引用本文： 孙舒瑶, 王椿, 冉兴无. 微小RNA在糖尿病创面愈合中的研究进展. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(11): 1431-1434. doi: 10.7507/1002-1892.20140308 复制
糖尿病患者创面常迁延不愈，治疗困难，费用高，是糖尿病最具威胁性的慢性并发症，也是致残、致死的主要原因。导致创面迁延不愈的因素较多，包括生长因子合成减少、血管新生降低、巨噬细胞减少及功能受损、胶原沉积减少、新生肉芽组织减少、角质细胞和成纤维细胞迁移以及增殖减弱等[1]。
微小RNA（microRNA，miRNA）是近年发现的一种重要调控因子，主要作用于转录后水平的调控[2]，它是内源性基因编码、长度约为22个核苷酸分子的非编码单链小分子RNA。研究表明，miRNA是多种生理及病理过程的主要参与者，与细胞生长、变异、迁移、凋亡、血管新生、致癌作用等有关，调节异常可引起一系列疾病[3-6]。创面愈合是一种涉及多种细胞及分子的复杂过程，主要包括炎症期、增生期和重塑期3个阶段。miRNA在皮肤形成及创面愈合过程中起调控作用[7-8]，其表达紊乱会影响创面愈合。目前已有研究发现糖尿病患者体内存在多种表达异常的miRNA，本文就其中部分miRNA在糖尿病患者创面愈合各期中的研究进展作一综述。
1 炎症期相关miRNA
越来越多的证据显示糖尿病慢性创面与炎症基因表达持续上调有密切关系[9]，包括抑制及促进炎性反应两方面。
miRNA-146是首个被发现在免疫系统中有调节作用的RNA，它与自身免疫性疾病、炎性反应、肿瘤等密切相关[10-13]。miRNA-146家族包括miRNA-146a及miRNA-146b，两者基因分别位于人第5号染色体及第10号染色体，它们的成熟序列仅相差2个碱基。目前对miRNA-146a的研究较多。miRNA-146a的启动子上游有NF-κB的结合位点，脂多糖、TNF-α、IL-1等可经NF-κB诱导miRNA-146a的表达[14]。miRNA-146a通过直接下调Toll样受体及IL-1b通路上的两个关键分子—TNF受体相关因子6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）和IL-1受体相关激酶1，减少IL-1、IL-6及TNF-α的释放，负调控炎性反应及免疫反应[14-15]。Xu等[16]的研究显示与正常大鼠相比，糖尿病大鼠miRNA-146a表达无明显差异；但当溃疡形成后，糖尿病大鼠溃疡局部miRNA-146a的表达明显下调，提示miRNA-146a表达下调可能导致糖尿病皮肤溃疡的慢性炎症。研究表明，miRNA-146a过表达后可以通过TRAF6、IL-1受体相关激酶1抑制MyD88信号通路诱导免疫耐受[17]。而糖尿病创面局部miRNA-146a表达下调，会造成局部炎性细胞持续高反应，引起过度炎性刺激。另外，熊玮等[18]的体外研究发现，miRNA-146a可以促进血管平滑肌细胞的增殖及迁移，其作用可能与促进NF-κB p65的表达、诱导炎症有关。
miRNA-155是大多数炎性介质的作用靶点，TNF-α、聚肌苷酸（聚）胞苷酸、IFN-β均可诱导miRNA-155上调，而升高的miRNA-155可以降低基质金属蛋白酶的表达，基质金属蛋白酶可介导炎症对组织的损伤，提示miRNA-155可能是一种保护性的miRNA[10]。同时也有研究报道，IL-10可以抑制miRNA-155的转录，解除miRNA-155对SHIP1（src homology-2 domain-containing inositol 5-phosphatase 1）基因的抑制，使磷脂酰肌醇三磷酸转变为无活性的磷脂酰肌醇双磷酸，发挥抗炎作用[19]。Kishore等[20]将小鼠心肌成纤维细胞暴露于正常血糖及高血糖环境中，24 h后发现高血糖环境下miRNA-155明显上调。
