引用本文： 徐练, 孔清泉. 调控成骨细胞分化及骨形成关键信号通路的研究进展. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(12): 1484-1489. doi: 10.7507/1002-1892.20140321 复制
成骨细胞是人体骨组织的重要组成成分，也是参与骨形成的主要功能细胞，在骨骼生长发育及骨量维持方面扮演着关键角色。它来源于具有多向分化潜能的MSCs，经细胞增殖、细胞外基质合成、成熟及矿化后最终发展成为骨细胞，从而促进骨形成及维持骨量。从分子生物学水平上看，目前已知多条信号通路参与了成骨细胞分化过程的调节，其中最重要的信号通路包括BMP-Smads、Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）、Notch、Hedgehog、FGF等。这些信号通路在调控成骨细胞分化及骨生成方面起着重要作用，一旦其中一条或数条信号通路调节受阻，都会引起成骨细胞分化异常或骨形成障碍，进而导致相应骨代谢疾病的发生，如骨质疏松症、骨硬化症等。因此，为了更好地认识和治疗这类疾患，阐明这些信号通路在调节成骨细胞分化及骨形成方面的作用机制及规律具有重要意义。现对成骨细胞分化及骨形成过程中起关键调节作用的信号通路的相关研究进展作一综述，为下一步研究奠定基础。
1 概述
成骨细胞作为骨形成的主要功能细胞，在分化成熟过程中会逐步表达如ALP、骨钙素、血清Ⅰ型前胶原C端肽等特异性标志物。同时，在此过程中也会受到一系列转录因子的调控，如Runt相关转录因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、Osterix/Sp7、β-catenin、转录激活因子4、核转录因子激活蛋白1、Smads等，它们彼此协同作用，共同参与调节成骨细胞分化及骨形成。其中，核心结合因子α1/Runx2（core binding factorα1/ Runx2，Cbfα1/Runx2）及Osterix/Sp7作为成骨特异性转录因子，在成骨细胞分化及骨形成过程中起关键调控作用[1]。因而，Runx2及Osterix也被认为是成骨分化调控网络的关键节点，参与组成该网络的各条信号通路都直接或间接作用于该节点，并最终调控其下游靶基因的表达，从而调节成骨细胞分化及骨形成[2]
2 成骨细胞分化及骨形成关键信号通路
2.1 BMP-Smads信号通路
表达或激活成骨细胞分化及骨形成的关键转录因子（如Runx2）需多条信号通路共同参与调控。其中，BMP-Smads信号通路是最重要、也是最早发现和确认的一条通路。20世纪80年代有学者首次从牛骨中分离提取了BMPs类物质，将其植入小鼠体内后成功诱导出异位成骨模型[3]。随后，BMPs被证实是TGF-β超家族中的重要成员，该家族成员还包括TGF-β、细胞活素等，其受体均为丝氨酸/苏氨酸激酶受体。TGF-β超家族通过作用于下游的信号分子（如Smads）发挥生物学功能。目前，已发现超过20种BMPs，其在胚胎发育、器官形成及细胞增殖、分化、迁移、凋亡等过程中具有广泛且重要的生物学作用[4-6]。有关BMPs，尤其是BMP-2、4、5、6、7、 9等，在MSCs成骨及成脂分化中的调节作用是目前研究热点之一[7-9]。
