引用本文： 施剑明, 曹俊, 殷明, 殷嫦嫦, 程细高, 谢荣辉, 林思文, 徐浚怀. 白血病抑制因子联合bFGF对人BMSCs增殖及分化的影响. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(9): 1150-1155. doi: 10.7507/1002-1892.20140249 复制
干细胞可广泛应用于组织工程、细胞工程、药物筛选等领域，获得大量多能干细胞是近十年研究的热点；通过转基因手段将成纤维细胞转化为诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）是该领域的重大突破[1]，但由于具有高致瘤性等安全性问题，iPS还不能作为替代细胞用于生物治疗[2]，因此研究如何获得大量可作为替代细胞用途的干细胞具有重要意义。BMSCs具有强大的多向分化潜能，在不同条件下可向多个胚层的细胞分化[3-6]，且具有来源广、安全性高等优点，因而可作为替代细胞用于组织工程及细胞工程领域的研究。然而研究发现[7-9]，经多次传代后，BMSCs会出现不同程度的衰老、分化征象，导致增殖效率及分化潜能随之下降，限制了其在上述领域的应用。因此如何快速体外扩增BMSCs并尽量维持其多向分化潜能具有重要意义。bFGF作为一种内源性多肽生长因子，已被证实具有强大的促进BMSCs增殖作用[10]；然而我们既往研究显示，bFGF在促进BMSCs增殖的同时会导致其不同程度向神经细胞分化[11-12]。白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）是IL-6细胞因子家族中的一员，其在BMSCs中的表达量随着BMSCs的分化而下降，提示LIF是一种抑制BMSCs分化的生长因子[13]。本次实验我们联合LIF和bFGF作用于体外培养的人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs），以寻求建立一种体外快速、大量扩增hBMSCs的新方法。
1 材料与方法
1.1 实验材料及主要试剂、仪器
hBMSCs（江阴齐氏生物科技有限公司），取第2代细胞用于实验。α-MEM培养基（HyClone公司，美国）；FBS（GIBCO公司，美国）；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、胰蛋白酶粉及青、链霉素混合液（北京索莱宝科技有限公司）；bFGF、LIF（Peprotech公司，美国）；CD44-FITC、CD90-PE、CD19-PE、CD34-FITC、HLA-DR-FITC、IgG-PE单抗（Abcam公司，英国）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8；上海经科化学科技有限公司）；25 cm2塑料培养瓶、96孔板（Corning公司，美国）。倒置相差显微镜（Nikon公司，日本）；CO2恒温培养箱（SIM公司，美国）；Model680酶标仪（Bio-Rad公司，美国）；流式细胞仪（BD公司，美国）。
1.2 hBMSCs的扩增、纯化及鉴定
取第2代hBMSCs，用含10%FBS及1%双抗的α-MEM培养基常规贴壁培养，每3天换液1次，待贴壁细胞融合达90%后按1：3比例传代，取换液、传代纯化后的第4代hBMSCs进行鉴定。用0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）消化第4代hBMSCs后，以含10%FBS的PBS离心（离心半径10 cm、1 000 r/min离心5 min）洗涤2遍，再用含10%FBS的PBS重悬细胞，调整细胞密度为1×106个/mL，分装至5个1.5 mL EP管中，每管80 μL；分别加入CD44-FITC、CD90-PE、CD19-PE、CD34-FITC单抗20 µL，其中CD19-PE、CD34-FITC加入同一管细胞中，并设置同型对照组（含HLA-DR-FITC、IgG-PE单抗）、空白对照组，室温避光孵育30 min后同上法离心洗涤2遍，去除未结合抗体，2 h内流式细胞仪检测鉴定。