有研究表明高血糖可以上调血管平滑肌细胞上的miRNA-125b[21]。miRNA-125b的作用靶点是Suv39h1，可诱导Suv39h1降低，导致炎性因子（如IL-6、单核细胞趋化蛋白1）表达升高，以及促进单核细胞黏附于血管平滑肌细胞上。另外，miRNA-125b还可与TNF-αmRNA的3’UTR结合抑制其翻译[22]，TNF-α是重要的炎性因子，在组织重塑及炎症的产生及维持中均有重要作用，miRNA-125b对于局部炎性反应的总体调控作用需进一步研究。
2 增生期相关miRNA
有研究通过Dicer敲除小鼠模型证实miRNA在血管新生中的作用[23]；此后，大量研究关注于miRNA对血管新生的影响。
2.1 促进血管新生
miRNA-126为内皮细胞特异性miRNA，其作用靶点是VEGF信号通路中的两个负调控因子——萌芽相关蛋白1及3-磷酸激酶调节蛋白2。实验发现，大鼠缺乏miRNA-126即表现出血管渗漏、出血，提示miRNA-126在维持血管内皮功能稳定、血管壁完整、血管新生及创面愈合中发挥重要作用，被认为是内皮细胞特异性的血管生成调节因子[24]。Zampetaki等[25]研究发现糖尿病患者组织中miRNA-126的表达受到明显抑制，且内皮凋亡小体中miRNA-126的含量呈葡萄糖依赖性，并成负相关。
大多数糖尿病慢性创面存在微循环障碍，低灌注造成组织局部缺氧。miRNA-210是一类对缺氧很敏感的miRNA。低氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）是低氧传感机制和调节转录的一个核心因子，而miRNA-210是HIF的一个稳定靶点，低氧状态下HIF-1α发生稳定化，从而诱导miRNA-210上调[26-29]。miRNA-210的直接作用靶点是Ephrin-A3 [26]，Ephrin家族是VEGF信号通路调节血管新生过程的重要组成分子，miRNA-210可以通过下调Ephrin-A3的蛋白表达，促进血管新生。另外miRNA-210表达升高，还可抑制转录因子E2F3，影响角质细胞增殖，阻碍缺血性创面的愈合[27, 30]。
miRNA-93的作用靶点是VEGF-A，高血糖状态下内皮细胞中miRNA-93的表达明显下调，VEGF-A的表达亦明显下调[31]，提示miRNA可以正向调控VEGF-A的表达。氧化还原状态是刺激血管新生的重要因素，Roy等[32]首次提出miRNA可以通过微血管内皮细胞中的NADPH氧化酶调节细胞的氧化还原状态。
2.2 抑制血管新生
miRNA-320的目标靶点包括多种生长因子（如VEGF、FGF、IGF-1）及其受体。Wang等[33]的研究发现，糖尿病心肌微血管内皮细胞中miRNA-320呈高表达，通过转染miRNA-320的抑制剂至GK小鼠心肌微血管内皮细胞上，可改善心肌细胞的增殖及迁移，还可增加IGF-1的表达，后者可促进血管新生。由此可见，高表达的miRNA-320在糖尿病患者创面局部血管新生障碍中也发挥一定作用。
miRNA-503能抑制血管新生，其作用靶点主要是细胞周期调节物cdc25A及细胞周期素E1。研究显示，与非糖尿病/非下肢缺血的正常对照组相比，糖尿病组患者下肢缺血的肌肉以及内皮细胞中miRNA-503均为高表达[34]。体外及动物实验证实，在高血糖及缺氧的条件下，内皮细胞上的miRNA-503表达上调[34]。通过诱导或反义寡核苷酸阻遏miRNA-503后，可以改善内皮细胞的功能。
