引用本文： 高天喜, 常会敏, 范敏杰, 卢晓云, 王正辉, 张向红, 井晓红, 史艳霞, 李智慧. 聚羟基脂肪酸酯的生物修饰及其生物相容性研究. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(8): 1023-1029. doi: 10.7507/1002-1892.20140224 复制
聚羟基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates，PHAs）是一类存在于微生物细胞中的天然生物材料，由微生物在不平衡条件下发酵产生。它是一种强疏水材料，其表面疏水性会影响材料与细胞之间的生物相容性，因此学者们常采用紫外线、等离子、臭氧等表面修饰方法对其进行表面改性，但这些方法均会改变材料原有性能[1-4]。相对于PHAs家族的其他成员，聚羟基丁酸戊酸酯[poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate），PHBV]和聚羟基丁酸己酸酯[poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate），PHBHHx]具有更好的生物相容性、机械强度和降解速率可控[5-8]。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）肽属于细胞信号黏附肽，能有效提高细胞与生物材料间的黏附。有研究将RGD肽引入PHBV三维支架中，在不干扰原有生物素结合性能的情况下，提高了材料的细胞识别性和生物相容性[9]。还有研究将PHA表面颗粒结合蛋白（polyhydroxyalkanoates granule binding protein，PhaP）（两亲性蛋白）与RGD肽（PhaP-RGD）融合并修饰PHA，结果显示材料与成纤维细胞的生物相容性显著提高[10]。目前，关于PhaP-RGD融合蛋白修饰的PHBV和PHBHHx对人软骨细胞的影响罕见报道。为此，本实验通过制备PHBV和PHBHHx生物膜材料，并进行PhaP-RGD融合蛋白修饰，然后将人鼻中隔软骨细胞分别接种于修饰后的材料上进行体外培养，观察细胞生长情况，旨在明确经PhaP-RGD融合蛋白修饰能否提高PHBV和PHBHHx与软骨细胞之间的生物相容性。
1 材料与方法
1.1 实验材料及主要试剂、仪器
PHBV（宁波天安生物材料有限公司）；PHBHHx（清华大学陈国教授惠赠）； PhaP-RGD质粒由西安交通大学生命科学与技术学院构建；E.coli BL21 （DE3）菌株由西安交通大学生命科学与技术学院王一理教授惠赠。人鼻中隔软骨由西安交通大学医学院第二附属医院耳鼻咽喉-头颈外科行功能性鼻内镜术患者自愿捐赠。
FBS（Invitrogen公司，美国）；H-DMEM培养液（HyClone公司，美国）；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，ITPG）、镍柱纯化试剂盒（大连Takara公司）。接触角测量仪（承德鼎盛试验机检测设备有限公司）；酶标仪（Thermo Scientific公司，美国）；倒置相差显微镜（Nikon公司，日本）；扫描电镜（日本电子公司）。
1.2 人鼻中隔软骨细胞分离及培养
参照文献[11-13]方法分离培养人鼻中隔软骨细胞。取鼻中隔软骨，无菌生理盐水冲洗3次，剥除软骨表面筋膜，眼科剪剪成直径2 mm碎块置于培养皿，加入0.05%透明质酸酶5 mL，37℃于低速离心机以离心半径11 cm、200 r/min消化30 min；加入0.25%胰蛋白酶5 mL，37℃以离心半径11 cm、200 r/min消化30 min；加入0.2%胶原酶Ⅱ5 mL，37℃以离心半径11 cm、220 r/min消化2 h。消化停止后筛网过滤，以离心半径11 cm、1 500 r/min离心5 min；弃上清，以含10%FBS的H-DMEM培养基重悬细胞，置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养。48 h后更换培养液，以后每2天换液1次。倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。1 周后待细胞生长融合达90%，以0.5%胰蛋白酶消化，按1∶2比例传代。取第2代细胞进行后续实验。
