氧敏感的miRNA，而大多数慢性创面属缺血缺氧性创面，在HIF-1α的刺激下miR-210表达增加，抑制靶基因细胞周期调节蛋白E2F3的转录[61]，阻碍细胞从G1期进入S期，DNA合成率及细胞增殖率明显下降，创面愈合延迟。miR-21也参与了创面愈合[62]，创面愈合过程中TGF-β1上调miR-21的表达，其通过抑制靶基因TIMP3、TIAM1从而促进角质形成细胞的迁移及创面的再上皮化。
4.3 重塑阶段miRNA的作用
胶原沉积是重塑阶段的一个主要特征。在纤维增生性瘢痕疙瘩形成中，miRNA发挥了重要作用。哺乳动物妊娠早期阶段胎儿皮肤无痕愈合[63]，而在后期转成瘢痕愈合表型[64]，一些miRNA在两阶段之间的表达存在明显差异，尤其是miR-29b、miR-29c和miR-192在妊娠后期显著升高，提示参与了瘢痕愈合[65]。miR-29b和miR-29c抑制多种参与无痕愈合信号通路有关的蛋白质，包括细胞外基质蛋白、抗肝纤维化TGF-β、Smad蛋白及β-catenin蛋白[66]。miR-192通过靶向抑制Smad相互作用蛋白1以增强胶原蛋白12的表达[67]。miR-29a能在转录后直接抑制胶原蛋白的表达，而在正常皮肤成纤维细胞，miR-29a受控于TGF-β、PDGF-B和IL-4[68]。Kashiyama等[69]比较了瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常成纤维细胞的miRNA表达谱，发现20个下调和7个上调的miRNA，特别是miR-196a下调最明显，miR-196a的表达量与Ⅰ、Ⅲ型胶原水平成负相关[68]。另有研究发现miR-483-3p在创面愈合的终末阶段表达上调，通过抑制靶基因MK2、MK167、YAP1的表达，抑制角质形成细胞的增殖与迁移，最终使创面再上皮化过程终止[70]。
5 展望
miRNA 在维持皮肤正常结构功能及创面再生修复过程中发挥重要作用。进一步探讨其在创面再生修复不同阶段与正常皮肤之间的差异表达，将有助于识别和发现特异性miRNAs，明确它们在皮肤创面愈合中的作用及其调控机制，并为治疗提供靶点。鉴于部分miRNA在创面修复中的重要作用，以miRNA为靶标的基因治疗可为临床难愈性创面修复提供新方法。但值得注意的是，已发现同一个miRNA在不同细胞类型中常表现不同甚至截然相反的功能，因此对于miRNA在创面再生修复各个阶段中的表达与调控作用及其多效性可能带来的副作用等，均有待深入研究。
微小RNA（microRNA，miRNA）作为内源性单链非编码RNA，在机体发育、细胞增殖分化与凋亡、肿瘤形成及疾病发生发展等许多生物过程中发挥重要作用。越来越多研究表明[1-3]，miRNA参与调控皮肤及其附属器的形成和稳态，且与皮肤再生修复显著相关。本文就miRNA在皮肤发育、再生与创面愈合各环节中的作用作一综述。
1 miRNA的生物合成及功能概述
miRNA是一类由19～24个核苷酸组成的单链非编码RNA分子，其基因位于内含子或非编码区的外显子或间隔区。大多数miRNA基因是孤立的，并在自身启动子的控制下表达，少数miRNA基因是成簇的，可以共表达[4]。在哺乳动物的基因组中，miRNA基因占基因总数的1%～3%[5]。miRNA的加工过程如下：首先，在细胞核内，RNA聚合酶Ⅱ将编码miRNA的基因转录成含有几千个碱基、具备茎环结构的分子，即初级miRNA（pri-miRNA）；pri-miRNA与信使核糖核酸（mRNA）分子类似，亦含有5'帽子结构和 3'多聚A尾巴。然后，pri-miRNA的茎部被RNA酶ⅢDrosha及其辅助因子DGCR8非对称地切割，形成约70个核苷酸长度的前体miRNA（pre-miRNA）。接着，pre-miRNA被核转运受体Exportin-5及核蛋白RanGTP输送至细胞质中，由RNA酶ⅢDicer切割其环部，产生一个短的双链分子，其中一条单链为成熟miRNA，能结合到靶mRNA的3'非翻译区来调节基因的表达；另一条为与之互补的miRNA*，miRNA*一般被降解，在某些情况下miRNA*可不被降解，亦靶向结合某些特定的基因[6]。