引用本文： 姜未, 雷光华, 林博文, 王华, 吕猛, 高曙光, 张方杰, 曾超. 骨桥蛋白对人膝骨关节炎软骨细胞基质金属蛋白酶13表达的影响. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(11): 1342-1345. doi: 10.7507/1002-1892.20140291 复制
骨关节炎是临床骨科常见疾病，严重影响中老年人的健康和生活质量[1-2]，主要表现为关节疼痛、肿胀、僵硬、畸形和功能障碍等[3]。目前骨关节炎病因尚未明确，软骨磨损、缺失是核心病理改变，炎性介质/因子刺激造成软骨合成与分解代谢紊乱，促使软骨细胞外基质中最主要成分Ⅱ型胶原的水解是骨关节炎发病的主要分子机制[4-5]。
骨桥蛋白（osteopontin，OPN）是一种磷酸化糖蛋白，广泛参与炎性反应、肿瘤转移等生理过程。研究已证实OPN在骨关节炎组织中高表达，且与骨关节炎的病理程度相关[6-8]。但OPN对骨关节炎发生的具体调控机制罕见报道。基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）是水解Ⅱ型胶原的重要MMP之一，其可加速细胞外基质降解，促进软骨退变[9-11]。基于以上背景，本研究拟通过人膝骨关节炎软骨细胞模型，观察OPN干预对MMP-13表达的影响，以明确OPN参与骨关节炎发生发展的具体作用机制，为临床骨关节炎的进一步防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验标本与主要试剂、仪器
人膝骨关节炎软骨标本由中南大学湘雅医院骨科收治的14例（16膝）原发膝骨关节炎患者自愿捐赠，男4例，女10例；年龄48～73岁，平均64.1岁。取人工全膝关节置换术中获得的截骨块，PBS液反复清洗，切取关节面软骨缺损区边缘处软骨组织[12]。
重组人OPN/SPP1蛋白（北京义翘神州生物技术有限公司）；兔抗人MMP-13单克隆抗体（Abgent公司，美国）；羊抗兔IgG、TRIzol试剂盒（Invitrogen公司，美国）；Ⅱ型胶原抗体、Ⅱ型胶原酶（Abcam公司，美国）；0.05%胰蛋白酶-EDTA、DEME/F12培养基（GIBCO公司，美国）；反转录试剂盒（Fermentans公司，美国）；JC-PL006 IP细胞裂解液（西安晶彩生物科技有限公司）。倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；IPP6.0图像分析软件（Media Cybernetics公司，美国）。
1.2 骨关节炎软骨细胞分离培养及鉴定
将软骨组织切为l mm×1 mm×1 mm大小，PBS液清洗2次后转入培养皿中，加入4～5 mL 0.15%Ⅱ型胶原酶，置于37℃、5%CO2培养箱消化，直至软骨组织块基本消失、溶液变混浊为止。将溶液转入离心管，以离心半径12 cm，1 200 r/min离心8 min，弃上清，加入完全培养基（含20%FBS的DMEM/F12培养基），充分混匀，计数细胞，以1×105个/mL密度将细胞悬液接种于25 mL培养瓶中，置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，定期换液。当原代细胞融合并覆盖瓶底75%～80%时，用0.05%胰蛋白酶消化，按1:3比例传代。倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。取第1代软骨细胞行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定。
1.3 实验分组及方法
1.3.1 时间依赖性
取第1代软骨细胞，根据观察时间点不同分为0、24、48、72 h 4组。各组采用含1 μg/ mL OPN的完全培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养至对应时间，取材行实时荧光定量PCR和Western blot检测。
1.3.2 浓度依赖性
取第1代软骨细胞，根据OPN浓度不同分为0、0.5、1、2、4μg/mL 5组。各组采用含对应浓度OPN的完全培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h，取材行实时荧光定量PCR和Western blot检测。
1.4 检测指标
1.4.1 实时荧光定量PCR检测
参照TRIzol试剂盒说明提取细胞标本总RNA，鉴定RNA的纯度及完整性。根据GenBank中MMP-13序列设计探针，上游引物：5' -GTGCCCTTCTTCACACAGAC-3' ，下游引物：5' -CAGAATTCAAAGGCCACATC-3' ；β-actin为对照。将1μg RNA加入逆转录体系中合成cDNA，置于— 20℃保存备用。取1 μL cDNA模板加至PCR扩增反应体系中，95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸75 s，循环40次。计算MMP-13/β-actin mRNA相对表达量。
1.4.2 Western blot检测
收集细胞于干净EP管，加入Western及IP细胞裂解液。考马斯亮蓝法制作标准曲线，检测样品的蛋白定量；灌胶、上样、转膜，使用一抗（1:500兔抗人MMP-13单克隆抗体），二抗（1:2 000生物素标记的羊抗兔IgG），图片曝光后用IPP6.0图像分析软件进行灰度分析。
1.5 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，当数据成正态分布、方差齐时，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；当数据成非正态分布、方差不齐时，组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 软骨细胞形态学观察及鉴定
倒置相差显微镜下观察示，原代软骨细胞呈三角或多角等不规则形状，向四周爬行生长（图 1 a）。与原代软骨细胞相比，第1代软骨细胞成团减少，形态均一，密度稍低，细胞间可见伪足连接（图 1 b）。
图1
软骨细胞形态学观察（倒置相差显微镜×100） ⓐ原代细胞ⓑ第1代细胞 图 2 第1代软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定（× 400） 图 3 1μg/mL OPN干预后各时间点软骨细胞MMP-13表达ⓐ mRNA表达ⓑ蛋白表达 图 4 各浓度OPN干预48 h后软骨细胞MMP-13表达ⓐmRNA表达ⓑ蛋白表达
Figure1.
