引用本文： 王永成, 孟昊业, 袁雪凌, 彭江, 郭全义, 卢世璧, 汪爱媛. 体外模拟压应力三维动态培养构建组织工程软骨的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(9): 1145-1149. doi: 10.7507/1002-1892.20140248 复制
关节软骨损伤后如未及时接受适当的治疗，可能导致永久性退行性病变[1]。为了防止软骨病变的发展，尤其对于年轻患者，在发病早期即进行软骨表面修复具有重要意义。近年来，组织工程学和细胞生物学的发展为关节软骨损伤的修复提供了新选择，应用组织工程技术修复软骨缺损已成为研究热点。然而大量实验及临床研究显示，其修复效果仍存在不足之处，主要表现为修复组织与天然软骨形态和成分不同[2]以及力学性能的差异[3-4]。因此，如何增强组织工程软骨的功能，提高软骨缺损修复效果，减少修复组织退变，已成为软骨组织工程和再生医学领域的焦点问题。目前，生物反应器已应用于软骨组织工程的研究，其不仅能提供组织培养的“微环境”，而且可以模拟关节软骨在体内复杂的生物力学状态，为组织工程软骨的三维构建提供良好条件[5-6]。在既往研究中[7-9]，我们对天然关节软骨进行脱细胞处理去除其抗原性，采用冷冻干燥法成功制备了以关节软骨细胞外基质（extracellular matrix，ECM）为原料的三维多孔支架，其具有合适的孔径和孔隙率及良好的生物相容性，可作为软骨组织工程理想的支架载体。本实验以软骨细胞作为种子细胞，接种于脱细胞关节软骨ECM源性三维多孔支架上，通过比较经生物反应器内周期性压应力刺激的动态培养与普通静态培养构建的组织工程软骨差异，探讨力学刺激促进组织工程软骨内部基质分泌和营养物质传递的效应，以及对其力学特性的影响，为体外组织工程软骨的三维构建提供优化方案。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、试剂、仪器
健康成年新西兰大白兔3只，雌雄不限，体重2.5～3.0 kg，由解放军总医院动物实验中心提供，实验方案经过解放军总医院动物实验管理委员会批准。
关节软骨ECM源性三维多孔支架由解放军总医院全军骨科研究所提供（图 1），孔径（155±35）μm，孔隙率89%～93%，直径6 mm，高8 mm，60Co辐照消毒后密封保存。H-DMEM/F12培养基、FBS、0.25%胰蛋白酶（GIBCO公司，美国）；L-脯氨酸、抗坏血酸、胰岛素、抑肽酶、Ⅱ型胶原酶、Hoechst 33258染色剂、二乙酸荧光素（fluorescein diacetate，FDA）、活-死细胞染色试剂盒（Sigma公司，美国）；非必需氨基酸（HyClone公司，美国）；羟脯氨酸试剂盒（南京建成生物工程研究所）。
图1
关节软骨ECM源性三维多孔支架外观 图 2第2代兔软骨细胞培养1周（倒置相差显微镜× 200） 图 3两组细胞-支架复合物培养3周激光共聚焦显微镜观察（× 20）ⓐ A组ⓑB组 图 4两组细胞-支架复合物培养3周扫描电镜观察（× 500）ⓐ A组ⓑ B组
Figure1.