研究表明，在成骨分化及骨形成方面，BMPs扮演着重要角色[10]。多数学者认为BMPs是骨形态发生最早期的信号分子，对成骨细胞分化及骨形成具有特异性诱导作用[11]。分子遗传学研究表明，内源性或外源性BMPs通过结合细胞膜上特异性受体——BMP受体Ⅰ（BMP receptorⅠ，BMPR-Ⅰ）及BMPR-Ⅱ，使BMPR-Ⅰ磷酸化，再与BMPs特异作用的Smads蛋白（如Smad1、5、8）结合并使其也发生磷酸化，然后进入细胞核，继而启动并激活成骨细胞特异性转录因子（如Cbfα1/Runx2、Osterix/Sp7等），从而诱导MSCs向成骨细胞分化及骨形成[12-14]。在此过程中，BMP-Smads信号通路受多种细胞因子调控，其中Smurf蛋白最重要。该蛋白是E3连接酶中的重要成员，包括Smurf1和Smurf2，其中Smurf1是BMP-Smads信号通路负性调节因子，可介导BMPR-Ⅰ的调节，还能特异性识别和结合Runx2及Smad1，促使它们泛素化并被26S蛋白酶体识别和降解，进而负向调节BMP-Smads信号通路，从而抑制成骨细胞分化及骨形成[15]。
总之，BMP-Smads信号通路是参与调控MSCs向成骨细胞分化及骨形成的关键信号通路之一，同时其自身也受到多种细胞因子的调节，从而在生物体内形成了复杂调控网络。明确其作用机制有助于对成骨细胞分化异常或骨形成障碍性疾患有更深刻认识，为临床上治疗该类疾病提供新的治疗策略。
2.2 Wnt/β-catenin信号通路
Wnt/β-catenin信号通路在调节MSCs向成骨细胞分化及骨形成方面同样具有重要作用[16]。Wnt基因最初是由Nusse等[17]在小鼠乳腺癌病毒诱导的小鼠乳腺癌组织中分离并克隆出的一种原癌基因。迄今为止，已发现人类19种Wnt基因。其编码的Wnt蛋白家族由信号肽及23～24个位置保守的半胱氨酸残基组成，在多种组织中广泛表达，并且在进化上高度保守[18]。研究发现，Wnt信号通路参与调控许多生物学活动，有抑制脂肪形成而促进骨形成的作用，并与肿瘤发生密切相关[19]。Wnt信号通路根据是否有β-catenin参与分为经典和非经典信号通路。其中，在骨生长发育及骨代谢方面，经典Wnt信号通路（即Wnt/β-catenin通路）对成骨细胞的作用是研究热点。经典Wnt信号通路由Wnt配体及其对应受体以及细胞内信号分子等组成，其成员主要包括膜外Wnt蛋白（配体）、卷曲蛋白、低密度脂蛋白受体相关蛋白（low density lipoprotein receptor related protein，LRP）5/6（细胞膜共受体）、胞质内散乱蛋白、β-catenin、肌酸激酶1、糖原合酶激酶3β、轴蛋白2、大肠腺瘤样蛋白、T细胞因子/淋巴增强因子、下游靶基因（如cylinD1、c-myc、Runx2、Osterix等），以及与Wnt/β-catenin信号通路相关的因子，如Dkks（Dickkopfs）、分泌型卷曲相关蛋白、TGF-β等。它们分别对成骨细胞的分化增殖及骨生成起着重要调节作用[20]。分子遗传学研究表明，当细胞外缺乏Wnt蛋白时，轴蛋白2、糖原合酶激酶3β、大肠腺瘤样蛋白、肌酸激酶1等组成复合体，该复合体可降解β-catenin，进而阻断Wnt/β-catenin信号通路，使成骨细胞增殖、分化受阻；当细胞外有Wnt蛋白时，Wnt/β-catenin信号通路则被激活，此时糖原合酶激酶3β活性受到抑制，促使β-catenin在细胞内大量聚集并进入细胞核内，继而启动下游靶基因的表达，从而促进成骨细胞分化及成熟[21-23]。