miRNA-221/222在人脐静脉内皮细胞高表达，其靶点为c-kit。c-kit是干细胞因子的酪氨酸激酶受体，可以促进内皮细胞迁移及毛细血管形成[35]。miRNA-221/222通过抑制c-kit，抑制血管新生。Li等[36]研究了miRNA-221在糖尿病诱导的内皮功能紊乱中的作用，发现miRNA-221高表达，c-kit低表达，进一步明确了c-kit为miRNA-221/222的作用靶点。Togliatto等[37]观察了miRNA-221/222在高血糖及高糖化终产物介导的血管损害中的作用，发现高血糖及高糖化终产物可通过下调miRNA-221/222，使miRNA-221/222对细胞周期激酶抑制蛋白P27KIP1及P57KIP2的抑制作用减弱，从而损害内皮细胞及内皮祖细胞，影响血管新生。提示miRNA-221/222直接参与了高血糖及高糖化终产物相关性细胞周期的改变。
miRNA-200b可以直接作用于微血管内皮细胞上的Ets-1，还可以使Ets-1的相关基因沉默，包括基质金属蛋白酶1及VEGF受体2。低氧及HIF-1α稳定化均可以抑制miRNA-200b表达[32]。McArthur等[38]提出在糖尿病鼠的视网膜中miRNA-200b表达下调，同时VEGF-A表达上调，认为miRNA-200b还可以通过作用于VEGF-A发挥抑制血管新生及降低血管通透性的作用。
2.3 促进肉芽组织形成及再上皮化
miRNA-21最初被认为是一个致癌miRNA，最近研究表明其在多种细胞增殖、分化、凋亡、上皮细胞间质化及迁移中均发挥重要作用[39-40]。有研究显示，miRNA-21可以促进创面局部成纤维细胞及角质细胞的迁移[41-42]，从而促进创面的肉芽组织形成及再上皮化，加快创面愈合。miRNA-21的作用靶点是程序性细胞凋亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4），后者在血管内皮细胞中发挥促凋亡作用[43]。PDCD4还是一种促炎性蛋白，可以提高转录因子NF-κB的活性，抑制抗炎因子IL-10的产生。而IL-10缺乏是糖尿病创面局部炎性应答紊乱的重要原因[44]。细胞转染premiRNA-21后可抑制NF-κB的活性，促进IL-10产生[45]。
Madhyastha等[41]比较了糖尿病大鼠及正常大鼠的皮肤组织，发现糖尿病大鼠皮肤中miRNA-21显著高表达，然而在溃疡愈合过程中，正常对照组创面局部组织中miRNA-21表达逐渐上调，糖尿病大鼠miRNA-21表达却呈下降趋势。这一变化可能与糖尿病创面愈合延迟有关。因此，miRNA-21在糖尿病慢性创面的局部炎症、血管新生及细胞迁移方面均发挥一定作用。
3 重塑期相关miRNA
TGF-β家族因子是损伤修复及细胞外基质合成的重要调节因素[46]。研究发现，miRNA-29的异常表达与包括TGF-β在内的促纤维化细胞因子及部分生长因子有关，而miRNA-29还具有调节促纤维化细胞因子的作用。miRNA-29家族包括miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c，胶原沉积是创面重塑期的重要步骤，miRNA-29a可以直接调节胶原表达[47]，miRNA-29b及miRNA-29c可以抑制一些细胞外基质蛋白，还可抑制Smads及β-连环蛋白，后两者对创面的瘢痕愈合有重要影响[48]。目前有研究提出在糖尿病鼠体内miRNA-29家族在胰岛素靶组织肌肉、脂肪及肝脏中均呈高表达，且miRNA-29a和miRNA-29b可能与胰岛素抵抗有关[49]。但miRNA-29a的表达水平与糖尿病慢性创面间的关系尚未明确，仍需进一步研究。
4 展望
