引用本文： 赵荣兰, 彭效祥, 楚海荣, 宋伟, 刘庆. 可磷酸化短肽偶联壳聚糖介导兔关节软骨损伤修复的基因治疗. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(11): 1346-1352. doi: 10.7507/1002-1892.20140292 复制
成熟关节软骨损伤后自身修复能力有限，如何最大限度的诱导和激发关节软骨细胞的自身修复潜能是目前面临的挑战，采用局部转基因治疗关节软骨损伤备受关注[1-3]。基因载体的选择与治疗效果密切相关，壳聚糖（chitosan，CS）作为非病毒基因载体获得广泛研究[4-6]，其携载治疗基因或siRNA的纳米粒复合物，已被用于体内和体外转染哺乳动物细胞相关研究[7-10]。但目前研究显示，CS/质粒DNA（pDNA）纳米粒转染效率较低，限制了其作为基因治疗载体的应用[11]。前期实验中我们用未经修饰的CS携载IGF-1基因治疗兔软骨损伤，取得了一定效果[12]，但转染效率相对较低。之后我们使用基序为LLLRRRDNEY*FY*VRRLL的可磷酸化短肽（phosphorylatable short peptide，pSP）偶联CS（pSP-CS），由于短肽中含有两个可被JaK2蛋白激酶磷酸化的酪氨酸残基（*标记处），pSP-CS/pDNA进入多种细胞系后通过短肽的磷酸化促进了外源基因在细胞内与CS的解离，从而大大提高了pSP-CS/pDNA复合物的转染效率[13]。本研究以pSP-CS作为关节软骨损伤基因治疗的载体，携载软骨退变有效拮抗剂抗炎性因子IL-1受体拮抗剂（IL-1 receptor antagonist，IL-1Ra）[14]和促进软骨合成代谢的IGF-1基因[15]，直接注射至兔关节腔内，观察pSP-CS能否将两基因成功转入体内并高效表达，实现两基因在局部协同促进损伤软骨修复的目的，为下一步临床应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
3月龄健康雄性新西兰大耳白兔30只，体重2.0～2.5 kg，购于山东鲁抗医药股份有限公司动物中心。
大肠杆菌菌株E.coli.DH5α、pBudCE4.1真核表达质粒均为本实验室保存；T4DNA连接酶、限制性内切酶、逆转录酶（M-MLV）、Taq DNA聚合酶、dNTPs、实时定量PCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；博莱霉素、CS（Invitrogen公司，美国）；BCA蛋白测定试剂盒（Pierce公司，美国）；人IGF-1 ELISA检测试剂盒（R & D公司，美国）；人IL-1Ra ELISA检测试剂盒（eBiosciene公司，美国）；抗体、免疫组织化学检测试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）；阿尔辛蓝-过碘酸雪夫（alcian blue-periodic acid/schiff，AB-PAS）染液（南京建成生物工程研究所）。
PCR扩增仪、酶标仪、荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司，美国）；GeneQuant100微量分光光度计（Biochrom公司，英国）；Image-Pro Plus图像分析软件（Media Cybernetics公司，美国）。
1.2 实验方法
1.2.1 IL-1Ra与IGF-1真核表达载体的构建
分离正常志愿者外周血淋巴细胞，TRIzol法提取总RNA，逆转录cDNA。以此cDNA为模板，PCR扩增含信号肽的IL-1Ra全部编码序列：上游，5'-CCC
1.2.2 pSP-CS/pDNA复合物的制备
由北京奥科生物技术有限公司合成基序为LLLRRRDNEY*FY*VRRLL的pSP。按照文献[13]方法以pSP偶联CS形成pSP-CS，将pBudCE4.1空载体及1.2.1中制备的各重组质粒与pSP-CS分别按质量比1:1.5混合，制备pSP-CS/pBudCE4.1、pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra、pSP-CS/pBudCE4.1-IGF-1与pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra + IGF-1复合物。
1.2.3 实验分组