此外，大量体内外研究表明，经典Wnt信号通路在骨代谢调节过程中也扮演着重要角色[24-25]。例如，LRP5作为Wnt/β-catenin信号通路重要成员，其基因突变时可导致骨代谢失调，从而严重影响骨量平衡[26]。当LRP5功能获得性突变时，可致人体出现高骨量表型，活组织检查表现为骨小梁体积增加及髓内脂肪组织减少；相反，当LRP5功能缺失性突变时，会致人体出现低骨量表型，活组织检查表现为骨量丢失及髓内脂肪增加。分子遗传学研究表明，LRP5功能缺失性突变是导致临床上一种罕见疾病骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征发生的根本原因[27]，相关体外实验以及动物模型研究也得出了相同结论[28-29]。体外研究表明，转导活化的LRP5进入经Wnt3a预先处理过的hMSCs（hMSC-LRP5 T253）后，细胞内ALP表达明显增多，而脂滴形成减少；将该细胞复合于羟基磷灰石/磷酸三钙并植于小鼠皮下后，发现细胞-支架复合物下有矿化骨形成；而转导失活的LRP5（hMSCs-LRP5 T244）则可观察到相反结果[30]。研究表明[31]，LRP5能通过上调Cbfα1/Runx2及ALP的表达促进MSCs向成骨细胞分化，同时下调CCAAT增强子结合蛋白α及过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达来抑制脂肪形成。其次，β-catenin作为Wnt信号通路的关键信号蛋白，对小鼠出生后骨骼发育及骨量维持也具有十分重要作用。β-catenin基因突变可引起小鼠骨量减少及破骨细胞数量增加[19, 32]。通过选择性敲除向成骨细胞系分化的MSCs内β-catenin基因可致异位软骨细胞形成，并且抑制正常成骨[33]。此外，Wnt/β-catenin信号通路的相关拮抗剂，如Dkks、 分泌型卷曲相关蛋白、Wnt抑制因子1、骨硬化蛋白等也可通过作用于Wnts、Fzd及LRP5/6等受体或配体，间接调节骨量及成骨分化[22]。
与BMP-Smads信号通路类似，经典Wnt信号通路在调节成骨细胞分化及骨形成方面最终也是通过作用于Runx2起作用。Hill等[34]的研究表明，Runx2基因启动子序列包含一个TCF作用元件，它能将β-catenin及TCF1募集到该位点，继而启动Runx2及下游靶基因的表达，从而调节成骨细胞分化及骨形成。此外，Kang等[35]的研究表明，在MSCs中短暂激活Wnt/β-catenin信号通路可抑制成脂特异性转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达，并诱导成骨相关转录因子Dlx5、Osx的表达以促进成骨。
2.3 Notch信号通路
研究发现，在调节细胞增殖、分化及凋亡等一系列生理病理过程中，除上述通路外，Notch信号通路也具有重要作用，尤其表现在MSCs向成骨细胞分化及骨形成过程中[36-38]。Notch信号通路主要成员包括Notch受体、配体、CSL蛋白以及Notch信号的效应分子。其中，Notch本身是一类在进化上高度保守的受体蛋白，在哺乳动物中Notch受体的同源分子有4种，分别为Notch1、2、3、4。配体同源分子目前已知有5 种，分别为Delta1、3、4以及Jagged1、2。Notch信号效应分子主要为HES，该家族包含6个成员，其中HES1与HES5在Notch信号通路中发挥主要作用[39-40]。分子遗传学研究表明，当Notch受体与相邻细胞表面的配体结合后，Notch信号通路即被激活，此时Notch受体分别在TACE及γ-分泌酶的作用下相继发生两次蛋白水解，释放出Notch受体胞内活性片段（Notch intracellular domain，NICD），并转移至细胞核内与CSL蛋白（一种DNA结合蛋白）及其共活化因子MAML结合，从而激活并启动其下游靶基因（如HES、HEY等）的表达[41-42]。