Macroscopic view of three-dimensional porous articular cartilage ECM scaffolds Fig. 2 Microscopic view of passage 2 rabbits' chondrocytes after 1 week of culturing (Inverted phase contrast microscopy×200) Fig. 3 Laser scanning confocal microscopy observation of cell-scaffold constructs of 2 groups after 3 weeks of culturing (× 20) ⓐGroup A ⓑGroup B Fig. 4 Scanning electron microscopy observation of cell-scaffold constructs of 2 groups after 3 weeks of culturing (× 500) ⓐGroup A ⓑGroup B
IX70倒置相差显微镜、BX-51激光共聚焦显微镜、DP70图像采集系统（Olympus公司，日本）；BCPCAS4800扫描电镜（Hitachi公司，日本）；L/S® 07523-90蠕动泵（Masterflex公司，美国）；BioDynamicTM生物反应器、Electro Force® 3220力学试验机（Bose公司，美国）；DU-640紫外分光光度计（Beckman Coulter公司，美国）；M530游标卡尺（Mitutoyo公司，日本）。
1.2 软骨细胞分离及培养
取3只新西兰大白兔耳缘静脉注射空气栓塞处死，无菌条件下切取四肢关节表面软骨，用D-Hank液冲洗多次，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小颗粒，加入10倍体积的0.2%Ⅱ型胶原酶，37℃消化6 h，200目金属网过滤，以离心半径8 cm、1 700 r/min离心10 min，弃上清；D-Hank液洗涤细胞团，同上法离心，加入完全培养基（含10%FBS的H-DMEM培养基），制成细胞悬液，调整细胞密度为5×105个/mL，接种于50 cm2培养瓶中，于37℃、5%CO2及95%湿度培养箱中培养，隔天更换培养液，倒置相差显微镜下观察兔软骨细胞呈三角形或多角形，折光性好。原代细胞融合约90%时，以0.25%胰蛋白酶消化传代扩增，取第2代软骨细胞用于实验（图 2）。
1.3 细胞-支架复合物制备
取关节软骨ECM源性三维多孔支架，于完全培养基中浸泡2 h，取出后用消毒吸水纸将水分尽量吸干，置入6孔板中备用。收集第2代兔关节软骨细胞，以离心半径8 cm、1 500 r/min离心5 min，将细胞制成密度为2×107个/mL的细胞悬液，每个支架接种1 mL细胞悬液，待完全吸附湿润后放入37℃、5%CO2及95%湿度培养箱中，孵育2 h后取出放入培养瓶中，缓慢添加含10%FBS、50 μg/mL抗坏血酸、40 μg/mL脯氨酸、非必需氨基酸和500 U/mL抑肽酶的DMEM培养液，进行静态预培养5 d。
1.4 实验分组及培养方法
预培养5 d后将细胞-支架复合物随机分为2组，均采用软骨培养液（含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM/F12培养基）。A组继续静态培养3周，每周换液3次。B组采用模拟压应力三维动态培养：将细胞-支架复合物置于生物反应器培养仓内，按设定条件行力学加载培养。为模拟人日常活动状态，加压条件为[10-11]：15%压缩应变、频率1 Hz；每天加载2次，每次1 h，间隔8 h，连续加载3周。蠕动泵驱动培养液循环，流速为3 mL/min。整个加载过程在37℃、95%湿度环境中进行；力学加载装置在使用前对其零件均进行高温高压、60Co辐照等灭菌处理。培养3周后取出两组样本，进行以下检测。
1.5 检测指标
1.5.1 细胞活性检测
采用活-死细胞染色试剂盒检测细胞活性。两组样本弃培养基，经PBS清洗后，切取中央部分薄片（厚度1 mm），避光、20℃环境下，FDA（5×10-3 mg/mL）工作液反应5 min。弃去反应后液体，PBS清洗2次，激光共聚焦显微镜下观察细胞活性。
1.5.2 扫描电镜观察
两组样本PBS清洗后，2.5%戊二醛4℃恒温下固定24 h，取出PBS清洗20 min×2次，1%四氧化锇酸后固定2 h，PBS清洗，95%乙醇脱水过夜后，室温干燥48 h，上机喷金，扫描电镜观察细胞在支架上的形态和分布。