将30只大耳白兔双后肢随机分为5组（n=12），分别为假手术组（A组）、pSP-CS/pBudCE4.1干预组（B组）、pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra干预组（C组）、pSP-CS/pBudCE4.1-IGF-1干预组（D组）、pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra + IGF-1干预组（E组）。以20%乌拉坦（5 mL/kg）耳缘静脉注射麻醉后，无菌条件下，作双膝髌旁外侧长约2 cm的纵切口，暴露股骨外侧髁关节面。A组不做任何处理，直接缝合切口；B、C、D、E组用手术钻制备直径4 mm、深3 mm的全层软骨缺损，以见少许新鲜血液渗出为度，制备膝关节外侧髁软骨缺损模型，生理盐水冲洗关节腔，逐层关闭。术后连续5 d肌肉注射青霉素40万U。术后分笼饲养，正常活动。结合前期研究结果及相关参考文献[2, 12, 17-18]，术后1周各干预组给予对应pSP-CS/pDNA复合物，每周2次，共7周；每只每次pDNA剂量为15 μg，用生理盐水调节至0.5 mL直接关节腔内注射。A组注射等量生理盐水。术后8周同上法麻醉后处死全部实验动物进行观察。
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
观察动物术后存活、切口愈合情况，膝关节活动范围及步态恢复情况。
1.3.2 ELISA检测
动物处死后用1 mL生理盐水灌洗膝关节腔，收集灌洗液。4℃以离心半径8.3 cm，5 000 r/min离心10 min。取上清液，参照人IL-1Ra、IGF-1 ELISA检测试剂盒说明进行操作，检测IL-1Ra及IGF-1含量。
1.3.3 实时荧光定量PCR检测
膝关节腔冲洗后，暴露关节面，刮取损伤区周围软骨标本（n=6），置于RNA提取试剂TRIzol中，用于检测聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、基质金属蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3，MMP-3）、MMP抑制剂1（MMP inhibitor 1，TIMP-1）mRNA表达。首先TRIzol法提取软骨组织总RNA，逆转录得到cDNA。对Aggrecan、MMP-3、TIMP-1及内参基因β2-微球蛋白（β2-microglobulin，B2M）进行PCR扩增：95℃预变性5 min；94℃40 s、62℃30 s、72℃20 s，35个循环，72℃延伸5 min。PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定并进行DNA序列分析，目的基因引物序列及扩增产物大小见表 1。对各cDNA样本进行实时荧光定量PCR分析，反应体系20µL：SYBY Green Mix 10.0 µL、cDNA模板1.0µL、上、下游引物（10 pmol/µL）各0.9 µL、灭菌双蒸水7.2µL。反应条件：95℃预变性30 s；95℃5 s、62℃20 s、72℃20 s，35个循环。温度变化速度为20℃/s，计算Aggrecan、MMP-3、TIMP-1及B2M基因的Ct值，以2-ΔΔCt计算基因相对表达量[19]。
表1
目的基因引物序列及扩增产物大小
Table1.
Primer sequence and PCR product size
1.3.4 组织学及免疫组织化学染色观察
完整切取剩余膝关节损伤区标本（n=6），置于10%中性甲醛溶液固定24 h，脱钙后石蜡包埋，4μm厚连续切片。切片分别行软骨蛋白多糖的AB-PAS特异性染色，其中AB阳性染色为蓝色，PAS为紫红色[20]；Aggrecan免疫组织化学染色，阳性染色呈棕褐色。于400倍镜下，每组各取6张切片，使用Image-Pro Plus图像分析软件分析Aggrecan染色吸光度（A）值。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
实验兔术后无感染及死亡。2只实验兔B组侧关节活动受限，持续跛行3周后恢复；其余各组7 d内关节活动基本恢复正常，膝关节活动范围较术前无明显改变。
2.2 ELISA检测
关节腔灌洗液中A组IGF-1含量与B、C组相似，组间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。D、E组IGF-1含量明显高于上述3组，差异有统计学意义（P < 0.05）；D、E组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 1 a。
关节腔灌洗液中A组IL-1Ra含量与B、D组相似，组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。C、E组IL-1Ra含量明显高于上述3组，差异有统计学意义（P < 0.05）；C、E组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 1 b。
图1
ELISA检测各组IGF-1及IL-1Ra含量ⓐ IGF-1 ⓑ IL-1Ra 图 2 实时荧光定量PCR检测Aggrecan、MMP-3和TIMP-1 mRNA表达ⓐ Aggrecan ⓑ MMP-3 ⓒ TIMP-1 图 3 各组Aggrecan免疫组织化学染色A值
Figure1.