1.3 生物膜材料制备
1.3.1 PhaP-RGD融合蛋白的表达纯化
通过重组大肠杆菌E.coli BL21（DE3）菌株表达PhaP-RGD融合蛋白，具体操作步骤：取含有重组基因PhaP-RGD质粒的E.coli BL21 （DE3）菌株100 μL接种至10 mL LB培养基（含5 mg/mL氨苄青霉素），在恒温摇床37℃培养12 h；加入100 μL 24 mg/mL ITPG继续培养5 h，诱导菌种表达融合蛋白。经SDS-PAGE验证融合蛋白成功表达后，采用镍柱纯化试剂盒纯化目标蛋白，并通过SDS-PAGE和Western blot进行验证。同时以不含质粒的E.coli BL21（DE3）菌株作为对照。
1.3.2 生物膜材料制备
利用溶剂挥发法制备PHBV和PHBHHx生物膜材料。称取5 g PHBV，溶解于100 mL氯仿中，盖上保鲜膜，60℃水浴加热1 h助溶；将充分溶解的溶液均匀铺至10个直径9 cm的玻璃培养板中；盖上保鲜膜防止灰尘落入，针头扎孔使其自然挥发，24～48 h后得到PHBV生物膜材料。同法制备PHBHHx生物膜材料。扫描电镜观察生物膜材料结构及孔径。
1.3.3 PhaP-RGD融合蛋白修饰
参照文献[10]方法，将PHBV和PHBHHx生物膜材料浸泡在3.5 mg/ mL PhaP-RGD融合蛋白溶液中，4℃孵育过夜；PBS冲洗材料表面未结合的蛋白。
1.3.4 生物膜材料接触角测量
取修饰前、后两种生物膜材料，裁剪成8 mm × 8 mm大小；修饰后的生物膜材料测量前用纯水冲洗并用滤纸吸干材料表面水分。将材料用双面胶固定于接触角测量仪样品台，表面滴加10 μL纯水，选择适当区域测量接触角。接触角越小说明材料的亲水性越好。
1.4 生物相容性观测
1.4.1 实验分组及方法
取修饰前、后两种生物膜材料，裁剪成8 mm × 8 mm大小，75%乙醇浸泡过夜，紫外线照射正、反面各1 h，PBS冲洗。加入含10%FBS的H-DMEM培养基预培养过夜。吸弃上清及材料表面培养基，取生长状态良好的第2代人鼻中隔软骨细胞，以2 ×107个/cm2细胞密度均匀滴加于修饰前、后的PHBV和PHBHHx生物膜材料表面（分别为A1、A2以及B1、B2组），加入含10%FBS的H-DMEM培养基，置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养。另取软骨细胞以2 ×107 个/cm2细胞密度接种于48孔板，作为对照（C组）。
1.4.2 检测指标
① 荧光显微镜观察细胞增殖情况：各组细胞培养3 d，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次；DAPI染色5 min，PBS漂洗3次；载玻片上滴加2 μL甘油，使生物膜材料固定于载玻片上；荧光显微镜下观察软骨细胞增殖情况。
② MTT检测细胞增殖：各组细胞培养后3、7 d，C组每孔加入200 μL MTT溶液（0.5 mg/mL），继续培养2～4 h；弃培养基，每孔加入200 μL DMSO置摇床上震荡10 min，酶标仪测定492 nm波长处吸光度（A）值。A1、A2、B1、B2组每孔加入200 μL MTT溶液（0.5 mg/ mL），继续培养2～4 h；弃培养基；将48孔板中的生物膜材料迅速移至新的48孔板内，长有细胞的一面朝上；A值测量方法同C组。
③ 甲苯胺蓝染色观察：A1、A2、B1、B2组培养7 d 后，取生物膜材料PBS洗2次，4%多聚甲醛固定1 h（4℃）；自来水洗5 min，蒸馏水洗5 min；加1%甲苯胺蓝浸染2 h；除去多余染液，光镜下观察生物膜材料表面着色情况。以单纯修饰后的PHBV和PHBHHx生物膜材料作为对照。