目前，Notch信号通路在调节MSCs向成骨细胞分化过程中的重要作用，已在多种体内外模型中得到印证。Ugarte等[43]的研究表明，Notch信号通路在体外具有诱导和抑制成骨细胞分化的双向调节作用。Zanotti等[44]研究发现，Notch信号通路具有抑制成骨细胞分化以及降低骨量的作用。Engin等[45]通过转基因小鼠实验证实，当成骨细胞中过表达NICD信号可致骨质密集或硬化骨形成，而当γ-分泌酶（Notch通路关键酶）基因发生突变时，可引起迟发型年龄相关性骨质疏松症。其中，导致硬化骨形成的原因不是由于降低了破骨细胞活性，而是提高了未成熟成骨细胞的增殖、分化能力；同样，Notch功能缺失型小鼠发生骨质疏松的原因也不是因提高了破骨细胞的活性，而是成骨细胞增殖分化能力下降所致。Watanabe等[46]认为，Notch信号通路能提高成骨细胞增殖能力，可能是通过转录激活Osterix/Sp7启动子，以及上调细胞周期蛋白D和周期蛋白E来实现的，还可通过结合Runx2来抑制成骨细胞成熟。Hilton等[47]通过免疫共沉淀实验表明，瞬时转染NICD、HES及HEY的MSCs均可通过降低Runx2生物活性而抑制成骨。
此外，Notch信号通路还参与调节BMP及Wnt信号诱导的成骨细胞分化及骨形成。例如，Deregowski等[48]报道，在MSCs中NICD过度表达可导致BMP-2及Wnt3α对ALP活性起抑制作用。Zamurovic等[49]报道，Notch的目的基因HEYl在成骨细胞前体MC3B细胞株中可以被BMP-2诱导。总之，Notch信号通路可通过多种途径直接或间接地参与调控成骨细胞分化及骨形成。
2.4 Hedgehog信号通路
Hedgehog基因最早由Lee等于1980年从果蝇胚胎体内分离得到，目前已被证实是一种高度保守基因，该基因突变时可致果蝇胚胎发育成毛团状，酷似刺猬，故又被称为刺猬基因。其编码的Hedgehog蛋白是一类分泌型信号蛋白，在哺乳动物体内Hedgehog蛋白家族主要包括3种同源蛋白，即Indian hedgehog（Ihh）、Sonic hedgehog（Shh）及Desert hedgehog（Dhh）[50]。分子遗传学研究表明，Hedgehog信号通路与其他信号通路类似，也是由Hedgehog相应配体（Ihh、Shh、Dhh）、受体（Patched/Ptc、Smoothened/Smo）及细胞内信号分子（Cos2/Kif7、Fu、Ci/Gli）等组成[51]。当Hedgehog蛋白与细胞膜上特殊受体Ptc结合时，Smo得以活化，活化的Smo与Cos2、Fu结合形成复合物，该复合物可激活锌指蛋白家族Ci/Gli，促使它们进入核内聚集并激活转录，从而启动下游靶基因（如Cyclin D/E、HIP、Myc等）的表达。
既往研究显示[52-53]，Hedgehog信号通路在胚胎发育及肿瘤发生过程中扮演着重要角色，它在调节各种组织器官的生长发育及形态功能上具有独特的生物学功能。近期研究发现[54-55]，Hedgehog信号通路在调节细胞增殖、分化过程中亦具有十分重要作用；其中以研究Hedgehog通路在MSCs增殖、分化过程中的调控作用较多。该信号通路主要参与促进MSCs向成骨细胞及软骨细胞分化，而阻止其向脂肪细胞分化[56]。在成骨细胞分化方面，Ihh及Shh是调控肢体发育及成骨细胞分化的重要信号分子。其中，Shh是成骨细胞分化早期的关键信号之一，而Ihh主要在后期参与分化的调控[57-58]。也有研究表明，Shh能促进间充质细胞系C3H10T1/2及前成骨细胞系MC3T3-E1合成及表达ALP；而Ihh参与了软骨内成骨的调节[59-60]。此外，Shimoyama等[61]报道，Hedgehog信号通路中的Gli2蛋白也与MSCs成骨分化密切相关。Gli2过度表达能诱导ALP、骨钙素的表达，使MSCs钙化；经Ihh处理或使Gli2过度表达后能使MSCs的Runx2的表达上调，而经同样处理的Runx2缺陷MSCs则不能增加ALP活性；在未敲除Runx2的MSCs中，显型阴性的Gli2可明显抑制Ihh诱导的成骨分化。由此表明Ihh是通过Gli2上调Runx2的表达来调控成骨细胞分化。