The concentrations of IGF-1 and IL-1Ra in each group by ELISA ⓐ IGF-1 ⓑ IL-1Ra Fig.2 Aggrecan, MMP-3, and TIMP-1 mRNA expressions in each group by real-time fluorescent quantitative PCR detection ⓐ Aggrecan ⓑ MMP-3 ⓒ TIMP-1 Fig.3 The absorbance values of Aggrecan staining in each group
2.3 实时荧光定量PCR检测
各干预组Aggrecan mRNA相对表达量E组 > D组 > C组 > B组，组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。除B组与A组比较差异无统计学意义（P > 0.05）；其余各组与A组比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 2 a。
各组MMP-3 mRNA相对表达量B组 > D组 > C组 > E组 > A组，组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 2 b。
各组TIMP-1 mRNA相对表达量E组 > C组 > D组 > B组 > A组，组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 2 c。
2.4 组织学及免疫组织化学染色观察
各组Aggrecan染色A值E组 > A组 > D组 > C组 > B组，组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 3。镜下见，A组Aggrecan及AB-PAS染色均为强阳性，软骨细胞排列规则，呈柱状，软骨陷窝明显；B组Aggrecan和AB-PAS染色呈阴性，缺损区主要为炎性细胞浸润和纤维组织增生，未见明显软骨性修复；C、D组Aggrecan和AB-PAS染色呈阳性，部分缺损区出现新生软骨修复，软骨陷窝形成，但新生软骨排列较紊乱，其中C组炎性细胞浸润明显少于D组；E组Aggrecan和AB-PAS染色呈强阳性，缺损区基本被新生软骨填充，软骨陷窝形成，排列接近柱状，明显优于C、D组（图 4、5）。
图4
各组AB-PAS染色观察ⓐ A组（×40）ⓑ B组（×40）ⓒ C组（×40）ⓓ D组（×40）ⓔ E组（×40）ⓕ A组（×400）ⓖ B组（×400）ⓗ C组（×400）ⓘ D组（×400）ⓙ E组（×400） 图 5 各组Aggrecan免疫组织化学染色观察ⓐ A组（×40）ⓑ B组（×40）ⓒ C组（×40）ⓓ D组（×40）ⓔ E组（×40）ⓕ A组（×400）ⓖ B组（×400）ⓗ C组（×400）ⓘ D组（×400）ⓙ E组（×400）
Figure4.
AB-PAS staining in each group ⓐ Group A (×40) ⓑ Group B (×40) ⓒ Group C (×40) ⓓ Group D (×40) ⓔ Group E (×40) ⓕ Group A (×400) ⓖ Group B (×400) ⓗ Group C (×400) ⓘ Group D (×400) ⓙ Group E (×400) Fig.5 Immunohistochemical staining for Aggrecan in each group ⓐ Group A (×40) ⓑ Group B (×40) ⓒ Group C (×40) ⓓ Group D (×40) ⓔ Group E (×40) ⓕ Group A (×400) ⓖ Group B (×400) ⓗ Group C (×400) ⓘ Group D (×400) ⓙ Group E (×400)
3 讨论
本研究构建了含有IL-1Ra和IGF-1基因的pBudCE4.1真核共表达质粒，pBudCE4.1含有人巨细胞病毒和人延伸因子1α亚单位两个独立的启动子，可以同时、独立的表达两个基因[21]。ELISA检测结果显示各干预组关节腔灌洗液中含有大量外源蛋白IL-1Ra和IGF-1，E组IL-1Ra和IGF-1含量分别与C、D组相同，差异无统计学意义。提示pSP-CS/pDNA复合物可以将IL-1Ra和IGF-1基因有效转入细胞内，并实现外源基因的局部、高效、同步表达；大大减小了后续研究两基因协同作用时，由于两基因转染效率不一致所出现的偏倚。