1.3 CCK-8测定不同培养条件下hBMSCs生长曲线
取对数生长期的第4代hBMSCs常规消化后，按1×104个/mL密度接种于96孔板中，每孔200 µL，共接种7块板。根据培养条件不同分为4组：A组为对照组，加入完全培养基（含10%FBS的α-MEM培养基）常规继续培养；B组为LIF组，加入含10 ng/mL LIF的完全培养基；C组为bFGF组，加入含10 ng/mL bFGF的完全培养基；D组为LIF + bFGF组，加入含10 ng/mL LIF和10 ng/mL bFGF的完全培养基。每组设4个复孔及药物空白孔，每3天换液1次。分别于培养1、3、5、7、9、11、13 d各取1块培养板行CCK-8检测。每孔加入20 μL CCK-8试剂，CO2恒温培养箱中孵育2 h后取出，于酶标仪450 nm波长处测定其吸光度（A）值，绘制生长曲线。
1.4 倒置相差显微镜观察不同培养条件下hBMSCs形态变化
取第4代hBMSCs种植于25 cm2塑料培养瓶中，同1.3方法分组，每组各1瓶。每3天换液1次，待贴壁细胞融合达90%后按1：3比例传代，倒置相差显微镜连续观察细胞形态变化。
1.5 流式细胞术检测不同培养条件下hBMSCs表面标志变化
取第4代hBMSCs同1.3方法分组后培养传代至第8代，同1.2方法于流式细胞仪上检测各组hBMSCs表面标志CD44、CD90、CD19、CD34的表达。
1.6 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Scheffe检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 hBMSCs的扩增、纯化及鉴定
第2代细胞贴壁后形态多样，大部分呈典型的多角形、长梭形（图 1a）；约2周后细胞呈紧密的漩涡样及鱼群样集落，融合达90%。传至第3代后细胞形态以长梭形或扁平形为主，但仍含有少量杂细胞（图 1b）。第4代细胞形态基本呈单一成纤维细胞样，呈漩涡状贴壁生长（图 1c）。
图1
hBMSCs形态学观察（倒置相差显微镜× 100）ⓐ第2代细胞培养1 d ⓑ第3代细胞培养7 d ⓒ第4代细胞培养14 d 图 2流式细胞术鉴定第4代hBMSCs表面标志ⓐ空白对照ⓑCD44 ⓒCD90 ⓓCD19/34
Figure1.
Morphology observation of hBMSCs (Inverted phase contrast microscope×100) ⓐhBMSCs at passage 2 cultured for 1 day ⓑhBMSCs at passage 3 cultured for 7 days ⓒhBMSCs at passage 4 cultured for 14 days Fig. 2 Surface markers of hBMSCs at passage 4 by flow cytometry ⓐBlank control group ⓑCD44 ⓒCD90 ⓓCD19/34
第4代细胞经流式细胞术检测示，细胞表面骨髓基质标志CD44、CD90表达呈阳性，分别为98.24%、95.89%；而造血细胞标志CD19、CD34表达呈阴性，合计阳性率仅为1.91%。见图 2。
2.2 CCK-8测定不同培养条件下hBMSCs生长曲线
4组细胞生长曲线均近似S形。A、B组细胞接种5 d内增殖相对缓慢，处于潜伏期；于5 d开始进入对数生长期，7～13 d时B组A值高于A组，差异有统计学意义（P < 0.05）；A、B组分别于11 d和9 d后进入平台期。C、D组均于3 d即进入对数生长期，3～13 d时C、D组A值均高于A组，差异有统计学意义（P < 0.05）；5～13 d时C组A值高于B组，差异有统计学意义（P < 0.05）；3～13 d时D组A值高于B组，差异有统计学意义（P < 0.05）；3～11 d时D组A值高于C组，差异有统计学意义（P < 0.05）；C、D组分别于9 d和7 d进入平台期。见图 3。
图3
各组hBMSCs生长曲线
Figure3.