总之，Hedgehog信号通路不仅在胚胎发育及肿瘤发生过程中扮演着重要角色，同时也可通过间接调控Runx2的表达来调节成骨细胞分化及骨形成等，因而也被视作调控成骨细胞分化及骨形成关键信号通路之一，但其具体调节机制目前还未完全阐明，仍需进一步研究。
2.5 FGF信号通路
FGFs家族是一类由23种基因编码的结构相关的分泌性蛋白。目前研究显示，FGF通过与细胞表面的特异性受体FGFR（FGFR1～5）结合，使FGFR发生二聚化，并促使FGFR胞内酪氨酸残基磷酸化，再通过相应机制活化并启动其下游信号转导路径，如Ras、丝裂原活化蛋白激酶、3-磷脂酰肌醇激酶/苏氨酸激酶、蛋白激酶C等，将细胞外信号传递至细胞内，从而激活下游靶基因的表达[62]。研究表明，FGF信号通路参与了胚胎发育及多种细胞生物学活动的调节，对细胞的增殖、分化、凋亡起着重要的调控作用[63]。其中，关于骨骼系统，Marie等[64]报道FGF信号通路对出生前后骨骼系统的发育具有重要的调节作用。因此，探明FGF信号通路在成骨细胞分化及骨代谢中的调节机制已逐渐成为一个新的研究热点，特别是在细胞及分子学水平上揭示其作用机制，对深入研究相关骨代谢疾病的发病机制具有重要意义。
Su等[65]报道，FGF可刺激多种细胞系的增殖及分化，其中包括成骨前体细胞及MSCs等。Fei等[66]报道，FGF-2作为FGFs家族的重要成员之一，可由成骨细胞合成并表达，然后存储于细胞外基质，其对成骨细胞分化及骨形成具有正向调节作用。也有研究显示[67]，FGF-2可诱导人MSCs中ALP的表达，但并不改变骨钙素mRNA的表达水平，表明FGF-2可能参与了成骨细胞分化早期的调节。此外，针对小鼠及人类的细胞及遗传学研究证实，FGF信号通路可通过募集与活化成软骨细胞及成骨细胞系来调控软骨生成、成骨细胞分化及骨形成等[68-69]。最新研究发现，FGF信号通路也可通过激活Runx2及BMP-2的表达来调控成骨分化及骨形成。例如，Kodama等[70]通过凝胶系统持续向小鼠体内释放人重组FGF-2，结果显示实验组小鼠的下颌骨体积较对照组大1.5倍，且分化的成骨细胞数目较对照组增多，Runx2及BMP-2的表达也明显提高。Agas等[71]通过培养敲除FGF-2基因的小鼠MSCs，发现细胞中Runx2 mRNA表达明显下调，而加入FGF-2后Runx2 mRNA表达则明显提高。此外，Kim等[72]通过研究证实，FGF-2可诱导Runx2发生磷酸化并活化，从而调节成骨细胞分化。
以上研究结果表明，FGF信号通路不但对胚胎发育及细胞增殖、分化、凋亡起着重要调控作用；而且对成骨细胞分化及骨形成也具有关键作用，并且也可间接调节Runx2及BMP-2的表达，从而与上述其他信号通路组成复杂的调控网络，共同参与成骨细胞分化及骨形成的调节。
3 小结
综上述，成骨细胞分化及骨形成受诸如BMP、Wnt、Notch、Hedgehog、FGF等多条关键信号通路的调节，它们通过直接或间接作用于Runx2或Osterix等关键转录因子而彼此相互联系，相互影响，从而组成了错综复杂的调控网络，协同参与成骨细胞分化及骨形成的调节。尽管目前对相关信号通路的研究较多，并且也取得了一些重大研究成果，但有关各信号通路在调控成骨细胞分化及骨形成方面的确切分子机制及相互作用方式仍不十分明了。相信随着有关研究的进一步深入，有望彻底揭开成骨细胞分化及骨形成过程的完整分子机制，从而为临床有效防治与成骨分化及骨形成异常相关的疾病（如骨质疏松症、异位骨化等）提供新的理论依据与治疗靶点。