Aggrecan是关节软骨细胞外基质中蛋白多糖的主要形式之一，受损软骨修复时蛋白多糖表达量明显增加，因此蛋白多糖常被用作软骨形成的特异性指标之一[22]。本研究显示在促进Aggrecan表达方面无论在基因或蛋白水平，D组作用均优于C组，提示在促进软骨合成代谢作用上IGF-1强于IL-1Ra；同时E组作用明显优于C、D组，提示两基因在上调Aggrecan表达上具有协同作用。大量研究表明，MMPs在关节软骨损伤、破坏中起着重要作用[23]。其中由软骨细胞、滑膜细胞分泌的MMP-3，对关节软骨基质中的蛋白多糖降解起重要作用[24]。TIMP-1为MMP-3的天然抑制物，正常条件下，MMPs与TIMPs之间相互抑制，维持关节内环境的平衡。当软骨出现损伤、破坏时，MMPs升高，TIMPs也随之升高[25]。本研究显示，软骨缺损术后，B组损伤导致MMP-3表达水平显著升高，同时带动TIMP-1轻度增加，与相关报道结果一致[25]。C组下调MMP-3表达和上调TIMP-1表达作用明显优于D组，提示在抑制软骨基质降解作用上IL-1Ra强于IGF-1；同时上述作用E组明显优于C、D组，提示两基因在调节MMP-3和TIMP-1表达时存在协同作用；组织学观察结果进一步证实，D组在促进软骨基质合成及细胞增殖上优于C组；而C组在抑制炎性反应及软骨基质降解上优于D组；E组由于IL-1Ra和IGF-1协同作用，使软骨基质分解代谢被抑制，合成代谢被增强，明显促进了损伤软骨的修复，使软骨缺损处完全被较成熟的新生软骨所填充，形态接近周围正常软骨。
综上述，pSP-CS可携带外源基因IL-1Ra和IGF-1进入兔体内并在局部高效表达，是软骨损伤基因治疗中较理想的基因载体；IL-1Ra和IGF-1两基因协同作用时软骨损伤修复效果明显优于IL-1Ra或IGF-1单基因作用，为多基因联合治疗软骨损伤奠定了实验基础。
成熟关节软骨损伤后自身修复能力有限，如何最大限度的诱导和激发关节软骨细胞的自身修复潜能是目前面临的挑战，采用局部转基因治疗关节软骨损伤备受关注[1-3]。基因载体的选择与治疗效果密切相关，壳聚糖（chitosan，CS）作为非病毒基因载体获得广泛研究[4-6]，其携载治疗基因或siRNA的纳米粒复合物，已被用于体内和体外转染哺乳动物细胞相关研究[7-10]。但目前研究显示，CS/质粒DNA（pDNA）纳米粒转染效率较低，限制了其作为基因治疗载体的应用[11]。前期实验中我们用未经修饰的CS携载IGF-1基因治疗兔软骨损伤，取得了一定效果[12]，但转染效率相对较低。之后我们使用基序为LLLRRRDNEY*FY*VRRLL的可磷酸化短肽（phosphorylatable short peptide，pSP）偶联CS（pSP-CS），由于短肽中含有两个可被JaK2蛋白激酶磷酸化的酪氨酸残基（*标记处），pSP-CS/pDNA进入多种细胞系后通过短肽的磷酸化促进了外源基因在细胞内与CS的解离，从而大大提高了pSP-CS/pDNA复合物的转染效率[13]。本研究以pSP-CS作为关节软骨损伤基因治疗的载体，携载软骨退变有效拮抗剂抗炎性因子IL-1受体拮抗剂（IL-1 receptor antagonist，IL-1Ra）[14]和促进软骨合成代谢的IGF-1基因[15]，直接注射至兔关节腔内，观察pSP-CS能否将两基因成功转入体内并高效表达，实现两基因在局部协同促进损伤软骨修复的目的，为下一步临床应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
3月龄健康雄性新西兰大耳白兔30只，体重2.0～2.5 kg，购于山东鲁抗医药股份有限公司动物中心。
大肠杆菌菌株E.coli.DH5α、pBudCE4.1真核表达质粒均为本实验室保存；T4DNA连接酶、限制性内切酶、逆转录酶（M-MLV）、Taq DNA聚合酶、dNTPs、实时定量PCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；博莱霉素、CS（Invitrogen公司，美国）；BCA蛋白测定试剂盒（Pierce公司，美国）；人IGF-1 ELISA检测试剂盒（R & D公司，美国）；人IL-1Ra ELISA检测试剂盒（eBiosciene公司，美国）；抗体、免疫组织化学检测试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）；阿尔辛蓝-过碘酸雪夫（alcian blue-periodic acid/schiff，AB-PAS）染液（南京建成生物工程研究所）。