对于糖尿病创面，以上miRNA的异常表达在创面愈合过程中所起作用尚需进一步研究。糖尿病创面治疗风险大，预后欠佳，致残率及致死率均较高，进一步研究miRNA可以为足溃疡的治疗提供更多的理论及临床依据。
糖尿病患者创面常迁延不愈，治疗困难，费用高，是糖尿病最具威胁性的慢性并发症，也是致残、致死的主要原因。导致创面迁延不愈的因素较多，包括生长因子合成减少、血管新生降低、巨噬细胞减少及功能受损、胶原沉积减少、新生肉芽组织减少、角质细胞和成纤维细胞迁移以及增殖减弱等[1]。
微小RNA（microRNA，miRNA）是近年发现的一种重要调控因子，主要作用于转录后水平的调控[2]，它是内源性基因编码、长度约为22个核苷酸分子的非编码单链小分子RNA。研究表明，miRNA是多种生理及病理过程的主要参与者，与细胞生长、变异、迁移、凋亡、血管新生、致癌作用等有关，调节异常可引起一系列疾病[3-6]。创面愈合是一种涉及多种细胞及分子的复杂过程，主要包括炎症期、增生期和重塑期3个阶段。miRNA在皮肤形成及创面愈合过程中起调控作用[7-8]，其表达紊乱会影响创面愈合。目前已有研究发现糖尿病患者体内存在多种表达异常的miRNA，本文就其中部分miRNA在糖尿病患者创面愈合各期中的研究进展作一综述。
1 炎症期相关miRNA
越来越多的证据显示糖尿病慢性创面与炎症基因表达持续上调有密切关系[9]，包括抑制及促进炎性反应两方面。
miRNA-146是首个被发现在免疫系统中有调节作用的RNA，它与自身免疫性疾病、炎性反应、肿瘤等密切相关[10-13]。miRNA-146家族包括miRNA-146a及miRNA-146b，两者基因分别位于人第5号染色体及第10号染色体，它们的成熟序列仅相差2个碱基。目前对miRNA-146a的研究较多。miRNA-146a的启动子上游有NF-κB的结合位点，脂多糖、TNF-α、IL-1等可经NF-κB诱导miRNA-146a的表达[14]。miRNA-146a通过直接下调Toll样受体及IL-1b通路上的两个关键分子—TNF受体相关因子6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）和IL-1受体相关激酶1，减少IL-1、IL-6及TNF-α的释放，负调控炎性反应及免疫反应[14-15]。Xu等[16]的研究显示与正常大鼠相比，糖尿病大鼠miRNA-146a表达无明显差异；但当溃疡形成后，糖尿病大鼠溃疡局部miRNA-146a的表达明显下调，提示miRNA-146a表达下调可能导致糖尿病皮肤溃疡的慢性炎症。研究表明，miRNA-146a过表达后可以通过TRAF6、IL-1受体相关激酶1抑制MyD88信号通路诱导免疫耐受[17]。而糖尿病创面局部miRNA-146a表达下调，会造成局部炎性细胞持续高反应，引起过度炎性刺激。另外，熊玮等[18]的体外研究发现，miRNA-146a可以促进血管平滑肌细胞的增殖及迁移，其作用可能与促进NF-κB p65的表达、诱导炎症有关。
miRNA-155是大多数炎性介质的作用靶点，TNF-α、聚肌苷酸（聚）胞苷酸、IFN-β均可诱导miRNA-155上调，而升高的miRNA-155可以降低基质金属蛋白酶的表达，基质金属蛋白酶可介导炎症对组织的损伤，提示miRNA-155可能是一种保护性的miRNA[10]。同时也有研究报道，IL-10可以抑制miRNA-155的转录，解除miRNA-155对SHIP1（src homology-2 domain-containing inositol 5-phosphatase 1）基因的抑制，使磷脂酰肌醇三磷酸转变为无活性的磷脂酰肌醇双磷酸，发挥抗炎作用[19]。Kishore等[20]将小鼠心肌成纤维细胞暴露于正常血糖及高血糖环境中，24 h后发现高血糖环境下miRNA-155明显上调。