研究发现，miRNA与靶基因的结合位点位于其自身5'端的第2～8个核苷酸，即由7个核苷酸组成的“种子序列”，并且是通过RNA诱导的沉默复合物（RNA induced silencing complex，RISC）发挥作用[7]。虽然miRNA通过RISC调节基因表达的精确机制仍不清楚，但一般认为miRNA和靶基因之间的互补程度是调节基因表达的主要机制[8]，即两者如果高度互补，近乎完美，靶基因则被降解；如果互补程度低，则对靶基因进行翻译抑制。据估计，超过1/3编码蛋白的基因受miRNA调控[9]，miRNA通过转录后调控基因表达影响细胞蛋白质的合成[10]。因此，miRNA是动物发育及许多生物过程的重要调控者，如信号转导、细胞增殖与分化、细胞凋亡、衰老与死亡、免疫调节、炎性反应、脂肪代谢[11]、器官发育、肿瘤形成及疾病的发生发展等。皮肤的形态发生是一个复杂过程，受一系列信号通路调节，已有许多研究证实稳定的miRNA调控网络在这一过程发挥极其重要的作用，miRNA异常必将导致皮肤形态发生障碍[1-3]。
2 miRNA在皮肤发育中的作用
初次探讨miRNA在皮肤中的作用是通过缺失miRNA生物合成所需的关键酶和蛋白来进行的。小鼠胚胎发育早期组成性缺失Dicer[12]或DGCR8[13]可导致胚胎在皮肤发育之前死亡，而在小鼠胚胎发育晚期条件性缺失Dicer可以更好地研究miRNA功能。Yi等[2]在表皮特异性启动子角蛋白14的介导下将胚胎皮肤祖细胞的Dicer条件性敲除，即胚胎发育17.5 d时皮肤相关的miRNA缺失，晚于表皮分化时间（胚胎发育13.5 d）及毛发初步发育时间（胚胎发育15.5 d）[3]。Dicer敲除后新生小鼠的表型基本正常，但出生后 1～2 d体重开始下降，4～6 d出现明显脱水，在毛被发育前死亡。组织学检查示，小鼠皮肤毛囊发育不全及错位，凋亡增加，毛囊形成过程中不向内陷，而是向表皮外翻、退化，表皮层形成囊状结构，表皮屏障功能丧失，导致Dicer缺失小鼠脱水和早期死亡。且毛囊外根鞘膨凸部的干细胞标志物，如角蛋白15和CD34缺失，提示毛囊发育缺陷是由于毛囊干细胞的早期缺失所致。与之对比，滤泡间表皮未受到明显影响，保持其正常分化程序，表明一部分miRNAs（或它们的靶基因）作用于毛囊干细胞，而不是滤泡间表皮。除了Dicer，DGCR8也是miRNA生物合成过程中必不可少的辅酶。使用类似敲除Dicer的方法使表皮特异性缺失DGCR8，结果发现，DGCR8缺失的小鼠表型和Dicer缺失小鼠无太大差异，如毛囊外翻、毛球细胞凋亡增多、皮肤粗糙、脱水及新生小鼠致死现象等[14]。通过研究Dicer和DGCR8敲除的小鼠皮肤，揭示了miRNAs在皮肤形态发生、毛囊干细胞的维持、表皮细胞增殖和凋亡中具有重要作用。
3 单个miRNA在皮肤发育中的表达及功能
关于单个miRNA在皮肤调控机制中的研究也有很多报道，Andl等[15]对正常新生小鼠和转基因新生小鼠（即通过表达Wnt抑制剂DKK1干扰毛发发育的小鼠）全层皮肤的miRNA进行芯片扫描以辨别miRNA表达有无差异，结果发现，miR-200家族（miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141及 miR-149）、miR-19/20家族（miR-19b、miR-20、miR-17-5p及miR-93）在表皮中优先表达，而miR-199a、miR-214、miR-126、miR-143、miR-152在毛囊中优先表达。
许多miRNAs对皮肤有特定功能[1, 16]。miR-203是第一个被发现在表皮及毛囊丰富表达的miRNA。Sonkoly等[17]系统分析了miR-203在健康人皮肤及各器官中的表达，结果显示miR-203在皮肤中的表达比在其他器官中高出100倍，被称为是“皮肤特异性的miRNA”。另一项研究发现，miR-203在小鼠胚胎13.5 d时的皮肤（为单层上皮）中几乎检测不到，但胚胎15.5 d（表皮开始分层时）后成为皮肤中表达最丰富的miRNA，提示其表达与皮肤分化和分层密切相关[18]。成熟皮肤原位杂交实验发现[18]，miR-203高表达于分化后的细胞，如表皮基底上层或毛囊的内根鞘，但不表达于干/祖细胞，如表皮基底层、毛囊外根鞘隆突部。