PCR扩增仪、酶标仪、荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司，美国）；GeneQuant100微量分光光度计（Biochrom公司，英国）；Image-Pro Plus图像分析软件（Media Cybernetics公司，美国）。
1.2 实验方法
1.2.1 IL-1Ra与IGF-1真核表达载体的构建
分离正常志愿者外周血淋巴细胞，TRIzol法提取总RNA，逆转录cDNA。以此cDNA为模板，PCR扩增含信号肽的IL-1Ra全部编码序列：上游，5'-CCC
1.2.2 pSP-CS/pDNA复合物的制备
由北京奥科生物技术有限公司合成基序为LLLRRRDNEY*FY*VRRLL的pSP。按照文献[13]方法以pSP偶联CS形成pSP-CS，将pBudCE4.1空载体及1.2.1中制备的各重组质粒与pSP-CS分别按质量比1:1.5混合，制备pSP-CS/pBudCE4.1、pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra、pSP-CS/pBudCE4.1-IGF-1与pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra + IGF-1复合物。
1.2.3 实验分组
将30只大耳白兔双后肢随机分为5组（n=12），分别为假手术组（A组）、pSP-CS/pBudCE4.1干预组（B组）、pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra干预组（C组）、pSP-CS/pBudCE4.1-IGF-1干预组（D组）、pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra + IGF-1干预组（E组）。以20%乌拉坦（5 mL/kg）耳缘静脉注射麻醉后，无菌条件下，作双膝髌旁外侧长约2 cm的纵切口，暴露股骨外侧髁关节面。A组不做任何处理，直接缝合切口；B、C、D、E组用手术钻制备直径4 mm、深3 mm的全层软骨缺损，以见少许新鲜血液渗出为度，制备膝关节外侧髁软骨缺损模型，生理盐水冲洗关节腔，逐层关闭。术后连续5 d肌肉注射青霉素40万U。术后分笼饲养，正常活动。结合前期研究结果及相关参考文献[2, 12, 17-18]，术后1周各干预组给予对应pSP-CS/pDNA复合物，每周2次，共7周；每只每次pDNA剂量为15 μg，用生理盐水调节至0.5 mL直接关节腔内注射。A组注射等量生理盐水。术后8周同上法麻醉后处死全部实验动物进行观察。
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
观察动物术后存活、切口愈合情况，膝关节活动范围及步态恢复情况。
1.3.2 ELISA检测
动物处死后用1 mL生理盐水灌洗膝关节腔，收集灌洗液。4℃以离心半径8.3 cm，5 000 r/min离心10 min。取上清液，参照人IL-1Ra、IGF-1 ELISA检测试剂盒说明进行操作，检测IL-1Ra及IGF-1含量。
1.3.3 实时荧光定量PCR检测
膝关节腔冲洗后，暴露关节面，刮取损伤区周围软骨标本（n=6），置于RNA提取试剂TRIzol中，用于检测聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、基质金属蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3，MMP-3）、MMP抑制剂1（MMP inhibitor 1，TIMP-1）mRNA表达。首先TRIzol法提取软骨组织总RNA，逆转录得到cDNA。对Aggrecan、MMP-3、TIMP-1及内参基因β2-微球蛋白（β2-microglobulin，B2M）进行PCR扩增：95℃预变性5 min；94℃40 s、62℃30 s、72℃20 s，35个循环，72℃延伸5 min。PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定并进行DNA序列分析，目的基因引物序列及扩增产物大小见表 1。对各cDNA样本进行实时荧光定量PCR分析，反应体系20µL：SYBY Green Mix 10.0 µL、cDNA模板1.0µL、上、下游引物（10 pmol/µL）各0.9 µL、灭菌双蒸水7.2µL。反应条件：95℃预变性30 s；95℃5 s、62℃20 s、72℃20 s，35个循环。温度变化速度为20℃/s，计算Aggrecan、MMP-3、TIMP-1及B2M基因的Ct值，以2-ΔΔCt计算基因相对表达量[19]。
表1
目的基因引物序列及扩增产物大小
Table1.