Chondrocyte morphological observation (Inverted phase contrast microscope×100) ⓐPrimary cells ⓑThe first generation of cells Fig. 2 Immunohistochemical staining of the first generation of chondrocytes stained with collagen typeⅡ(×400) Fig. 3 Expressions of MMP-13 in the chondrocytes stimulated with OPN at 1μg/mL for different time ⓐMMP-13 mRNA ⓑMMP-13 protein Fig. 4 Expressions of MMP-13 in the chondrocytes stimulated with OPN at different concentrations for 48 hours ⓐMMP-13 mRNA ⓑ MMP-13 protein
免疫组织化学染色示Ⅱ型胶原染色后呈棕黄色阳性，大量分布于软骨细胞胞质及细胞外基质（图 2）。
2.2 OPN干预后MMP-13表达的时间依赖性
经1μg/mL OPN干预培养后，软骨细胞MMP-13 mRNA及蛋白表达水平随时间增加呈升高趋势，48 h时达峰值，各时间点间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 3。
2.3 OPN干预后MMP-13表达的浓度依赖性
不同浓度OPN干预培养48 h后，1μg/mL组MMP-13 mRNA表达水平较0μg/mL组显著上升，差异有统计学意义（P < 0.05）；0.5、2、4μg/mL组较0 μg/ mL组有一定上升，但比较差异无统计学意义（P > 0.05），且显著低于1μg/mL组（P < 0.05）。而0.5、1、2、4μg/mL组MMP-13蛋白表达水平均较0μg/mL组显著上升，差异均有统计学意义（P < 0.05）；其中1 μg/ mL组升高最为显著，但与其余各浓度组比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见图 4。
3 讨论
OPN是一种带负电荷的分泌型磷酸化糖蛋白，存在于体内多种细胞和组织中，参与骨矿化、肿瘤细胞迁移、慢性感染性疾病等病理过程。Gao等[6]研究发现人膝骨关节炎软骨及滑液中OPN均高表达，且软骨、滑液OPN的表达水平分别与软骨Mankin评分和Kellgren-Lawrence分级成正相关，提示OPN可能参与了骨关节炎发生发展。类似结果在Honsawek等[7]的研究中也得到证实，同时他发现骨关节炎患者血浆中OPN表达亦显著升高。在进一步的研究中，他们还发现凝血酶裂解后的OPN片段生物活性更强，且活性程度同样与骨关节炎程度相关[8]。但以上研究仅观察了OPN与骨关节炎的相关性，对OPN在骨关节炎发生发展中的明确作用及具体机制未作分析。
MMP-13参与分解代谢软骨细胞外基质，大量研究证实其在骨关节炎发生发展中具有重要作用[9-11]。而且在IL-1β、TNF-α、bFGF等刺激作用下，MMP-13分解作用显著加强，促进Ⅱ型胶原水解代谢，细胞外基质破坏，软骨磨损退变[13]。除了对Ⅱ型胶原的直接作用外，MMP-13也具有水解蛋白多糖的能力[14-15]。以上研究表明，MMP-13在骨关节炎发展过程中对软骨组织完整性的保持起着决定性作用。
我们通过对骨关节炎软骨细胞进行干预实验，观察OPN作用软骨细胞后MMP-13表达随时间变化的特点以及不同浓度OPN干预对MMP-13表达的差异。首先经1 μg/mL浓度的OPN进行干预培养，发现MMP-13 mRNA和蛋白表达水平随培养时间延长均明显升高，于48 h时达峰值，此时mRNA和蛋白表达量分别约为0 h的19倍和2倍。然后经不同浓度OPN的干预培养，结果显示随着浓度增加，软骨细胞中MMP-13 mRNA和蛋白水平也相应上升，浓度为1 μg/ mL时达峰值。结果表明，OPN具有上调MMP-13表达的作用，且该作用呈时间和浓度依赖性。