且miR-203这种在皮肤最外层高表达的方式在斑马鱼[19]和人[20]皮肤组织中也得到了证实，表示一种跨物种的保守功能。当角质形成细胞在体外被钙[21]、12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯[22]或维生素D[22]诱导分化时，miR-203表达迅速增加。在表皮基底层过表达miR-203的转基因小鼠出生后不久死亡，组织学检查显示表皮菲薄、基底层角蛋白5阳性细胞耗竭，提示miR-203过表达能诱导角质形成细胞分化，减少干细胞集落形成能力，并诱导基底层细胞退出细胞周期[18]。然而，miR-203诱导角质形成细胞分化是有限的，其主要任务是限制干细胞从基底层过渡至基底上层时的增殖潜能[23]。转录因子p63是表皮角质形成细胞中miR-203的重要靶基因，它是不同物种复层上皮组织中一个重要的干性维持者，若小鼠缺失p63会导致所有复层上皮灾难性损失[24]。p63和miR-203的表达是一种相互排斥的模式，生物信息学和实验表明，miR-203通过直接抑制p63表达，促进基底层细胞退出细胞周期且向基底上层过渡[25]。另外，p63亦受miR-720、miR-574-3p[26]靶向调控，与miR-203的表达模式及功能类似，miR-720、miR-574-3p也主要在人表皮基底上层表达，参与表皮分化。研究表明，p63调节角质形成细胞细胞周期进程的机制之一是通过抑制miR-34家族成员（miR-34a、miR-34c）实现的[27]，继而增加细胞周期蛋白D1、CDK4的表达，促进干细胞由G1期向S期转变，即促进小鼠干细胞增殖。p63还能通过转录调控Dicer和miR-130b从而达到抑制肿瘤及其转移的作用[28]。
鉴于miRNA在调节胚胎和成体干细胞的关键作用，可以预见其也能调节表皮干细胞。研究显示，miR-125b在小鼠的表皮干细胞高表达，而在早期子代细胞表达大幅下降，其通过转录后抑制靶基因Blimp1及VDR维持角质形成细胞“干性”[29]，若在转基因小鼠的皮肤干细胞及其子代细胞中持续过表达miR-125b可导致表皮增厚、皮脂腺增大，且未能产生毛被，说明了miR-125b能调节干细胞的自我更新，抑制干细胞分化。同样，在人表皮干细胞中高表达的miR-24通过转录后抑制细胞周期蛋白依赖激酶抑制蛋白P27、P16，促进干细胞由G1期向S期转变，细胞增殖；相反，拮抗miR-24可抑制表皮干细胞增殖[30] 。
毛囊周期分为生长期、退行期和静止期，同时伴有表皮和毛囊显微解剖、血管、神经的显著变化[31]。miR-31为控制毛发生长周期的一个关键因子，其在小鼠毛发生长期表达显著增加，在退行期和静止期下降，通过抑制靶基因Krt16、Dlx3、Fgf10来抑制毛发生长；相反，抑制miR-31的表达后，毛囊数量增加，毛球增多，毛囊外根鞘增生肥厚[32]。Peng等[33]研究还发现，在人或小鼠中miR-31通过负向调控缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1），继而激活Notch通路，促进表皮干细胞分化。
复制性细胞衰老是细胞分裂过程中不可避免地发生细胞损伤积累的结果，随着年龄增加，突变和损害几率也增加，细胞开始衰老，衰老时细胞周期停滞，细胞衰老可防止癌变，保护机体远离癌症。研究发现miR-137、miR-668[34]、miR-191[35]等与人角质形成细胞的复制性衰老有关，其通过转录后下调细胞周期调节基因SATB1、CDK6，阻止细胞从G1期进入S期，导致细胞周期停滞，增殖停止，诱导角质形成细胞进入衰老程 序。
4 miRNA与皮肤创面愈合
创面愈合涉及3个相互重叠的阶段[36]：炎性阶段，主要表现为血管扩张，毛细血管通透性增加，体液外渗及炎性细胞浸润；增殖阶段，主要表现为上皮化、血管形成及肉芽组织形成；重塑阶段，主要表现为胶原沉积。皮肤创面愈合的不同阶段中miRNA的表达各不相同，miRNA的异常表达在创面畸形愈合中起着关键作用[37]。
4.1 炎性阶段miRNA的作用