1.5.3 生化成分分析
①糖胺聚糖（glycosaminog-lycan，GAG）含量测定：采用二甲基亚甲蓝比色法，两组各取4个样本，冻干后称重，加入木瓜蛋白酶裂解液，65℃裂解48 h，以离心半径8 cm、1 500 r/min离心5 min。取裂解液100 µL加入3 mL二甲基亚甲蓝，于紫外分光光度计480 nm波长下检测吸光度（A）值，根据标准品浓度作标准曲线，计算GAG含量。②胶原蛋白含量测定：根据羟脯氨酸试剂盒说明，用紫外分光光度计测定样本中羟脯氨酸含量后，换算成胶原蛋白含量。吸取①中制备的两组木瓜蛋白酶裂解液0.5 mL，加试剂盒水解液1 mL水解20 min；调整pH值至6.0～6.8，加蒸馏水至10 mL，混匀；加适量活性炭，以离心半径8 cm、3 500 r/min离心10 min，取1 mL上清加入5 µg/mL标准液1 mL，混匀，60℃水浴15 min；冷却后以离心半径8 cm、3 500 r/min离心10 min，取上清加入石英杯内，于紫外分光光度计550 nm波长处比色，蒸馏水调零，测各管A值，计算胶原蛋白含量。③ DNA含量检测：以小牛胸腺DNA含量作为标准，两组各取4个样本，用荧光染料Hoechst 33258标记后，采用荧光测定法（激发波长355 nm，发射波长450 nm）分析DNA含量。
1.5.4 力学性能测试
两组各取4个样本，在湿润状态下采用非限制性静态压缩试验测试弹性模量。用游标卡尺测量并记录样本的初始直径和厚度，将其放置于金属压台，连接力学试验机，以0.05 mm/s位移速率进行压缩，实时记录测试样本的载荷，计算相应的应力和应变，根据应力-应变曲线初始线性区域斜率得到样本弹性模量。另取空白支架作为对照组。
1.6 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 细胞活性检测
激光共聚焦显微镜观察示，B组支架内绿色活细胞增殖旺盛，分布较均匀，排列紧密；A组细胞增殖较差，分布欠均匀，细胞多集中于支架边缘，而中心区域失染。见图 3。
2.2 扫描电镜观察
扫描电镜观察示，B组软骨细胞在支架表面及内部均匀分布，支架孔隙被细胞及分泌的ECM填满，细胞在支架上黏附、增殖、生长良好；而A组软骨细胞明显减少，且分布散乱，ECM分泌较少，未见融合成片。见图 4。
2.3 生化成分分析
B组胶原蛋白、GAG及DNA含量分别为（675.85±27.93）µg/mg、（621.72±26.75）µg/mg、（16.98±3.23）µg/样本，A组分别为（438.72±6.35）µg/mg、（301.63±30.51）µg/mg、（10.18±4.39）µg/样本。B组各含量均明显高于A组，比较差异均有统计学意义（t=18.512，P=0.000；t=17.640，P=0.000；t=2.790，P=0.024）。
2.4 力学性能测试
A、B组及对照组的弹性模量分别为（0.49±0.16）、（0.67±0.09）、（0.43±0.12）MPa，B组显著高于A组和对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；A组和对照组间差异无统计学意义（P > 0.05）。
3 讨论
虽然目前对力学刺激影响细胞发生反应的传导机制尚不明确，但既往研究表明机械刺激在体内、外均对软骨细胞的生长有重要调控作用[12]，对接种于载体的软骨细胞给予一定力学负荷时，可促进细胞的合成代谢过程，从而提高ECM的分泌[13]。模拟关节软骨细胞在体内的正常力学环境对体外构建组织工程软骨有非常重要作用。本研究结果表明，周期性的动态压缩应力刺激对兔关节软骨细胞在脱细胞软骨ECM源性三维多孔支架中的生长有明显促进作用，与静态培养相比，动态培养可维持细胞增殖，增加软骨ECM的合成，促进组织工程软骨组织的成熟。
三维支架系统如凝胶、海绵状或纤维网状等结构，可提供一种防止种子细胞去分化的环境[14]；然而三维立体培养虽可较好维持细胞表型，但静态培养时由于支架材料空间内部的营养物质传输障碍，细胞增殖受限，组织块中央出现细胞坏死的“空心”现象[15]，使组织工程构建受到了很大限制。本研究中静态培养组也出现同样结果，软骨细胞在支架内的分布是表面多、中央少，可能与三维多孔支架结构表面所形成的黏滞阻力有关；而动态培养组的细胞在支架中分布较均匀，并保持良好活力。分析原因可能为细胞-支架复合物在生物反应器内所受的不仅是压缩力，由于灌流状态下培养液的交换，还可能受到低水平的流体剪切力等影响。这些力抵消或改变了支架表面的黏滞阻力，形成了局部复杂的力学生物学“微环境”，从而促进营养供应，刺激软骨细胞在支架中的增殖和胶原、蛋白多糖等的合成。有研究发现，持续的循环载荷可增强软骨细胞在支架内胶原蛋白启动子的活性[16]；然而也有一些研究表明，机械负荷对软骨细胞胶原的表达并无影响甚至有所降低[17-18]。这些相互矛盾的结果可能是与使用不同支架、细胞和力学刺激方案有关。