成骨细胞是人体骨组织的重要组成成分，也是参与骨形成的主要功能细胞，在骨骼生长发育及骨量维持方面扮演着关键角色。它来源于具有多向分化潜能的MSCs，经细胞增殖、细胞外基质合成、成熟及矿化后最终发展成为骨细胞，从而促进骨形成及维持骨量。从分子生物学水平上看，目前已知多条信号通路参与了成骨细胞分化过程的调节，其中最重要的信号通路包括BMP-Smads、Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）、Notch、Hedgehog、FGF等。这些信号通路在调控成骨细胞分化及骨生成方面起着重要作用，一旦其中一条或数条信号通路调节受阻，都会引起成骨细胞分化异常或骨形成障碍，进而导致相应骨代谢疾病的发生，如骨质疏松症、骨硬化症等。因此，为了更好地认识和治疗这类疾患，阐明这些信号通路在调节成骨细胞分化及骨形成方面的作用机制及规律具有重要意义。现对成骨细胞分化及骨形成过程中起关键调节作用的信号通路的相关研究进展作一综述，为下一步研究奠定基础。
1 概述
成骨细胞作为骨形成的主要功能细胞，在分化成熟过程中会逐步表达如ALP、骨钙素、血清Ⅰ型前胶原C端肽等特异性标志物。同时，在此过程中也会受到一系列转录因子的调控，如Runt相关转录因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、Osterix/Sp7、β-catenin、转录激活因子4、核转录因子激活蛋白1、Smads等，它们彼此协同作用，共同参与调节成骨细胞分化及骨形成。其中，核心结合因子α1/Runx2（core binding factorα1/ Runx2，Cbfα1/Runx2）及Osterix/Sp7作为成骨特异性转录因子，在成骨细胞分化及骨形成过程中起关键调控作用[1]。因而，Runx2及Osterix也被认为是成骨分化调控网络的关键节点，参与组成该网络的各条信号通路都直接或间接作用于该节点，并最终调控其下游靶基因的表达，从而调节成骨细胞分化及骨形成[2]
2 成骨细胞分化及骨形成关键信号通路
2.1 BMP-Smads信号通路
表达或激活成骨细胞分化及骨形成的关键转录因子（如Runx2）需多条信号通路共同参与调控。其中，BMP-Smads信号通路是最重要、也是最早发现和确认的一条通路。20世纪80年代有学者首次从牛骨中分离提取了BMPs类物质，将其植入小鼠体内后成功诱导出异位成骨模型[3]。随后，BMPs被证实是TGF-β超家族中的重要成员，该家族成员还包括TGF-β、细胞活素等，其受体均为丝氨酸/苏氨酸激酶受体。TGF-β超家族通过作用于下游的信号分子（如Smads）发挥生物学功能。目前，已发现超过20种BMPs，其在胚胎发育、器官形成及细胞增殖、分化、迁移、凋亡等过程中具有广泛且重要的生物学作用[4-6]。有关BMPs，尤其是BMP-2、4、5、6、7、 9等，在MSCs成骨及成脂分化中的调节作用是目前研究热点之一[7-9]。