④ 扫描电镜观察：A1、A2、B1、B2组培养7 d后，取生物膜材料置于2.5%戊二醛固定液，4℃前固定2 h，0.1 mol/L PBS浸洗10 min，1%四氧化锇固定液4℃固定2 h，0.1 mol/L PBS浸洗10 min，梯度乙醇脱水，乙酸异戊酯处理10 min，临界点干燥，喷金，扫描电镜下观察超微结构。
1.5 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，两种材料接触角及各组组内两时间点间A值比较采用t检验；组间A值比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 人鼻中隔软骨细胞形态学观察
倒置相差显微镜观察示，原代软骨细胞呈圆形，折光性较强（图 1 a）；2 d后完全贴壁（图 1 b）；3 d后细胞开始出现伸展，由梭形逐渐变为规则三角形或多角形，细胞质中有圆形致密颗粒（图 1 c）；第2代软骨细胞呈多角形（图 1 d）。
图1
人鼻中隔软骨细胞形态学观察（倒置相差显微镜× 4） ⓐ 原代细胞培养2 h ⓑ 原代细胞培养2 d ⓒ 原代细胞培养7 d ⓓ 第2代细胞 2.2 PhaP-RGD融合蛋白的诱导表达与纯化鉴定
SDS-PAGE和Western blot检测示，经IPTG诱导表达后，含重组基因PhaP-RGD质粒的E.coli BL21 （DE3）菌株的总蛋白中，在相对分子质量为10 ×103～15 ×103之间有大量蛋白条带表达，与预测蛋白大小（14 ×103）相符，表明成功表达目标蛋白PhaP-RGD（图 2）。在验证目标蛋白正确的基础上，利用镍柱纯化目标蛋白，经SDS-PAGE和Western blot验证提示，纯化后得到条带均一的目标融合蛋白溶液（图 3）。
2.3 生物膜材料观察
2.3.1 扫描电镜观察
溶剂挥发法制备的PHBV和PHBHHx生物膜材料表面粗糙；PHBV结构致密，孔径较小；PHBHHx结构疏松，孔径较大。见图 4。
2.3.2 接触角测量
未经修饰的PHBV、PHBHHx生物膜材料接触角分别为（102.03 ± 0.46）、（98.76 ± 0.55）°；修饰后接触角分别为（6.91 ± 0.30）、（10.70 ± 0.39）°，较修饰前显著减小，差异均有统计学意义（t=390.877，P=0.000；t=953.277，P=0.000）。
2.4 生物相容性观察
2.4.1 软骨细胞增殖情况
培养3 d，DAPI染色示，与C、A1、A2组相比，B1、B2组细胞数较多，其中B2组最显著；C、A1、A2组软骨细胞数相似。见图 5。
图5
培养3 d荧光显微镜观察各组细胞增殖情况（DAPI ×10） ⓐ A1组 ⓑ A2组 ⓒ B1组 ⓓ B2组 ⓔ C组 MTT法检测示，组内比较：各组7 d A值均较3 d显著提高（P＜ 0.05）；组间比较：3 d时，B2组A值明显高于其他组，比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）；7 d时，B1、B2组高于A1、A2、C组，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）；B2组高于B1组，A1组高于A2组，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见表 1。
表1
培养3、7 d各组A值比较（n=3，2.4.2 甲苯胺蓝染色
培养7 d，镜下见单纯PHBV和PHBHHx生物膜材料均未见蓝色异染； A1、A2、B1、B2组材料表面均可见蓝色异染，其中A1、A2组蓝色异染程度相似，B2组较B1组深（图 6）。
2.4.3 扫描电镜观察
培养7 d扫描电镜观察示，各组材料上的细胞均呈软骨细胞正常形态，细胞之间形成连接，开始融合，部分细胞向膜表面的孔隙内生长，甚至跨越孔隙（图 7）。
3 讨论