Primer sequence and PCR product size
1.3.4 组织学及免疫组织化学染色观察
完整切取剩余膝关节损伤区标本（n=6），置于10%中性甲醛溶液固定24 h，脱钙后石蜡包埋，4μm厚连续切片。切片分别行软骨蛋白多糖的AB-PAS特异性染色，其中AB阳性染色为蓝色，PAS为紫红色[20]；Aggrecan免疫组织化学染色，阳性染色呈棕褐色。于400倍镜下，每组各取6张切片，使用Image-Pro Plus图像分析软件分析Aggrecan染色吸光度（A）值。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
实验兔术后无感染及死亡。2只实验兔B组侧关节活动受限，持续跛行3周后恢复；其余各组7 d内关节活动基本恢复正常，膝关节活动范围较术前无明显改变。
2.2 ELISA检测
关节腔灌洗液中A组IGF-1含量与B、C组相似，组间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。D、E组IGF-1含量明显高于上述3组，差异有统计学意义（P < 0.05）；D、E组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 1 a。
关节腔灌洗液中A组IL-1Ra含量与B、D组相似，组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。C、E组IL-1Ra含量明显高于上述3组，差异有统计学意义（P < 0.05）；C、E组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 1 b。
图1
ELISA检测各组IGF-1及IL-1Ra含量ⓐ IGF-1 ⓑ IL-1Ra 图 2 实时荧光定量PCR检测Aggrecan、MMP-3和TIMP-1 mRNA表达ⓐ Aggrecan ⓑ MMP-3 ⓒ TIMP-1 图 3 各组Aggrecan免疫组织化学染色A值
Figure1.
The concentrations of IGF-1 and IL-1Ra in each group by ELISA ⓐ IGF-1 ⓑ IL-1Ra Fig.2 Aggrecan, MMP-3, and TIMP-1 mRNA expressions in each group by real-time fluorescent quantitative PCR detection ⓐ Aggrecan ⓑ MMP-3 ⓒ TIMP-1 Fig.3 The absorbance values of Aggrecan staining in each group
2.3 实时荧光定量PCR检测
各干预组Aggrecan mRNA相对表达量E组 > D组 > C组 > B组，组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。除B组与A组比较差异无统计学意义（P > 0.05）；其余各组与A组比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 2 a。
各组MMP-3 mRNA相对表达量B组 > D组 > C组 > E组 > A组，组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 2 b。
各组TIMP-1 mRNA相对表达量E组 > C组 > D组 > B组 > A组，组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 2 c。
2.4 组织学及免疫组织化学染色观察
各组Aggrecan染色A值E组 > A组 > D组 > C组 > B组，组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 3。镜下见，A组Aggrecan及AB-PAS染色均为强阳性，软骨细胞排列规则，呈柱状，软骨陷窝明显；B组Aggrecan和AB-PAS染色呈阴性，缺损区主要为炎性细胞浸润和纤维组织增生，未见明显软骨性修复；C、D组Aggrecan和AB-PAS染色呈阳性，部分缺损区出现新生软骨修复，软骨陷窝形成，但新生软骨排列较紊乱，其中C组炎性细胞浸润明显少于D组；E组Aggrecan和AB-PAS染色呈强阳性，缺损区基本被新生软骨填充，软骨陷窝形成，排列接近柱状，明显优于C、D组（图 4、5）。
图4
各组AB-PAS染色观察ⓐ A组（×40）ⓑ B组（×40）ⓒ C组（×40）ⓓ D组（×40）ⓔ E组（×40）ⓕ A组（×400）ⓖ B组（×400）ⓗ C组（×400）ⓘ D组（×400）ⓙ E组（×400） 图 5 各组Aggrecan免疫组织化学染色观察ⓐ A组（×40）ⓑ B组（×40）ⓒ C组（×40）ⓓ D组（×40）ⓔ E组（×40）ⓕ A组（×400）ⓖ B组（×400）ⓗ C组（×400）ⓘ D组（×400）ⓙ E组（×400）
Figure4.