创面炎性反应始于中性粒细胞及其他白细胞通过受损血管被动渗漏入创面，接着创面的免疫细胞释放趋化因子、细胞因子及生长因子如巨噬细胞趋化蛋白、PDGF、血小板因子Ⅳ、IL-1β、TGF-β、TNF-α、Toll样受体（toll-like receptors，TLRs），继而吸引中性粒细胞和单核细胞聚集，聚集的中性粒细胞具有清洁作用，并杀死入侵的微生物；渗出的单核细胞成熟为巨噬细胞，发挥吞噬、促炎或抗炎和促血管生成等作用。
研究发现创面释放的炎性介质能诱导特异的miRNA表达，继而miRNA又能沉默大量促炎因子，即体内存在一个调节环。miR-146[38]、miR-155[38]、miR-21[39]及miR-125b[40]参与了创面炎症及免疫应答，这些miRNAs能被促炎因子，如IL-1β、TNF-α和TLRs等诱导表达。miR-146家族包括两个成员：miR-146a和miR-146b，启动子分析研究提示miR-146a为NF-κB依赖的基因，暴露于炎症环境下，促炎因子如TNF-α或IL-1β、或TLR-2、4、5能显著诱导其表达。IRAK1和TRAF6为其靶基因，miR-146a与靶基因结合通过负反馈循环机制调控TLR信号，抑制IL-8及正常T细胞表达和分泌的活性调节蛋白RANTES的释放。除了TRAF6和IRAK1，IRAK2为miR-146a的另一个靶基因，能调节干扰素的产生。miR-155同样能被许多炎性介质诱导表达，如TNF-α、聚肌苷酸-聚胞苷酸和IFN-β，通过作用于c/ebp靶基因促进IL-10发挥抗炎作用。miR-21亦是一种常见的受炎症诱导的miRNA，能转录后抑制多个靶基因。与炎症有关的靶基因是促炎因子程序性细胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4），miR-21通过抑制PDCD4使IL-10产生增加，从而抑制了脂多糖的促炎作用。炎症期间TLR-4亦能诱导miR-125b的表达，同时miR-125b能直接结合至TNF-α的3'非翻译区继而靶向沉默TNF-α的表 达。
4.2 增殖阶段miRNA的作用
增殖阶段重要特征之一是血管形成。内皮细胞增殖迁移和毛细血管形成是血管形成的早期表现，毛细血管进入创面床是支持组织再生的关键，若抑制创面血管生成，会严重影响创面愈合[41]。研究发现敲除Dicer、Drosha后抑制了内皮细胞毛细血管发芽、迁移和血管生成，提示miRNA参与血管生成[42]。Dicer对鼠胚胎血管生成也是必需的[43]，耗竭内皮细胞的miRNA将抑制出生后各种刺激诱导血管生成的反应，如外源性VEGF、肿瘤、肢体缺血和创面。已发现的促血管生成的miRNA有miR-17-92[44]、miR-126[45]、miR-130a[46]、miR-210[47-48]、miR-296[49]、miR-378[50]等。研究发现，miR-17-92在创面增殖阶段往往表达增加，其靶基因血小板反应蛋白1（thrombospondin 1，TSP-1）及结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）为抗血管生成因子，miR-17-92通过抑制TSP-1及CTGF，发挥促血管生成作用。有报道[45]miR-126能促进血管内皮细胞对VEGF的反应性，在对斑马鱼的研究中发现，敲除miR-126后导致胚胎发育过程中血管完整性丧失，出血增加。其靶基因Spred1及PIK3R2能抑制VEGF的表达，miR-126通过抑制Spred1及PIK3R2 实现调节血管完整性和血管生成的作用。已发现GAX、HOXA5基因有抑制血管内皮细胞的血管生成作用，而miR-130a通过抑制GAX、HOXA5基因表达，从而促进血管内皮细胞发挥血管生成作用。另有研究发现[47-48]当血管内皮细胞暴露于缺氧环境下，miR-210的表达逐渐增加，其通过抑制靶基因EFNA3促进基底膜毛细管样结构的形成及内皮细胞迁移；相反，拮抗miR-210则抑制血管内皮细胞生长及诱导细胞凋亡。炎症环境下生长因子能诱导miR-296显著升高，其通过抑制靶基因HGS降低了生长因子受体VEGFR-2和PDGFR-β的降解，最终血管生成增加。另外miR-378通过抑制靶基因Fus-1、Sufu的表达促进血管生成。