The growth curves of hBMSCs in different groups
2.3 不同培养条件下hBMSCs形态变化
倒置相差显微镜观察示，A组hBMSCs生长缓慢，传至第6代后细胞即出现不同程度的衰老、分化征象，表现为细胞胞体变大、立体感减弱、细胞间间隔不清、部分细胞呈扁平状、细胞形状趋向多样（似枯树皮样），且培养基中漂浮碎末状物质；传至第10代后细胞逐渐停止生长，大量细胞脱离培养瓶呈漂浮状态。C组第4代细胞表现出较快的增殖速率；传至第5、6代后早期可观察到少量细胞呈神经样细胞分化，表现为细胞体积变小、胞体呈圆形或椭圆形、向周围伸出突起、折光性增强，但增殖速率仍较快；传至第10代后细胞出现不同程度老化现象，神经样细胞逐渐消失。D组细胞增殖迅速，传至第10代后大多数细胞仍能维持hBMSCs的形态特点。B组细胞与C、D组比较生长相对缓慢，传至第10代后部分细胞呈扁平状，似衰老细胞。见图 4。
图4
倒置相差显微镜观察各组细胞形态学变化ⓐA组第4代（× 100）ⓑB组第4代（× 100）ⓒC组第4代（× 100）ⓓD组第4代（× 100）ⓔA组第6代（× 100）ⓕB组第6代（× 100）ⓖC组第6代（× 200）箭头示神经样细胞ⓗD组第6代（× 100）ⓘA组第8代（× 100）ⓙB组第8代（× 100）ⓚC组第8代（× 100）箭头示神经样细胞ⓛD组第8代（× 100）ⓜA组第10代（× 100）ⓝB组第10代（× 100）ⓞC组第10代（× 100）ⓟD组第10代（×100）
Figure4.
Morphology observation of hBMSCs by inverted phase contrast microscope ⓐhBMSCs at passage 4 in group A (× 100) ⓑhBMSCs at passage 4 in group B (× 100) ⓒhBMSCs at passage 4 in group C (× 100) ⓓhBMSCs at passage 4 in group D (× 100) ⓔhBMSCs at passage 6 in group A (× 100) ⓕhBMSCs at passage 6 in group B (× 100) ⓖhBMSCs at passage 6 in group C (× 200) Arrow indicated nerve-like cells ⓗhBMSCs at passage 6 in group D (× 100) ⓘhBMSCs at passage 8 in group A (× 100) ⓙhBMSCs at passage 8 in group B (× 100) ⓚhBMSCs at passage 8 in group C (× 100) Arrow indicated nerve-like cells ⓛhBMSCs at passage 8 in group D (× 100) ⓜhBMSCs at passage 10 in group A (× 100) ⓝhBMSCs at passage 10 in group B (× 100) ⓞhBMSCs at passage 10 in group C (× 100) ⓟhBMSCs at passage 10 in group D (× 100)
2.4 流式细胞术检测不同培养条件下hBMSCs表面标志变化
各组第8代细胞流式细胞术检测示，与第4代细胞相比，A、C组骨髓基质标志CD44、CD90表达明显下降；而B、D组均能维持较高表达。各组造血细胞标志CD19、CD34均呈阴性，组间差异不明显。见图 5。
图5
流式细胞术检测各组第8代hBMSCs表面标志ⓐA组CD44 ⓑB组CD44 ⓒC组CD44 ⓓD组CD44 ⓔA组CD90 ⓕB组CD90 ⓖC组CD90 ⓗD组CD90 ⓘA组CD19/34 ⓙB组CD19/34 ⓚC组CD19/34 ⓛD组CD19/34
Figure5.