PHAs家族因与多种细胞有较好的生物相容性和生物可降解性，已作为支架材料广泛应用于组织工程研究。溶剂挥发法制备膜基质材料是一种常用的高分子材料制备方法[14]，本研究采用该方法成功制备PHBV和PHBHHx生物膜材料，扫描电镜观察示材料表面粗糙，呈多孔结构，有利于细胞生长。但由于PHBV和PHBHHx的聚酯材料特性，其表面仍存在较强疏水性，不利于细胞贴附[15]。根据既往研究[9-10]结果，我们选择PhaP-RGD融合蛋白修饰PHBV和PHBHHx，接触角测量结果显示，修饰后两种材料表面亲水性均较修饰前显著提高，进一步提示采用PhaP-RGD融合蛋白生物修饰是提高PHAs材料表面亲水性的有效方法。
软骨细胞联合生物支架材料移植治疗耳鼻咽喉部软骨缺损，已成为软骨缺损修复领域新的研究热点。理想的组织工程支架材料必须与其负载的软骨细胞有良好相容性，既无细胞毒性，也不影响细胞功能。学者们尝试采用PHAs家族中多个成员，包括PHB、PHBV、PHBHHx，作为组织工程骨、软骨的支架材料[16-19]，其中PHBHHx显示出与软骨细胞良好相容性。You等[20]将PHBHHx作为支架材料与BMSCs共培养，结果显示该材料具有低细胞毒性，并能够诱导BMSCs向软骨细胞分化。本研究结果显示，PHBHHx生物膜材料经PhaP-RGD融合蛋白修饰后，可促进软骨细胞的贴附生长，且随培养时间延长，材料表面的软骨细胞活力及细胞增殖能力也有所提高。而经PhaP-RGD融合蛋白修饰后的PHBV生物膜材料，其与软骨细胞的生物相容性无显著提高，分析原因可能是细胞接种过程中因材料表面不平整造成了细胞流失。但也有研究表明生物膜材料表面的亲水性与其细胞生物相容性并不成正相关，只有材料表面疏水、亲水达到平衡时，材料与细胞间的相容性才达最佳[21]。
Ⅱ型胶原和糖胺多糖是正常软骨细胞合成分泌的两大特征性细胞外基质[22-24]。本研究采用甲苯胺蓝染色观察糖胺多糖分泌情况，结果显示各实验组材料表面均可见不同程度异染；PhaP-RGD融合蛋白修饰前后PHBV材料表面异染程度差别不明显，但修饰后的PHBHHx生物膜材料蓝染较修饰前深。提示经PhaP-RGD融合蛋白修饰的PHBHHx生物膜材料能更好促进软骨细胞分泌细胞外基质。但本研究仅进行了糖胺多糖分泌观察，下一步将采用免疫组织化学染色方法定量检测 Ⅱ型胶原分泌情况，并分析细胞在支架上软骨特征性表型维持情况，为后续动物体内植入实验奠定理论基础。
综上述，经PhaP-RGD融合蛋白修饰后，PHBHHx生物膜材料表面亲水性增强，并提高了与软骨细胞的相容性，为下一步作为支架材料构建组织工程软骨奠定了实验基础。
聚羟基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates，PHAs）是一类存在于微生物细胞中的天然生物材料，由微生物在不平衡条件下发酵产生。它是一种强疏水材料，其表面疏水性会影响材料与细胞之间的生物相容性，因此学者们常采用紫外线、等离子、臭氧等表面修饰方法对其进行表面改性，但这些方法均会改变材料原有性能[1-4]。相对于PHAs家族的其他成员，聚羟基丁酸戊酸酯[poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate），PHBV]和聚羟基丁酸己酸酯[poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate），PHBHHx]具有更好的生物相容性、机械强度和降解速率可控[5-8]。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）肽属于细胞信号黏附肽，能有效提高细胞与生物材料间的黏附。有研究将RGD肽引入PHBV三维支架中，在不干扰原有生物素结合性能的情况下，提高了材料的细胞识别性和生物相容性[9]。还有研究将PHA表面颗粒结合蛋白（polyhydroxyalkanoates granule binding protein，PhaP）（两亲性蛋白）与RGD肽（PhaP-RGD）融合并修饰PHA，结果显示材料与成纤维细胞的生物相容性显著提高[10]。目前，关于PhaP-RGD融合蛋白修饰的PHBV和PHBHHx对人软骨细胞的影响罕见报道。为此，本实验通过制备PHBV和PHBHHx生物膜材料，并进行PhaP-RGD融合蛋白修饰，然后将人鼻中隔软骨细胞分别接种于修饰后的材料上进行体外培养，观察细胞生长情况，旨在明确经PhaP-RGD融合蛋白修饰能否提高PHBV和PHBHHx与软骨细胞之间的生物相容性。