“功能性组织工程学”是上世纪末美国生物力学委员会提出的概念，并在组织工程学的基础上逐渐发展起来，其重点强调了对组织工程组织的功能性进行评价。所有矫形外科组织工程的主要目的都是恢复其正常生物力学功能，构建功能性组织工程软骨的目标是培养具有一定力学特性的组织，这些特性包括允许组织内间质液压的形成、软骨的应力松弛及蠕变特性、润滑功能等[12, 19]。正常生理状态下，关节软骨承载不同机械负荷的能力依赖于其组织结构、生化成分和含水量。软骨细胞合成的ECM包括GAG、胶原以及其他蛋白质与非蛋白质分子，它们是维持健康的功能性软骨组织所必需条件。而且，生理性负荷通过包括压缩、剪切、拉伸应变、静水压力、间质液流动、流动电位及对流性分子运输等机械性电化学传导介质影响软骨细胞的新陈代谢活性和软骨的组成、结构和功能[20]。本研究采用缓和的周期性压力刺激软骨细胞，频率1 Hz相当于人行走时的膝关节受力频率，结果显示动态培养的细胞-支架复合物弹性模量显著高于静态培养及空白支架，表现出了良好的抗压力学性能。
综上述，体外模拟压应力的三维动态培养可促进组织工程复合体的营养供应，并通过一定机械力学刺激增强其生化和生物力学特性。然而，本研究也存在一些局限性，未考虑种子细胞来源的物种、年龄，初始接种密度，不同弹性模量材料来源的支架，各种生长因子的添加及不同力学加载方案对细胞-支架复合物的综合影响。下一步需探索最适合的组合方案，并结合动物体内实验证明其转化应用于临床的可行性。
关节软骨损伤后如未及时接受适当的治疗，可能导致永久性退行性病变[1]。为了防止软骨病变的发展，尤其对于年轻患者，在发病早期即进行软骨表面修复具有重要意义。近年来，组织工程学和细胞生物学的发展为关节软骨损伤的修复提供了新选择，应用组织工程技术修复软骨缺损已成为研究热点。然而大量实验及临床研究显示，其修复效果仍存在不足之处，主要表现为修复组织与天然软骨形态和成分不同[2]以及力学性能的差异[3-4]。因此，如何增强组织工程软骨的功能，提高软骨缺损修复效果，减少修复组织退变，已成为软骨组织工程和再生医学领域的焦点问题。目前，生物反应器已应用于软骨组织工程的研究，其不仅能提供组织培养的“微环境”，而且可以模拟关节软骨在体内复杂的生物力学状态，为组织工程软骨的三维构建提供良好条件[5-6]。在既往研究中[7-9]，我们对天然关节软骨进行脱细胞处理去除其抗原性，采用冷冻干燥法成功制备了以关节软骨细胞外基质（extracellular matrix，ECM）为原料的三维多孔支架，其具有合适的孔径和孔隙率及良好的生物相容性，可作为软骨组织工程理想的支架载体。本实验以软骨细胞作为种子细胞，接种于脱细胞关节软骨ECM源性三维多孔支架上，通过比较经生物反应器内周期性压应力刺激的动态培养与普通静态培养构建的组织工程软骨差异，探讨力学刺激促进组织工程软骨内部基质分泌和营养物质传递的效应，以及对其力学特性的影响，为体外组织工程软骨的三维构建提供优化方案。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、试剂、仪器
健康成年新西兰大白兔3只，雌雄不限，体重2.5～3.0 kg，由解放军总医院动物实验中心提供，实验方案经过解放军总医院动物实验管理委员会批准。
关节软骨ECM源性三维多孔支架由解放军总医院全军骨科研究所提供（图 1），孔径（155±35）μm，孔隙率89%～93%，直径6 mm，高8 mm，60Co辐照消毒后密封保存。H-DMEM/F12培养基、FBS、0.25%胰蛋白酶（GIBCO公司，美国）；L-脯氨酸、抗坏血酸、胰岛素、抑肽酶、Ⅱ型胶原酶、Hoechst 33258染色剂、二乙酸荧光素（fluorescein diacetate，FDA）、活-死细胞染色试剂盒（Sigma公司，美国）；非必需氨基酸（HyClone公司，美国）；羟脯氨酸试剂盒（南京建成生物工程研究所）。
图1
关节软骨ECM源性三维多孔支架外观 图 2第2代兔软骨细胞培养1周（倒置相差显微镜× 200） 图 3两组细胞-支架复合物培养3周激光共聚焦显微镜观察（× 20）ⓐ A组ⓑB组 图 4两组细胞-支架复合物培养3周扫描电镜观察（× 500）ⓐ A组ⓑ B组
Figure1.