OPN对MMP-13的上调作用在肌腱修复及骨肉瘤转移等相关研究中亦有体现。Mori等[16]观察了OPN-/-与WT型小鼠髌腱组织中MMP-13表达变化，发现经14 d去神经作用后前者MMP-13 mRNA升高程度明显高于后者。Berge等[17]对骨肉瘤细胞OPN进行脂质体介导的RNA干扰处理，发现MMP-13表达明显增高。然而Matsui等[18]研究发现，OPN-/-小鼠软骨细胞体外培养5 d后MMP-13 mRNA表达水平约为WT型小鼠的3倍，且两者MMP-13 mRNA初始水平无显著差异，因此他们认为OPN可下调MMP-13的表达进而延缓骨关节炎进程，同时他们也指出MMP-13表达水平的改变可能与OPN基因敲除后引发其他机制发生而间接导致有关。该结论与本研究结果相反，我们认为可能与观察的实验模型不同有关[16]；或OPN本身处于复杂的分子调控网络中，在不同条件下可表达不同甚至相反的功效，因此需要更深入研究明确。
综上述，OPN可上调人膝骨关节软骨细胞MMP-13表达，进而可能影响Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成与分解代谢，促使软骨细胞外基质降解，加速骨关节炎关节软骨退变。同时OPN对MMP-13的调节具有时间及浓度依赖性，干预的最佳处理浓度和时间分别为1 μg/mL以及48 h，这为今后细胞实验中OPN干预提供了数据支持。然而，关于OPN调控MMP-13的具体机制仍不清楚，是否类似于类风湿性关节炎、肿瘤疾病，存在NF-κB、MAPK等通路激活，将是下一步研究重点。
骨关节炎是临床骨科常见疾病，严重影响中老年人的健康和生活质量[1-2]，主要表现为关节疼痛、肿胀、僵硬、畸形和功能障碍等[3]。目前骨关节炎病因尚未明确，软骨磨损、缺失是核心病理改变，炎性介质/因子刺激造成软骨合成与分解代谢紊乱，促使软骨细胞外基质中最主要成分Ⅱ型胶原的水解是骨关节炎发病的主要分子机制[4-5]。
骨桥蛋白（osteopontin，OPN）是一种磷酸化糖蛋白，广泛参与炎性反应、肿瘤转移等生理过程。研究已证实OPN在骨关节炎组织中高表达，且与骨关节炎的病理程度相关[6-8]。但OPN对骨关节炎发生的具体调控机制罕见报道。基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）是水解Ⅱ型胶原的重要MMP之一，其可加速细胞外基质降解，促进软骨退变[9-11]。基于以上背景，本研究拟通过人膝骨关节炎软骨细胞模型，观察OPN干预对MMP-13表达的影响，以明确OPN参与骨关节炎发生发展的具体作用机制，为临床骨关节炎的进一步防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验标本与主要试剂、仪器
人膝骨关节炎软骨标本由中南大学湘雅医院骨科收治的14例（16膝）原发膝骨关节炎患者自愿捐赠，男4例，女10例；年龄48～73岁，平均64.1岁。取人工全膝关节置换术中获得的截骨块，PBS液反复清洗，切取关节面软骨缺损区边缘处软骨组织[12]。
重组人OPN/SPP1蛋白（北京义翘神州生物技术有限公司）；兔抗人MMP-13单克隆抗体（Abgent公司，美国）；羊抗兔IgG、TRIzol试剂盒（Invitrogen公司，美国）；Ⅱ型胶原抗体、Ⅱ型胶原酶（Abcam公司，美国）；0.05%胰蛋白酶-EDTA、DEME/F12培养基（GIBCO公司，美国）；反转录试剂盒（Fermentans公司，美国）；JC-PL006 IP细胞裂解液（西安晶彩生物科技有限公司）。倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；IPP6.0图像分析软件（Media Cybernetics公司，美国）。
1.2 骨关节炎软骨细胞分离培养及鉴定