Surface markers of hBMSCs at passage 8 by flow cytometry ⓐExpression of CD44 in group A ⓑExpression of CD44 in group B ⓒExpression of CD44 in group C ⓓExpression of CD44 in group D ⓔExpression of CD90 in group A ⓕExpression of CD90 in group B ⓖExpression of CD90 in group C ⓗExpression of CD90 in group D ⓘExpression of CD19/34 in group A ⓙExpression of CD19/34 in group B ⓚExpression of CD19/34 in group C ⓛExpression of CD19/34 in group D
3 讨论
由于骨髓中BMSCs含量极少，仅占骨髓单核细胞的0.001%～0.01%，要获得足够的BMSCs就必须实现其体外快速有效扩增。体内BMSCs处于精确复杂的微环境中，具有强大的自我增殖能力及多向分化潜能；但体外培养的BMSCs因失去了机体的神经体液调节，无法获得足够维持其干性及增殖所需的细胞因子，且由体内多种不同类型细胞相互影响变成了单一细胞接触，导致BMSCs增殖效率及分化潜能下降。因此，如何在体外培养BMSCs过程中通过合理添加细胞因子对细胞进行调控，提高其增殖能力、保留分化潜能是目前研究的主要问题。
bFGF是一种含118～155个氨基酸的促有丝分裂的阳离子多肽，具有很强的促细胞分裂增殖及抑制细胞凋亡作用。LIF在调节细胞存活、增殖和分化方面发挥着重要作用[14]，因其能够抑制胚胎干细胞分化已广泛用于胚胎干细胞的体外培养[15]；而LIF对于BMSCs的作用尚不清楚。Gimble等[16]和Malaval等[17]分别报道了LIF能够抑制BMSCs向脂肪细胞及成骨细胞分化；Whitney等[13]的研究从基因水平证实随着BMSCs的传代及分化，LIF表达量逐渐下降。因此，我们认为LIF对BMSCs可能具有类似于其对胚胎干细胞抑制分化的作用。而这一作用可能是通过作用于细胞表面的LIF受体及gp130受体，从而激活JAK-STAT信号途径来发挥作用的[14]。
增殖和分化是hBMSCs自我更新过程中相互制约的两种细胞特性。本实验将LIF及bFGF单独或联合作用于hBMSCs，通过CCK-8法测得LIF和bFGF均有促进hBMSCs增殖的作用，且两者联合时作用更明显。细胞形态学观察及流式细胞术鉴定结果均表明LIF能够抑制hBMSCs分化，而LIF对hBMSCs的促增殖作用可能与hBMSCs分化减少有关。hBMSCs在bFGF作用一段时间后，出现少量细胞呈神经样细胞分化，这与文献报道[18-20]一致，但仍以促细胞增殖作用为主，这可能与血清浓度有关。因前期实验中我们发现，bFGF对BMSCs的作用在较低血清浓度（1%）主要表现为诱导细胞分化[12]，而在本次实验采用较高血清浓度（10%）培养时主要表现为促细胞增殖。LIF联合bFGF作用于hBMSCs，不仅具有明显的促增殖作用，而且能够抑制其分化，两种细胞因子存在协同效应。
综上述，本实验结果表明LIF联合bFGF不仅可以维持hBMSCs的生物学特性，而且能够促进hBMSCs的快速增殖，是一种理想的体外扩增hBMSCs方法，可为组织工程、细胞治疗和基因治疗等领域提供大量具有生物学活性的种子细胞。
干细胞可广泛应用于组织工程、细胞工程、药物筛选等领域，获得大量多能干细胞是近十年研究的热点；通过转基因手段将成纤维细胞转化为诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）是该领域的重大突破[1]，但由于具有高致瘤性等安全性问题，iPS还不能作为替代细胞用于生物治疗[2]，因此研究如何获得大量可作为替代细胞用途的干细胞具有重要意义。BMSCs具有强大的多向分化潜能，在不同条件下可向多个胚层的细胞分化[3-6]，且具有来源广、安全性高等优点，因而可作为替代细胞用于组织工程及细胞工程领域的研究。然而研究发现[7-9]，经多次传代后，BMSCs会出现不同程度的衰老、分化征象，导致增殖效率及分化潜能随之下降，限制了其在上述领域的应用。因此如何快速体外扩增BMSCs并尽量维持其多向分化潜能具有重要意义。bFGF作为一种内源性多肽生长因子，已被证实具有强大的促进BMSCs增殖作用[10]；然而我们既往研究显示，bFGF在促进BMSCs增殖的同时会导致其不同程度向神经细胞分化[11-12]。白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）是IL-6细胞因子家族中的一员，其在BMSCs中的表达量随着BMSCs的分化而下降，提示LIF是一种抑制BMSCs分化的生长因子[13]。本次实验我们联合LIF和bFGF作用于体外培养的人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs），以寻求建立一种体外快速、大量扩增hBMSCs的新方法。