1 材料与方法
1.1 实验材料及主要试剂、仪器
PHBV（宁波天安生物材料有限公司）；PHBHHx（清华大学陈国教授惠赠）； PhaP-RGD质粒由西安交通大学生命科学与技术学院构建；E.coli BL21 （DE3）菌株由西安交通大学生命科学与技术学院王一理教授惠赠。人鼻中隔软骨由西安交通大学医学院第二附属医院耳鼻咽喉-头颈外科行功能性鼻内镜术患者自愿捐赠。
FBS（Invitrogen公司，美国）；H-DMEM培养液（HyClone公司，美国）；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，ITPG）、镍柱纯化试剂盒（大连Takara公司）。接触角测量仪（承德鼎盛试验机检测设备有限公司）；酶标仪（Thermo Scientific公司，美国）；倒置相差显微镜（Nikon公司，日本）；扫描电镜（日本电子公司）。
1.2 人鼻中隔软骨细胞分离及培养
参照文献[11-13]方法分离培养人鼻中隔软骨细胞。取鼻中隔软骨，无菌生理盐水冲洗3次，剥除软骨表面筋膜，眼科剪剪成直径2 mm碎块置于培养皿，加入0.05%透明质酸酶5 mL，37℃于低速离心机以离心半径11 cm、200 r/min消化30 min；加入0.25%胰蛋白酶5 mL，37℃以离心半径11 cm、200 r/min消化30 min；加入0.2%胶原酶Ⅱ5 mL，37℃以离心半径11 cm、220 r/min消化2 h。消化停止后筛网过滤，以离心半径11 cm、1 500 r/min离心5 min；弃上清，以含10%FBS的H-DMEM培养基重悬细胞，置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养。48 h后更换培养液，以后每2天换液1次。倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。1 周后待细胞生长融合达90%，以0.5%胰蛋白酶消化，按1∶2比例传代。取第2代细胞进行后续实验。
1.3 生物膜材料制备
1.3.1 PhaP-RGD融合蛋白的表达纯化
通过重组大肠杆菌E.coli BL21（DE3）菌株表达PhaP-RGD融合蛋白，具体操作步骤：取含有重组基因PhaP-RGD质粒的E.coli BL21 （DE3）菌株100 μL接种至10 mL LB培养基（含5 mg/mL氨苄青霉素），在恒温摇床37℃培养12 h；加入100 μL 24 mg/mL ITPG继续培养5 h，诱导菌种表达融合蛋白。经SDS-PAGE验证融合蛋白成功表达后，采用镍柱纯化试剂盒纯化目标蛋白，并通过SDS-PAGE和Western blot进行验证。同时以不含质粒的E.coli BL21（DE3）菌株作为对照。
1.3.2 生物膜材料制备
利用溶剂挥发法制备PHBV和PHBHHx生物膜材料。称取5 g PHBV，溶解于100 mL氯仿中，盖上保鲜膜，60℃水浴加热1 h助溶；将充分溶解的溶液均匀铺至10个直径9 cm的玻璃培养板中；盖上保鲜膜防止灰尘落入，针头扎孔使其自然挥发，24～48 h后得到PHBV生物膜材料。同法制备PHBHHx生物膜材料。扫描电镜观察生物膜材料结构及孔径。
1.3.3 PhaP-RGD融合蛋白修饰
参照文献[10]方法，将PHBV和PHBHHx生物膜材料浸泡在3.5 mg/ mL PhaP-RGD融合蛋白溶液中，4℃孵育过夜；PBS冲洗材料表面未结合的蛋白。
1.3.4 生物膜材料接触角测量
取修饰前、后两种生物膜材料，裁剪成8 mm × 8 mm大小；修饰后的生物膜材料测量前用纯水冲洗并用滤纸吸干材料表面水分。将材料用双面胶固定于接触角测量仪样品台，表面滴加10 μL纯水，选择适当区域测量接触角。接触角越小说明材料的亲水性越好。
1.4 生物相容性观测
1.4.1 实验分组及方法