有研究表明高血糖可以上调血管平滑肌细胞上的miRNA-125b[21]。miRNA-125b的作用靶点是Suv39h1，可诱导Suv39h1降低，导致炎性因子（如IL-6、单核细胞趋化蛋白1）表达升高，以及促进单核细胞黏附于血管平滑肌细胞上。另外，miRNA-125b还可与TNF-αmRNA的3’UTR结合抑制其翻译[22]，TNF-α是重要的炎性因子，在组织重塑及炎症的产生及维持中均有重要作用，miRNA-125b对于局部炎性反应的总体调控作用需进一步研究。
2 增生期相关miRNA
有研究通过Dicer敲除小鼠模型证实miRNA在血管新生中的作用[23]；此后，大量研究关注于miRNA对血管新生的影响。
2.1 促进血管新生
miRNA-126为内皮细胞特异性miRNA，其作用靶点是VEGF信号通路中的两个负调控因子——萌芽相关蛋白1及3-磷酸激酶调节蛋白2。实验发现，大鼠缺乏miRNA-126即表现出血管渗漏、出血，提示miRNA-126在维持血管内皮功能稳定、血管壁完整、血管新生及创面愈合中发挥重要作用，被认为是内皮细胞特异性的血管生成调节因子[24]。Zampetaki等[25]研究发现糖尿病患者组织中miRNA-126的表达受到明显抑制，且内皮凋亡小体中miRNA-126的含量呈葡萄糖依赖性，并成负相关。
大多数糖尿病慢性创面存在微循环障碍，低灌注造成组织局部缺氧。miRNA-210是一类对缺氧很敏感的miRNA。低氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）是低氧传感机制和调节转录的一个核心因子，而miRNA-210是HIF的一个稳定靶点，低氧状态下HIF-1α发生稳定化，从而诱导miRNA-210上调[26-29]。miRNA-210的直接作用靶点是Ephrin-A3 [26]，Ephrin家族是VEGF信号通路调节血管新生过程的重要组成分子，miRNA-210可以通过下调Ephrin-A3的蛋白表达，促进血管新生。另外miRNA-210表达升高，还可抑制转录因子E2F3，影响角质细胞增殖，阻碍缺血性创面的愈合[27, 30]。
miRNA-93的作用靶点是VEGF-A，高血糖状态下内皮细胞中miRNA-93的表达明显下调，VEGF-A的表达亦明显下调[31]，提示miRNA可以正向调控VEGF-A的表达。氧化还原状态是刺激血管新生的重要因素，Roy等[32]首次提出miRNA可以通过微血管内皮细胞中的NADPH氧化酶调节细胞的氧化还原状态。
2.2 抑制血管新生
miRNA-320的目标靶点包括多种生长因子（如VEGF、FGF、IGF-1）及其受体。Wang等[33]的研究发现，糖尿病心肌微血管内皮细胞中miRNA-320呈高表达，通过转染miRNA-320的抑制剂至GK小鼠心肌微血管内皮细胞上，可改善心肌细胞的增殖及迁移，还可增加IGF-1的表达，后者可促进血管新生。由此可见，高表达的miRNA-320在糖尿病患者创面局部血管新生障碍中也发挥一定作用。
miRNA-503能抑制血管新生，其作用靶点主要是细胞周期调节物cdc25A及细胞周期素E1。研究显示，与非糖尿病/非下肢缺血的正常对照组相比，糖尿病组患者下肢缺血的肌肉以及内皮细胞中miRNA-503均为高表达[34]。体外及动物实验证实，在高血糖及缺氧的条件下，内皮细胞上的miRNA-503表达上调[34]。通过诱导或反义寡核苷酸阻遏miRNA-503后，可以改善内皮细胞的功能。