将软骨组织切为l mm×1 mm×1 mm大小，PBS液清洗2次后转入培养皿中，加入4～5 mL 0.15%Ⅱ型胶原酶，置于37℃、5%CO2培养箱消化，直至软骨组织块基本消失、溶液变混浊为止。将溶液转入离心管，以离心半径12 cm，1 200 r/min离心8 min，弃上清，加入完全培养基（含20%FBS的DMEM/F12培养基），充分混匀，计数细胞，以1×105个/mL密度将细胞悬液接种于25 mL培养瓶中，置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，定期换液。当原代细胞融合并覆盖瓶底75%～80%时，用0.05%胰蛋白酶消化，按1:3比例传代。倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。取第1代软骨细胞行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定。
1.3 实验分组及方法
1.3.1 时间依赖性
取第1代软骨细胞，根据观察时间点不同分为0、24、48、72 h 4组。各组采用含1 μg/ mL OPN的完全培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养至对应时间，取材行实时荧光定量PCR和Western blot检测。
1.3.2 浓度依赖性
取第1代软骨细胞，根据OPN浓度不同分为0、0.5、1、2、4μg/mL 5组。各组采用含对应浓度OPN的完全培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h，取材行实时荧光定量PCR和Western blot检测。
1.4 检测指标
1.4.1 实时荧光定量PCR检测
参照TRIzol试剂盒说明提取细胞标本总RNA，鉴定RNA的纯度及完整性。根据GenBank中MMP-13序列设计探针，上游引物：5' -GTGCCCTTCTTCACACAGAC-3' ，下游引物：5' -CAGAATTCAAAGGCCACATC-3' ；β-actin为对照。将1μg RNA加入逆转录体系中合成cDNA，置于— 20℃保存备用。取1 μL cDNA模板加至PCR扩增反应体系中，95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸75 s，循环40次。计算MMP-13/β-actin mRNA相对表达量。
1.4.2 Western blot检测
收集细胞于干净EP管，加入Western及IP细胞裂解液。考马斯亮蓝法制作标准曲线，检测样品的蛋白定量；灌胶、上样、转膜，使用一抗（1:500兔抗人MMP-13单克隆抗体），二抗（1:2 000生物素标记的羊抗兔IgG），图片曝光后用IPP6.0图像分析软件进行灰度分析。
1.5 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，当数据成正态分布、方差齐时，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；当数据成非正态分布、方差不齐时，组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 软骨细胞形态学观察及鉴定
倒置相差显微镜下观察示，原代软骨细胞呈三角或多角等不规则形状，向四周爬行生长（图 1 a）。与原代软骨细胞相比，第1代软骨细胞成团减少，形态均一，密度稍低，细胞间可见伪足连接（图 1 b）。
图1
软骨细胞形态学观察（倒置相差显微镜×100） ⓐ原代细胞ⓑ第1代细胞 图 2 第1代软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定（× 400） 图 3 1μg/mL OPN干预后各时间点软骨细胞MMP-13表达ⓐ mRNA表达ⓑ蛋白表达 图 4 各浓度OPN干预48 h后软骨细胞MMP-13表达ⓐmRNA表达ⓑ蛋白表达
Figure1.