1 材料与方法
1.1 实验材料及主要试剂、仪器
hBMSCs（江阴齐氏生物科技有限公司），取第2代细胞用于实验。α-MEM培养基（HyClone公司，美国）；FBS（GIBCO公司，美国）；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、胰蛋白酶粉及青、链霉素混合液（北京索莱宝科技有限公司）；bFGF、LIF（Peprotech公司，美国）；CD44-FITC、CD90-PE、CD19-PE、CD34-FITC、HLA-DR-FITC、IgG-PE单抗（Abcam公司，英国）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8；上海经科化学科技有限公司）；25 cm2塑料培养瓶、96孔板（Corning公司，美国）。倒置相差显微镜（Nikon公司，日本）；CO2恒温培养箱（SIM公司，美国）；Model680酶标仪（Bio-Rad公司，美国）；流式细胞仪（BD公司，美国）。
1.2 hBMSCs的扩增、纯化及鉴定
取第2代hBMSCs，用含10%FBS及1%双抗的α-MEM培养基常规贴壁培养，每3天换液1次，待贴壁细胞融合达90%后按1：3比例传代，取换液、传代纯化后的第4代hBMSCs进行鉴定。用0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）消化第4代hBMSCs后，以含10%FBS的PBS离心（离心半径10 cm、1 000 r/min离心5 min）洗涤2遍，再用含10%FBS的PBS重悬细胞，调整细胞密度为1×106个/mL，分装至5个1.5 mL EP管中，每管80 μL；分别加入CD44-FITC、CD90-PE、CD19-PE、CD34-FITC单抗20 µL，其中CD19-PE、CD34-FITC加入同一管细胞中，并设置同型对照组（含HLA-DR-FITC、IgG-PE单抗）、空白对照组，室温避光孵育30 min后同上法离心洗涤2遍，去除未结合抗体，2 h内流式细胞仪检测鉴定。
1.3 CCK-8测定不同培养条件下hBMSCs生长曲线
取对数生长期的第4代hBMSCs常规消化后，按1×104个/mL密度接种于96孔板中，每孔200 µL，共接种7块板。根据培养条件不同分为4组：A组为对照组，加入完全培养基（含10%FBS的α-MEM培养基）常规继续培养；B组为LIF组，加入含10 ng/mL LIF的完全培养基；C组为bFGF组，加入含10 ng/mL bFGF的完全培养基；D组为LIF + bFGF组，加入含10 ng/mL LIF和10 ng/mL bFGF的完全培养基。每组设4个复孔及药物空白孔，每3天换液1次。分别于培养1、3、5、7、9、11、13 d各取1块培养板行CCK-8检测。每孔加入20 μL CCK-8试剂，CO2恒温培养箱中孵育2 h后取出，于酶标仪450 nm波长处测定其吸光度（A）值，绘制生长曲线。
1.4 倒置相差显微镜观察不同培养条件下hBMSCs形态变化
取第4代hBMSCs种植于25 cm2塑料培养瓶中，同1.3方法分组，每组各1瓶。每3天换液1次，待贴壁细胞融合达90%后按1：3比例传代，倒置相差显微镜连续观察细胞形态变化。
1.5 流式细胞术检测不同培养条件下hBMSCs表面标志变化
取第4代hBMSCs同1.3方法分组后培养传代至第8代，同1.2方法于流式细胞仪上检测各组hBMSCs表面标志CD44、CD90、CD19、CD34的表达。
1.6 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Scheffe检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 hBMSCs的扩增、纯化及鉴定
第2代细胞贴壁后形态多样，大部分呈典型的多角形、长梭形（图 1a）；约2周后细胞呈紧密的漩涡样及鱼群样集落，融合达90%。传至第3代后细胞形态以长梭形或扁平形为主，但仍含有少量杂细胞（图 1b）。第4代细胞形态基本呈单一成纤维细胞样，呈漩涡状贴壁生长（图 1c）。
图1
hBMSCs形态学观察（倒置相差显微镜× 100）ⓐ第2代细胞培养1 d ⓑ第3代细胞培养7 d ⓒ第4代细胞培养14 d 图 2流式细胞术鉴定第4代hBMSCs表面标志ⓐ空白对照ⓑCD44 ⓒCD90 ⓓCD19/34
Figure1.