miRNA-221/222在人脐静脉内皮细胞高表达，其靶点为c-kit。c-kit是干细胞因子的酪氨酸激酶受体，可以促进内皮细胞迁移及毛细血管形成[35]。miRNA-221/222通过抑制c-kit，抑制血管新生。Li等[36]研究了miRNA-221在糖尿病诱导的内皮功能紊乱中的作用，发现miRNA-221高表达，c-kit低表达，进一步明确了c-kit为miRNA-221/222的作用靶点。Togliatto等[37]观察了miRNA-221/222在高血糖及高糖化终产物介导的血管损害中的作用，发现高血糖及高糖化终产物可通过下调miRNA-221/222，使miRNA-221/222对细胞周期激酶抑制蛋白P27KIP1及P57KIP2的抑制作用减弱，从而损害内皮细胞及内皮祖细胞，影响血管新生。提示miRNA-221/222直接参与了高血糖及高糖化终产物相关性细胞周期的改变。
miRNA-200b可以直接作用于微血管内皮细胞上的Ets-1，还可以使Ets-1的相关基因沉默，包括基质金属蛋白酶1及VEGF受体2。低氧及HIF-1α稳定化均可以抑制miRNA-200b表达[32]。McArthur等[38]提出在糖尿病鼠的视网膜中miRNA-200b表达下调，同时VEGF-A表达上调，认为miRNA-200b还可以通过作用于VEGF-A发挥抑制血管新生及降低血管通透性的作用。
2.3 促进肉芽组织形成及再上皮化
miRNA-21最初被认为是一个致癌miRNA，最近研究表明其在多种细胞增殖、分化、凋亡、上皮细胞间质化及迁移中均发挥重要作用[39-40]。有研究显示，miRNA-21可以促进创面局部成纤维细胞及角质细胞的迁移[41-42]，从而促进创面的肉芽组织形成及再上皮化，加快创面愈合。miRNA-21的作用靶点是程序性细胞凋亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4），后者在血管内皮细胞中发挥促凋亡作用[43]。PDCD4还是一种促炎性蛋白，可以提高转录因子NF-κB的活性，抑制抗炎因子IL-10的产生。而IL-10缺乏是糖尿病创面局部炎性应答紊乱的重要原因[44]。细胞转染premiRNA-21后可抑制NF-κB的活性，促进IL-10产生[45]。
Madhyastha等[41]比较了糖尿病大鼠及正常大鼠的皮肤组织，发现糖尿病大鼠皮肤中miRNA-21显著高表达，然而在溃疡愈合过程中，正常对照组创面局部组织中miRNA-21表达逐渐上调，糖尿病大鼠miRNA-21表达却呈下降趋势。这一变化可能与糖尿病创面愈合延迟有关。因此，miRNA-21在糖尿病慢性创面的局部炎症、血管新生及细胞迁移方面均发挥一定作用。
3 重塑期相关miRNA
TGF-β家族因子是损伤修复及细胞外基质合成的重要调节因素[46]。研究发现，miRNA-29的异常表达与包括TGF-β在内的促纤维化细胞因子及部分生长因子有关，而miRNA-29还具有调节促纤维化细胞因子的作用。miRNA-29家族包括miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c，胶原沉积是创面重塑期的重要步骤，miRNA-29a可以直接调节胶原表达[47]，miRNA-29b及miRNA-29c可以抑制一些细胞外基质蛋白，还可抑制Smads及β-连环蛋白，后两者对创面的瘢痕愈合有重要影响[48]。目前有研究提出在糖尿病鼠体内miRNA-29家族在胰岛素靶组织肌肉、脂肪及肝脏中均呈高表达，且miRNA-29a和miRNA-29b可能与胰岛素抵抗有关[49]。但miRNA-29a的表达水平与糖尿病慢性创面间的关系尚未明确，仍需进一步研究。
4 展望
对于糖尿病创面，以上miRNA的异常表达在创面愈合过程中所起作用尚需进一步研究。糖尿病创面治疗风险大，预后欠佳，致残率及致死率均较高，进一步研究miRNA可以为足溃疡的治疗提供更多的理论及临床依据。