Macroscopic view of three-dimensional porous articular cartilage ECM scaffolds Fig. 2 Microscopic view of passage 2 rabbits' chondrocytes after 1 week of culturing (Inverted phase contrast microscopy×200) Fig. 3 Laser scanning confocal microscopy observation of cell-scaffold constructs of 2 groups after 3 weeks of culturing (× 20) ⓐGroup A ⓑGroup B Fig. 4 Scanning electron microscopy observation of cell-scaffold constructs of 2 groups after 3 weeks of culturing (× 500) ⓐGroup A ⓑGroup B
IX70倒置相差显微镜、BX-51激光共聚焦显微镜、DP70图像采集系统（Olympus公司，日本）；BCPCAS4800扫描电镜（Hitachi公司，日本）；L/S® 07523-90蠕动泵（Masterflex公司，美国）；BioDynamicTM生物反应器、Electro Force® 3220力学试验机（Bose公司，美国）；DU-640紫外分光光度计（Beckman Coulter公司，美国）；M530游标卡尺（Mitutoyo公司，日本）。
1.2 软骨细胞分离及培养
取3只新西兰大白兔耳缘静脉注射空气栓塞处死，无菌条件下切取四肢关节表面软骨，用D-Hank液冲洗多次，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小颗粒，加入10倍体积的0.2%Ⅱ型胶原酶，37℃消化6 h，200目金属网过滤，以离心半径8 cm、1 700 r/min离心10 min，弃上清；D-Hank液洗涤细胞团，同上法离心，加入完全培养基（含10%FBS的H-DMEM培养基），制成细胞悬液，调整细胞密度为5×105个/mL，接种于50 cm2培养瓶中，于37℃、5%CO2及95%湿度培养箱中培养，隔天更换培养液，倒置相差显微镜下观察兔软骨细胞呈三角形或多角形，折光性好。原代细胞融合约90%时，以0.25%胰蛋白酶消化传代扩增，取第2代软骨细胞用于实验（图 2）。
1.3 细胞-支架复合物制备
取关节软骨ECM源性三维多孔支架，于完全培养基中浸泡2 h，取出后用消毒吸水纸将水分尽量吸干，置入6孔板中备用。收集第2代兔关节软骨细胞，以离心半径8 cm、1 500 r/min离心5 min，将细胞制成密度为2×107个/mL的细胞悬液，每个支架接种1 mL细胞悬液，待完全吸附湿润后放入37℃、5%CO2及95%湿度培养箱中，孵育2 h后取出放入培养瓶中，缓慢添加含10%FBS、50 μg/mL抗坏血酸、40 μg/mL脯氨酸、非必需氨基酸和500 U/mL抑肽酶的DMEM培养液，进行静态预培养5 d。
1.4 实验分组及培养方法
预培养5 d后将细胞-支架复合物随机分为2组，均采用软骨培养液（含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM/F12培养基）。A组继续静态培养3周，每周换液3次。B组采用模拟压应力三维动态培养：将细胞-支架复合物置于生物反应器培养仓内，按设定条件行力学加载培养。为模拟人日常活动状态，加压条件为[10-11]：15%压缩应变、频率1 Hz；每天加载2次，每次1 h，间隔8 h，连续加载3周。蠕动泵驱动培养液循环，流速为3 mL/min。整个加载过程在37℃、95%湿度环境中进行；力学加载装置在使用前对其零件均进行高温高压、60Co辐照等灭菌处理。培养3周后取出两组样本，进行以下检测。