Morphology observation of hBMSCs (Inverted phase contrast microscope×100) ⓐhBMSCs at passage 2 cultured for 1 day ⓑhBMSCs at passage 3 cultured for 7 days ⓒhBMSCs at passage 4 cultured for 14 days Fig. 2 Surface markers of hBMSCs at passage 4 by flow cytometry ⓐBlank control group ⓑCD44 ⓒCD90 ⓓCD19/34
第4代细胞经流式细胞术检测示，细胞表面骨髓基质标志CD44、CD90表达呈阳性，分别为98.24%、95.89%；而造血细胞标志CD19、CD34表达呈阴性，合计阳性率仅为1.91%。见图 2。
2.2 CCK-8测定不同培养条件下hBMSCs生长曲线
4组细胞生长曲线均近似S形。A、B组细胞接种5 d内增殖相对缓慢，处于潜伏期；于5 d开始进入对数生长期，7～13 d时B组A值高于A组，差异有统计学意义（P < 0.05）；A、B组分别于11 d和9 d后进入平台期。C、D组均于3 d即进入对数生长期，3～13 d时C、D组A值均高于A组，差异有统计学意义（P < 0.05）；5～13 d时C组A值高于B组，差异有统计学意义（P < 0.05）；3～13 d时D组A值高于B组，差异有统计学意义（P < 0.05）；3～11 d时D组A值高于C组，差异有统计学意义（P < 0.05）；C、D组分别于9 d和7 d进入平台期。见图 3。
图3
各组hBMSCs生长曲线
Figure3.
The growth curves of hBMSCs in different groups
2.3 不同培养条件下hBMSCs形态变化
倒置相差显微镜观察示，A组hBMSCs生长缓慢，传至第6代后细胞即出现不同程度的衰老、分化征象，表现为细胞胞体变大、立体感减弱、细胞间间隔不清、部分细胞呈扁平状、细胞形状趋向多样（似枯树皮样），且培养基中漂浮碎末状物质；传至第10代后细胞逐渐停止生长，大量细胞脱离培养瓶呈漂浮状态。C组第4代细胞表现出较快的增殖速率；传至第5、6代后早期可观察到少量细胞呈神经样细胞分化，表现为细胞体积变小、胞体呈圆形或椭圆形、向周围伸出突起、折光性增强，但增殖速率仍较快；传至第10代后细胞出现不同程度老化现象，神经样细胞逐渐消失。D组细胞增殖迅速，传至第10代后大多数细胞仍能维持hBMSCs的形态特点。B组细胞与C、D组比较生长相对缓慢，传至第10代后部分细胞呈扁平状，似衰老细胞。见图 4。
图4
倒置相差显微镜观察各组细胞形态学变化ⓐA组第4代（× 100）ⓑB组第4代（× 100）ⓒC组第4代（× 100）ⓓD组第4代（× 100）ⓔA组第6代（× 100）ⓕB组第6代（× 100）ⓖC组第6代（× 200）箭头示神经样细胞ⓗD组第6代（× 100）ⓘA组第8代（× 100）ⓙB组第8代（× 100）ⓚC组第8代（× 100）箭头示神经样细胞ⓛD组第8代（× 100）ⓜA组第10代（× 100）ⓝB组第10代（× 100）ⓞC组第10代（× 100）ⓟD组第10代（×100）
Figure4.
Morphology observation of hBMSCs by inverted phase contrast microscope ⓐhBMSCs at passage 4 in group A (× 100) ⓑhBMSCs at passage 4 in group B (× 100) ⓒhBMSCs at passage 4 in group C (× 100) ⓓhBMSCs at passage 4 in group D (× 100) ⓔhBMSCs at passage 6 in group A (× 100) ⓕhBMSCs at passage 6 in group B (× 100) ⓖhBMSCs at passage 6 in group C (× 200) Arrow indicated nerve-like cells ⓗhBMSCs at passage 6 in group D (× 100) ⓘhBMSCs at passage 8 in group A (× 100) ⓙhBMSCs at passage 8 in group B (× 100) ⓚhBMSCs at passage 8 in group C (× 100) Arrow indicated nerve-like cells ⓛhBMSCs at passage 8 in group D (× 100) ⓜhBMSCs at passage 10 in group A (× 100) ⓝhBMSCs at passage 10 in group B (× 100) ⓞhBMSCs at passage 10 in group C (× 100) ⓟhBMSCs at passage 10 in group D (× 100)
2.4 流式细胞术检测不同培养条件下hBMSCs表面标志变化
各组第8代细胞流式细胞术检测示，与第4代细胞相比，A、C组骨髓基质标志CD44、CD90表达明显下降；而B、D组均能维持较高表达。各组造血细胞标志CD19、CD34均呈阴性，组间差异不明显。见图 5。
图5
流式细胞术检测各组第8代hBMSCs表面标志ⓐA组CD44 ⓑB组CD44 ⓒC组CD44 ⓓD组CD44 ⓔA组CD90 ⓕB组CD90 ⓖC组CD90 ⓗD组CD90 ⓘA组CD19/34 ⓙB组CD19/34 ⓚC组CD19/34 ⓛD组CD19/34
Figure5.