AB-PAS staining in each group ⓐ Group A (×40) ⓑ Group B (×40) ⓒ Group C (×40) ⓓ Group D (×40) ⓔ Group E (×40) ⓕ Group A (×400) ⓖ Group B (×400) ⓗ Group C (×400) ⓘ Group D (×400) ⓙ Group E (×400) Fig.5 Immunohistochemical staining for Aggrecan in each group ⓐ Group A (×40) ⓑ Group B (×40) ⓒ Group C (×40) ⓓ Group D (×40) ⓔ Group E (×40) ⓕ Group A (×400) ⓖ Group B (×400) ⓗ Group C (×400) ⓘ Group D (×400) ⓙ Group E (×400)
3 讨论
本研究构建了含有IL-1Ra和IGF-1基因的pBudCE4.1真核共表达质粒，pBudCE4.1含有人巨细胞病毒和人延伸因子1α亚单位两个独立的启动子，可以同时、独立的表达两个基因[21]。ELISA检测结果显示各干预组关节腔灌洗液中含有大量外源蛋白IL-1Ra和IGF-1，E组IL-1Ra和IGF-1含量分别与C、D组相同，差异无统计学意义。提示pSP-CS/pDNA复合物可以将IL-1Ra和IGF-1基因有效转入细胞内，并实现外源基因的局部、高效、同步表达；大大减小了后续研究两基因协同作用时，由于两基因转染效率不一致所出现的偏倚。
Aggrecan是关节软骨细胞外基质中蛋白多糖的主要形式之一，受损软骨修复时蛋白多糖表达量明显增加，因此蛋白多糖常被用作软骨形成的特异性指标之一[22]。本研究显示在促进Aggrecan表达方面无论在基因或蛋白水平，D组作用均优于C组，提示在促进软骨合成代谢作用上IGF-1强于IL-1Ra；同时E组作用明显优于C、D组，提示两基因在上调Aggrecan表达上具有协同作用。大量研究表明，MMPs在关节软骨损伤、破坏中起着重要作用[23]。其中由软骨细胞、滑膜细胞分泌的MMP-3，对关节软骨基质中的蛋白多糖降解起重要作用[24]。TIMP-1为MMP-3的天然抑制物，正常条件下，MMPs与TIMPs之间相互抑制，维持关节内环境的平衡。当软骨出现损伤、破坏时，MMPs升高，TIMPs也随之升高[25]。本研究显示，软骨缺损术后，B组损伤导致MMP-3表达水平显著升高，同时带动TIMP-1轻度增加，与相关报道结果一致[25]。C组下调MMP-3表达和上调TIMP-1表达作用明显优于D组，提示在抑制软骨基质降解作用上IL-1Ra强于IGF-1；同时上述作用E组明显优于C、D组，提示两基因在调节MMP-3和TIMP-1表达时存在协同作用；组织学观察结果进一步证实，D组在促进软骨基质合成及细胞增殖上优于C组；而C组在抑制炎性反应及软骨基质降解上优于D组；E组由于IL-1Ra和IGF-1协同作用，使软骨基质分解代谢被抑制，合成代谢被增强，明显促进了损伤软骨的修复，使软骨缺损处完全被较成熟的新生软骨所填充，形态接近周围正常软骨。
综上述，pSP-CS可携带外源基因IL-1Ra和IGF-1进入兔体内并在局部高效表达，是软骨损伤基因治疗中较理想的基因载体；IL-1Ra和IGF-1两基因协同作用时软骨损伤修复效果明显优于IL-1Ra或IGF-1单基因作用，为多基因联合治疗软骨损伤奠定了实验基础。