1.5 检测指标
1.5.1 细胞活性检测
采用活-死细胞染色试剂盒检测细胞活性。两组样本弃培养基，经PBS清洗后，切取中央部分薄片（厚度1 mm），避光、20℃环境下，FDA（5×10-3 mg/mL）工作液反应5 min。弃去反应后液体，PBS清洗2次，激光共聚焦显微镜下观察细胞活性。
1.5.2 扫描电镜观察
两组样本PBS清洗后，2.5%戊二醛4℃恒温下固定24 h，取出PBS清洗20 min×2次，1%四氧化锇酸后固定2 h，PBS清洗，95%乙醇脱水过夜后，室温干燥48 h，上机喷金，扫描电镜观察细胞在支架上的形态和分布。
1.5.3 生化成分分析
①糖胺聚糖（glycosaminog-lycan，GAG）含量测定：采用二甲基亚甲蓝比色法，两组各取4个样本，冻干后称重，加入木瓜蛋白酶裂解液，65℃裂解48 h，以离心半径8 cm、1 500 r/min离心5 min。取裂解液100 µL加入3 mL二甲基亚甲蓝，于紫外分光光度计480 nm波长下检测吸光度（A）值，根据标准品浓度作标准曲线，计算GAG含量。②胶原蛋白含量测定：根据羟脯氨酸试剂盒说明，用紫外分光光度计测定样本中羟脯氨酸含量后，换算成胶原蛋白含量。吸取①中制备的两组木瓜蛋白酶裂解液0.5 mL，加试剂盒水解液1 mL水解20 min；调整pH值至6.0～6.8，加蒸馏水至10 mL，混匀；加适量活性炭，以离心半径8 cm、3 500 r/min离心10 min，取1 mL上清加入5 µg/mL标准液1 mL，混匀，60℃水浴15 min；冷却后以离心半径8 cm、3 500 r/min离心10 min，取上清加入石英杯内，于紫外分光光度计550 nm波长处比色，蒸馏水调零，测各管A值，计算胶原蛋白含量。③ DNA含量检测：以小牛胸腺DNA含量作为标准，两组各取4个样本，用荧光染料Hoechst 33258标记后，采用荧光测定法（激发波长355 nm，发射波长450 nm）分析DNA含量。
1.5.4 力学性能测试
两组各取4个样本，在湿润状态下采用非限制性静态压缩试验测试弹性模量。用游标卡尺测量并记录样本的初始直径和厚度，将其放置于金属压台，连接力学试验机，以0.05 mm/s位移速率进行压缩，实时记录测试样本的载荷，计算相应的应力和应变，根据应力-应变曲线初始线性区域斜率得到样本弹性模量。另取空白支架作为对照组。
1.6 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 细胞活性检测
激光共聚焦显微镜观察示，B组支架内绿色活细胞增殖旺盛，分布较均匀，排列紧密；A组细胞增殖较差，分布欠均匀，细胞多集中于支架边缘，而中心区域失染。见图 3。
2.2 扫描电镜观察
扫描电镜观察示，B组软骨细胞在支架表面及内部均匀分布，支架孔隙被细胞及分泌的ECM填满，细胞在支架上黏附、增殖、生长良好；而A组软骨细胞明显减少，且分布散乱，ECM分泌较少，未见融合成片。见图 4。
2.3 生化成分分析
B组胶原蛋白、GAG及DNA含量分别为（675.85±27.93）µg/mg、（621.72±26.75）µg/mg、（16.98±3.23）µg/样本，A组分别为（438.72±6.35）µg/mg、（301.63±30.51）µg/mg、（10.18±4.39）µg/样本。B组各含量均明显高于A组，比较差异均有统计学意义（t=18.512，P=0.000；t=17.640，P=0.000；t=2.790，P=0.024）。