取修饰前、后两种生物膜材料，裁剪成8 mm × 8 mm大小，75%乙醇浸泡过夜，紫外线照射正、反面各1 h，PBS冲洗。加入含10%FBS的H-DMEM培养基预培养过夜。吸弃上清及材料表面培养基，取生长状态良好的第2代人鼻中隔软骨细胞，以2 ×107个/cm2细胞密度均匀滴加于修饰前、后的PHBV和PHBHHx生物膜材料表面（分别为A1、A2以及B1、B2组），加入含10%FBS的H-DMEM培养基，置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养。另取软骨细胞以2 ×107 个/cm2细胞密度接种于48孔板，作为对照（C组）。
1.4.2 检测指标
① 荧光显微镜观察细胞增殖情况：各组细胞培养3 d，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次；DAPI染色5 min，PBS漂洗3次；载玻片上滴加2 μL甘油，使生物膜材料固定于载玻片上；荧光显微镜下观察软骨细胞增殖情况。
② MTT检测细胞增殖：各组细胞培养后3、7 d，C组每孔加入200 μL MTT溶液（0.5 mg/mL），继续培养2～4 h；弃培养基，每孔加入200 μL DMSO置摇床上震荡10 min，酶标仪测定492 nm波长处吸光度（A）值。A1、A2、B1、B2组每孔加入200 μL MTT溶液（0.5 mg/ mL），继续培养2～4 h；弃培养基；将48孔板中的生物膜材料迅速移至新的48孔板内，长有细胞的一面朝上；A值测量方法同C组。
③ 甲苯胺蓝染色观察：A1、A2、B1、B2组培养7 d 后，取生物膜材料PBS洗2次，4%多聚甲醛固定1 h（4℃）；自来水洗5 min，蒸馏水洗5 min；加1%甲苯胺蓝浸染2 h；除去多余染液，光镜下观察生物膜材料表面着色情况。以单纯修饰后的PHBV和PHBHHx生物膜材料作为对照。
④ 扫描电镜观察：A1、A2、B1、B2组培养7 d后，取生物膜材料置于2.5%戊二醛固定液，4℃前固定2 h，0.1 mol/L PBS浸洗10 min，1%四氧化锇固定液4℃固定2 h，0.1 mol/L PBS浸洗10 min，梯度乙醇脱水，乙酸异戊酯处理10 min，临界点干燥，喷金，扫描电镜下观察超微结构。
1.5 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，两种材料接触角及各组组内两时间点间A值比较采用t检验；组间A值比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 人鼻中隔软骨细胞形态学观察
倒置相差显微镜观察示，原代软骨细胞呈圆形，折光性较强（图 1 a）；2 d后完全贴壁（图 1 b）；3 d后细胞开始出现伸展，由梭形逐渐变为规则三角形或多角形，细胞质中有圆形致密颗粒（图 1 c）；第2代软骨细胞呈多角形（图 1 d）。
图1
人鼻中隔软骨细胞形态学观察（倒置相差显微镜× 4） ⓐ 原代细胞培养2 h ⓑ 原代细胞培养2 d ⓒ 原代细胞培养7 d ⓓ 第2代细胞 2.2 PhaP-RGD融合蛋白的诱导表达与纯化鉴定
SDS-PAGE和Western blot检测示，经IPTG诱导表达后，含重组基因PhaP-RGD质粒的E.coli BL21 （DE3）菌株的总蛋白中，在相对分子质量为10 ×103～15 ×103之间有大量蛋白条带表达，与预测蛋白大小（14 ×103）相符，表明成功表达目标蛋白PhaP-RGD（图 2）。在验证目标蛋白正确的基础上，利用镍柱纯化目标蛋白，经SDS-PAGE和Western blot验证提示，纯化后得到条带均一的目标融合蛋白溶液（图 3）。
2.3 生物膜材料观察
2.3.1 扫描电镜观察
溶剂挥发法制备的PHBV和PHBHHx生物膜材料表面粗糙；PHBV结构致密，孔径较小；PHBHHx结构疏松，孔径较大。见图 4。
2.3.2 接触角测量
未经修饰的PHBV、PHBHHx生物膜材料接触角分别为（102.03 ± 0.46）、（98.76 ± 0.55）°；修饰后接触角分别为（6.91 ± 0.30）、（10.70 ± 0.39）°，较修饰前显著减小，差异均有统计学意义（t=390.877，P=0.000；t=953.277，P=0.000）。