抑制血管生成的miRNA有miR-92a[51-52]、miR-17[53]、miR-15b、miR-16、miR-20a[54]、miR-221、miR-222[55]、miR-320[56]等。miR-92a主要表达于人内皮细胞，在心肌梗死小鼠模型中，内皮细胞过表达miR-92a，通过抑制整合素α5的表达能阻断血管发生；相反，抑制miR-92a能促进血管生长和损伤组织的功能恢复。有报道[53]创面局部缺血能上调miR-17，通过抑制靶基因Janus Kinase1，从而抑制血管内皮细胞芽的形成，最终血管数量减少。同样，缺氧条件下，miR-15b、miR-16、miR-20a表达上调，能直接抑制VEGF的表达，从而减少血管生成。研究报道[56]miR-320表达于微血管内皮细胞，通过抑制促血管生成作用的IGF-1表达，影响血管内皮细胞的增殖与迁移，血管生成减少。miR-221、miR-222亦表达于血管内皮细胞，通过抑制血管生成因子c-kit的表达来控制内皮细胞形成新的毛细血管。
增殖阶段另一个重要特征是表皮细胞再生，表现为创面边缘角质形成细胞的迁移和增殖[57]。沉默SHIP2和增强AKT信号能加速角质形成细胞迁移，miR-205通过抑制SHIP2的转录促进角质形成细胞迁移，并拮抗角质形成细胞凋亡，有利于上皮的稳定及创面愈合；拮抗miR-205后，可使创面的丝状肌动蛋白减少，细胞黏附力增加，焦点接触增强，从而创面愈合延迟[58]。而miR-205在体内受miR-184的制约，miR-184能拮抗miR-205的抗SHIP2能力，从而使角质形成细胞凋亡、死亡增加[59]。miR-210也通过调控角质形成细胞的增殖影响创面闭合，Biswas等[60]研究发现miR-210在体内缺血性创面中表达上调，miR-210属于对缺氧敏感的miRNA，而大多数慢性创面属缺血缺氧性创面，在HIF-1α的刺激下miR-210表达增加，抑制靶基因细胞周期调节蛋白E2F3的转录[61]，阻碍细胞从G1期进入S期，DNA合成率及细胞增殖率明显下降，创面愈合延迟。miR-21也参与了创面愈合[62]，创面愈合过程中TGF-β1上调miR-21的表达，其通过抑制靶基因TIMP3、TIAM1从而促进角质形成细胞的迁移及创面的再上皮化。
4.3 重塑阶段miRNA的作用
胶原沉积是重塑阶段的一个主要特征。在纤维增生性瘢痕疙瘩形成中，miRNA发挥了重要作用。哺乳动物妊娠早期阶段胎儿皮肤无痕愈合[63]，而在后期转成瘢痕愈合表型[64]，一些miRNA在两阶段之间的表达存在明显差异，尤其是miR-29b、miR-29c和miR-192在妊娠后期显著升高，提示参与了瘢痕愈合[65]。miR-29b和miR-29c抑制多种参与无痕愈合信号通路有关的蛋白质，包括细胞外基质蛋白、抗肝纤维化TGF-β、Smad蛋白及β-catenin蛋白[66]。miR-192通过靶向抑制Smad相互作用蛋白1以增强胶原蛋白12的表达[67]。miR-29a能在转录后直接抑制胶原蛋白的表达，而在正常皮肤成纤维细胞，miR-29a受控于TGF-β、PDGF-B和IL-4[68]。Kashiyama等[69]比较了瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常成纤维细胞的miRNA表达谱，发现20个下调和7个上调的miRNA，特别是miR-196a下调最明显，miR-196a的表达量与Ⅰ、Ⅲ型胶原水平成负相关[68]。另有研究发现miR-483-3p在创面愈合的终末阶段表达上调，通过抑制靶基因MK2、MK167、YAP1的表达，抑制角质形成细胞的增殖与迁移，最终使创面再上皮化过程终止[70]。
5 展望
miRNA 在维持皮肤正常结构功能及创面再生修复过程中发挥重要作用。进一步探讨其在创面再生修复不同阶段与正常皮肤之间的差异表达，将有助于识别和发现特异性miRNAs，明确它们在皮肤创面愈合中的作用及其调控机制，并为治疗提供靶点。鉴于部分miRNA在创面修复中的重要作用，以miRNA为靶标的基因治疗可为临床难愈性创面修复提供新方法。但值得注意的是，已发现同一个miRNA在不同细胞类型中常表现不同甚至截然相反的功能，因此对于miRNA在创面再生修复各个阶段中的表达与调控作用及其多效性可能带来的副作用等，均有待深入研究。