2.4 力学性能测试
A、B组及对照组的弹性模量分别为（0.49±0.16）、（0.67±0.09）、（0.43±0.12）MPa，B组显著高于A组和对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；A组和对照组间差异无统计学意义（P > 0.05）。
3 讨论
虽然目前对力学刺激影响细胞发生反应的传导机制尚不明确，但既往研究表明机械刺激在体内、外均对软骨细胞的生长有重要调控作用[12]，对接种于载体的软骨细胞给予一定力学负荷时，可促进细胞的合成代谢过程，从而提高ECM的分泌[13]。模拟关节软骨细胞在体内的正常力学环境对体外构建组织工程软骨有非常重要作用。本研究结果表明，周期性的动态压缩应力刺激对兔关节软骨细胞在脱细胞软骨ECM源性三维多孔支架中的生长有明显促进作用，与静态培养相比，动态培养可维持细胞增殖，增加软骨ECM的合成，促进组织工程软骨组织的成熟。
三维支架系统如凝胶、海绵状或纤维网状等结构，可提供一种防止种子细胞去分化的环境[14]；然而三维立体培养虽可较好维持细胞表型，但静态培养时由于支架材料空间内部的营养物质传输障碍，细胞增殖受限，组织块中央出现细胞坏死的“空心”现象[15]，使组织工程构建受到了很大限制。本研究中静态培养组也出现同样结果，软骨细胞在支架内的分布是表面多、中央少，可能与三维多孔支架结构表面所形成的黏滞阻力有关；而动态培养组的细胞在支架中分布较均匀，并保持良好活力。分析原因可能为细胞-支架复合物在生物反应器内所受的不仅是压缩力，由于灌流状态下培养液的交换，还可能受到低水平的流体剪切力等影响。这些力抵消或改变了支架表面的黏滞阻力，形成了局部复杂的力学生物学“微环境”，从而促进营养供应，刺激软骨细胞在支架中的增殖和胶原、蛋白多糖等的合成。有研究发现，持续的循环载荷可增强软骨细胞在支架内胶原蛋白启动子的活性[16]；然而也有一些研究表明，机械负荷对软骨细胞胶原的表达并无影响甚至有所降低[17-18]。这些相互矛盾的结果可能是与使用不同支架、细胞和力学刺激方案有关。
“功能性组织工程学”是上世纪末美国生物力学委员会提出的概念，并在组织工程学的基础上逐渐发展起来，其重点强调了对组织工程组织的功能性进行评价。所有矫形外科组织工程的主要目的都是恢复其正常生物力学功能，构建功能性组织工程软骨的目标是培养具有一定力学特性的组织，这些特性包括允许组织内间质液压的形成、软骨的应力松弛及蠕变特性、润滑功能等[12, 19]。正常生理状态下，关节软骨承载不同机械负荷的能力依赖于其组织结构、生化成分和含水量。软骨细胞合成的ECM包括GAG、胶原以及其他蛋白质与非蛋白质分子，它们是维持健康的功能性软骨组织所必需条件。而且，生理性负荷通过包括压缩、剪切、拉伸应变、静水压力、间质液流动、流动电位及对流性分子运输等机械性电化学传导介质影响软骨细胞的新陈代谢活性和软骨的组成、结构和功能[20]。本研究采用缓和的周期性压力刺激软骨细胞，频率1 Hz相当于人行走时的膝关节受力频率，结果显示动态培养的细胞-支架复合物弹性模量显著高于静态培养及空白支架，表现出了良好的抗压力学性能。
综上述，体外模拟压应力的三维动态培养可促进组织工程复合体的营养供应，并通过一定机械力学刺激增强其生化和生物力学特性。然而，本研究也存在一些局限性，未考虑种子细胞来源的物种、年龄，初始接种密度，不同弹性模量材料来源的支架，各种生长因子的添加及不同力学加载方案对细胞-支架复合物的综合影响。下一步需探索最适合的组合方案，并结合动物体内实验证明其转化应用于临床的可行性。