2.4 生物相容性观察
2.4.1 软骨细胞增殖情况
培养3 d，DAPI染色示，与C、A1、A2组相比，B1、B2组细胞数较多，其中B2组最显著；C、A1、A2组软骨细胞数相似。见图 5。
图5
培养3 d荧光显微镜观察各组细胞增殖情况（DAPI ×10） ⓐ A1组 ⓑ A2组 ⓒ B1组 ⓓ B2组 ⓔ C组 MTT法检测示，组内比较：各组7 d A值均较3 d显著提高（P＜ 0.05）；组间比较：3 d时，B2组A值明显高于其他组，比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）；7 d时，B1、B2组高于A1、A2、C组，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）；B2组高于B1组，A1组高于A2组，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见表 1。
表1
培养3、7 d各组A值比较（n=3，2.4.2 甲苯胺蓝染色
培养7 d，镜下见单纯PHBV和PHBHHx生物膜材料均未见蓝色异染； A1、A2、B1、B2组材料表面均可见蓝色异染，其中A1、A2组蓝色异染程度相似，B2组较B1组深（图 6）。
2.4.3 扫描电镜观察
培养7 d扫描电镜观察示，各组材料上的细胞均呈软骨细胞正常形态，细胞之间形成连接，开始融合，部分细胞向膜表面的孔隙内生长，甚至跨越孔隙（图 7）。
3 讨论
PHAs家族因与多种细胞有较好的生物相容性和生物可降解性，已作为支架材料广泛应用于组织工程研究。溶剂挥发法制备膜基质材料是一种常用的高分子材料制备方法[14]，本研究采用该方法成功制备PHBV和PHBHHx生物膜材料，扫描电镜观察示材料表面粗糙，呈多孔结构，有利于细胞生长。但由于PHBV和PHBHHx的聚酯材料特性，其表面仍存在较强疏水性，不利于细胞贴附[15]。根据既往研究[9-10]结果，我们选择PhaP-RGD融合蛋白修饰PHBV和PHBHHx，接触角测量结果显示，修饰后两种材料表面亲水性均较修饰前显著提高，进一步提示采用PhaP-RGD融合蛋白生物修饰是提高PHAs材料表面亲水性的有效方法。
软骨细胞联合生物支架材料移植治疗耳鼻咽喉部软骨缺损，已成为软骨缺损修复领域新的研究热点。理想的组织工程支架材料必须与其负载的软骨细胞有良好相容性，既无细胞毒性，也不影响细胞功能。学者们尝试采用PHAs家族中多个成员，包括PHB、PHBV、PHBHHx，作为组织工程骨、软骨的支架材料[16-19]，其中PHBHHx显示出与软骨细胞良好相容性。You等[20]将PHBHHx作为支架材料与BMSCs共培养，结果显示该材料具有低细胞毒性，并能够诱导BMSCs向软骨细胞分化。本研究结果显示，PHBHHx生物膜材料经PhaP-RGD融合蛋白修饰后，可促进软骨细胞的贴附生长，且随培养时间延长，材料表面的软骨细胞活力及细胞增殖能力也有所提高。而经PhaP-RGD融合蛋白修饰后的PHBV生物膜材料，其与软骨细胞的生物相容性无显著提高，分析原因可能是细胞接种过程中因材料表面不平整造成了细胞流失。但也有研究表明生物膜材料表面的亲水性与其细胞生物相容性并不成正相关，只有材料表面疏水、亲水达到平衡时，材料与细胞间的相容性才达最佳[21]。
Ⅱ型胶原和糖胺多糖是正常软骨细胞合成分泌的两大特征性细胞外基质[22-24]。本研究采用甲苯胺蓝染色观察糖胺多糖分泌情况，结果显示各实验组材料表面均可见不同程度异染；PhaP-RGD融合蛋白修饰前后PHBV材料表面异染程度差别不明显，但修饰后的PHBHHx生物膜材料蓝染较修饰前深。提示经PhaP-RGD融合蛋白修饰的PHBHHx生物膜材料能更好促进软骨细胞分泌细胞外基质。但本研究仅进行了糖胺多糖分泌观察，下一步将采用免疫组织化学染色方法定量检测 Ⅱ型胶原分泌情况，并分析细胞在支架上软骨特征性表型维持情况，为后续动物体内植入实验奠定理论基础。
综上述，经PhaP-RGD融合蛋白修饰后，PHBHHx生物膜材料表面亲水性增强，并提高了与软骨细胞的相容性，为下一步作为支架材料构建组织工程软骨奠定了实验基础。