Chondrocyte morphological observation (Inverted phase contrast microscope×100) ⓐPrimary cells ⓑThe first generation of cells Fig. 2 Immunohistochemical staining of the first generation of chondrocytes stained with collagen typeⅡ(×400) Fig. 3 Expressions of MMP-13 in the chondrocytes stimulated with OPN at 1μg/mL for different time ⓐMMP-13 mRNA ⓑMMP-13 protein Fig. 4 Expressions of MMP-13 in the chondrocytes stimulated with OPN at different concentrations for 48 hours ⓐMMP-13 mRNA ⓑ MMP-13 protein
免疫组织化学染色示Ⅱ型胶原染色后呈棕黄色阳性，大量分布于软骨细胞胞质及细胞外基质（图 2）。
2.2 OPN干预后MMP-13表达的时间依赖性
经1μg/mL OPN干预培养后，软骨细胞MMP-13 mRNA及蛋白表达水平随时间增加呈升高趋势，48 h时达峰值，各时间点间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 3。
2.3 OPN干预后MMP-13表达的浓度依赖性
不同浓度OPN干预培养48 h后，1μg/mL组MMP-13 mRNA表达水平较0μg/mL组显著上升，差异有统计学意义（P < 0.05）；0.5、2、4μg/mL组较0 μg/ mL组有一定上升，但比较差异无统计学意义（P > 0.05），且显著低于1μg/mL组（P < 0.05）。而0.5、1、2、4μg/mL组MMP-13蛋白表达水平均较0μg/mL组显著上升，差异均有统计学意义（P < 0.05）；其中1 μg/ mL组升高最为显著，但与其余各浓度组比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见图 4。
3 讨论
OPN是一种带负电荷的分泌型磷酸化糖蛋白，存在于体内多种细胞和组织中，参与骨矿化、肿瘤细胞迁移、慢性感染性疾病等病理过程。Gao等[6]研究发现人膝骨关节炎软骨及滑液中OPN均高表达，且软骨、滑液OPN的表达水平分别与软骨Mankin评分和Kellgren-Lawrence分级成正相关，提示OPN可能参与了骨关节炎发生发展。类似结果在Honsawek等[7]的研究中也得到证实，同时他发现骨关节炎患者血浆中OPN表达亦显著升高。在进一步的研究中，他们还发现凝血酶裂解后的OPN片段生物活性更强，且活性程度同样与骨关节炎程度相关[8]。但以上研究仅观察了OPN与骨关节炎的相关性，对OPN在骨关节炎发生发展中的明确作用及具体机制未作分析。
MMP-13参与分解代谢软骨细胞外基质，大量研究证实其在骨关节炎发生发展中具有重要作用[9-11]。而且在IL-1β、TNF-α、bFGF等刺激作用下，MMP-13分解作用显著加强，促进Ⅱ型胶原水解代谢，细胞外基质破坏，软骨磨损退变[13]。除了对Ⅱ型胶原的直接作用外，MMP-13也具有水解蛋白多糖的能力[14-15]。以上研究表明，MMP-13在骨关节炎发展过程中对软骨组织完整性的保持起着决定性作用。
我们通过对骨关节炎软骨细胞进行干预实验，观察OPN作用软骨细胞后MMP-13表达随时间变化的特点以及不同浓度OPN干预对MMP-13表达的差异。首先经1 μg/mL浓度的OPN进行干预培养，发现MMP-13 mRNA和蛋白表达水平随培养时间延长均明显升高，于48 h时达峰值，此时mRNA和蛋白表达量分别约为0 h的19倍和2倍。然后经不同浓度OPN的干预培养，结果显示随着浓度增加，软骨细胞中MMP-13 mRNA和蛋白水平也相应上升，浓度为1 μg/ mL时达峰值。结果表明，OPN具有上调MMP-13表达的作用，且该作用呈时间和浓度依赖性。
OPN对MMP-13的上调作用在肌腱修复及骨肉瘤转移等相关研究中亦有体现。Mori等[16]观察了OPN-/-与WT型小鼠髌腱组织中MMP-13表达变化，发现经14 d去神经作用后前者MMP-13 mRNA升高程度明显高于后者。Berge等[17]对骨肉瘤细胞OPN进行脂质体介导的RNA干扰处理，发现MMP-13表达明显增高。然而Matsui等[18]研究发现，OPN-/-小鼠软骨细胞体外培养5 d后MMP-13 mRNA表达水平约为WT型小鼠的3倍，且两者MMP-13 mRNA初始水平无显著差异，因此他们认为OPN可下调MMP-13的表达进而延缓骨关节炎进程，同时他们也指出MMP-13表达水平的改变可能与OPN基因敲除后引发其他机制发生而间接导致有关。该结论与本研究结果相反，我们认为可能与观察的实验模型不同有关[16]；或OPN本身处于复杂的分子调控网络中，在不同条件下可表达不同甚至相反的功效，因此需要更深入研究明确。
综上述，OPN可上调人膝骨关节软骨细胞MMP-13表达，进而可能影响Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成与分解代谢，促使软骨细胞外基质降解，加速骨关节炎关节软骨退变。同时OPN对MMP-13的调节具有时间及浓度依赖性，干预的最佳处理浓度和时间分别为1 μg/mL以及48 h，这为今后细胞实验中OPN干预提供了数据支持。然而，关于OPN调控MMP-13的具体机制仍不清楚，是否类似于类风湿性关节炎、肿瘤疾病，存在NF-κB、MAPK等通路激活，将是下一步研究重点。