Surface markers of hBMSCs at passage 8 by flow cytometry ⓐExpression of CD44 in group A ⓑExpression of CD44 in group B ⓒExpression of CD44 in group C ⓓExpression of CD44 in group D ⓔExpression of CD90 in group A ⓕExpression of CD90 in group B ⓖExpression of CD90 in group C ⓗExpression of CD90 in group D ⓘExpression of CD19/34 in group A ⓙExpression of CD19/34 in group B ⓚExpression of CD19/34 in group C ⓛExpression of CD19/34 in group D
3 讨论
由于骨髓中BMSCs含量极少，仅占骨髓单核细胞的0.001%～0.01%，要获得足够的BMSCs就必须实现其体外快速有效扩增。体内BMSCs处于精确复杂的微环境中，具有强大的自我增殖能力及多向分化潜能；但体外培养的BMSCs因失去了机体的神经体液调节，无法获得足够维持其干性及增殖所需的细胞因子，且由体内多种不同类型细胞相互影响变成了单一细胞接触，导致BMSCs增殖效率及分化潜能下降。因此，如何在体外培养BMSCs过程中通过合理添加细胞因子对细胞进行调控，提高其增殖能力、保留分化潜能是目前研究的主要问题。
bFGF是一种含118～155个氨基酸的促有丝分裂的阳离子多肽，具有很强的促细胞分裂增殖及抑制细胞凋亡作用。LIF在调节细胞存活、增殖和分化方面发挥着重要作用[14]，因其能够抑制胚胎干细胞分化已广泛用于胚胎干细胞的体外培养[15]；而LIF对于BMSCs的作用尚不清楚。Gimble等[16]和Malaval等[17]分别报道了LIF能够抑制BMSCs向脂肪细胞及成骨细胞分化；Whitney等[13]的研究从基因水平证实随着BMSCs的传代及分化，LIF表达量逐渐下降。因此，我们认为LIF对BMSCs可能具有类似于其对胚胎干细胞抑制分化的作用。而这一作用可能是通过作用于细胞表面的LIF受体及gp130受体，从而激活JAK-STAT信号途径来发挥作用的[14]。
增殖和分化是hBMSCs自我更新过程中相互制约的两种细胞特性。本实验将LIF及bFGF单独或联合作用于hBMSCs，通过CCK-8法测得LIF和bFGF均有促进hBMSCs增殖的作用，且两者联合时作用更明显。细胞形态学观察及流式细胞术鉴定结果均表明LIF能够抑制hBMSCs分化，而LIF对hBMSCs的促增殖作用可能与hBMSCs分化减少有关。hBMSCs在bFGF作用一段时间后，出现少量细胞呈神经样细胞分化，这与文献报道[18-20]一致，但仍以促细胞增殖作用为主，这可能与血清浓度有关。因前期实验中我们发现，bFGF对BMSCs的作用在较低血清浓度（1%）主要表现为诱导细胞分化[12]，而在本次实验采用较高血清浓度（10%）培养时主要表现为促细胞增殖。LIF联合bFGF作用于hBMSCs，不仅具有明显的促增殖作用，而且能够抑制其分化，两种细胞因子存在协同效应。
综上述，本实验结果表明LIF联合bFGF不仅可以维持hBMSCs的生物学特性，而且能够促进hBMSCs的快速增殖，是一种理想的体外扩增hBMSCs方法，可为组织工程、细胞治疗和基因治疗等领域提供大量具有生物学活性的种子细胞。