研究表明，在成骨分化及骨形成方面，BMPs扮演着重要角色[10]。多数学者认为BMPs是骨形态发生最早期的信号分子，对成骨细胞分化及骨形成具有特异性诱导作用[11]。分子遗传学研究表明，内源性或外源性BMPs通过结合细胞膜上特异性受体——BMP受体Ⅰ（BMP receptorⅠ，BMPR-Ⅰ）及BMPR-Ⅱ，使BMPR-Ⅰ磷酸化，再与BMPs特异作用的Smads蛋白（如Smad1、5、8）结合并使其也发生磷酸化，然后进入细胞核，继而启动并激活成骨细胞特异性转录因子（如Cbfα1/Runx2、Osterix/Sp7等），从而诱导MSCs向成骨细胞分化及骨形成[12-14]。在此过程中，BMP-Smads信号通路受多种细胞因子调控，其中Smurf蛋白最重要。该蛋白是E3连接酶中的重要成员，包括Smurf1和Smurf2，其中Smurf1是BMP-Smads信号通路负性调节因子，可介导BMPR-Ⅰ的调节，还能特异性识别和结合Runx2及Smad1，促使它们泛素化并被26S蛋白酶体识别和降解，进而负向调节BMP-Smads信号通路，从而抑制成骨细胞分化及骨形成[15]。
总之，BMP-Smads信号通路是参与调控MSCs向成骨细胞分化及骨形成的关键信号通路之一，同时其自身也受到多种细胞因子的调节，从而在生物体内形成了复杂调控网络。明确其作用机制有助于对成骨细胞分化异常或骨形成障碍性疾患有更深刻认识，为临床上治疗该类疾病提供新的治疗策略。
2.2 Wnt/β-catenin信号通路
Wnt/β-catenin信号通路在调节MSCs向成骨细胞分化及骨形成方面同样具有重要作用[16]。Wnt基因最初是由Nusse等[17]在小鼠乳腺癌病毒诱导的小鼠乳腺癌组织中分离并克隆出的一种原癌基因。迄今为止，已发现人类19种Wnt基因。其编码的Wnt蛋白家族由信号肽及23～24个位置保守的半胱氨酸残基组成，在多种组织中广泛表达，并且在进化上高度保守[18]。研究发现，Wnt信号通路参与调控许多生物学活动，有抑制脂肪形成而促进骨形成的作用，并与肿瘤发生密切相关[19]。Wnt信号通路根据是否有β-catenin参与分为经典和非经典信号通路。其中，在骨生长发育及骨代谢方面，经典Wnt信号通路（即Wnt/β-catenin通路）对成骨细胞的作用是研究热点。经典Wnt信号通路由Wnt配体及其对应受体以及细胞内信号分子等组成，其成员主要包括膜外Wnt蛋白（配体）、卷曲蛋白、低密度脂蛋白受体相关蛋白（low density lipoprotein receptor related protein，LRP）5/6（细胞膜共受体）、胞质内散乱蛋白、β-catenin、肌酸激酶1、糖原合酶激酶3β、轴蛋白2、大肠腺瘤样蛋白、T细胞因子/淋巴增强因子、下游靶基因（如cylinD1、c-myc、Runx2、Osterix等），以及与Wnt/β-catenin信号通路相关的因子，如Dkks（Dickkopfs）、分泌型卷曲相关蛋白、TGF-β等。它们分别对成骨细胞的分化增殖及骨生成起着重要调节作用[20]。分子遗传学研究表明，当细胞外缺乏Wnt蛋白时，轴蛋白2、糖原合酶激酶3β、大肠腺瘤样蛋白、肌酸激酶1等组成复合体，该复合体可降解β-catenin，进而阻断Wnt/β-catenin信号通路，使成骨细胞增殖、分化受阻；当细胞外有Wnt蛋白时，Wnt/β-catenin信号通路则被激活，此时糖原合酶激酶3β活性受到抑制，促使β-catenin在细胞内大量聚集并进入细胞核内，继而启动下游靶基因的表达，从而促进成骨细胞分化及成熟[21-23]。
此外，大量体内外研究表明，经典Wnt信号通路在骨代谢调节过程中也扮演着重要角色[24-25]。例如，LRP5作为Wnt/β-catenin信号通路重要成员，其基因突变时可导致骨代谢失调，从而严重影响骨量平衡[26]。当LRP5功能获得性突变时，可致人体出现高骨量表型，活组织检查表现为骨小梁体积增加及髓内脂肪组织减少；相反，当LRP5功能缺失性突变时，会致人体出现低骨量表型，活组织检查表现为骨量丢失及髓内脂肪增加。分子遗传学研究表明，LRP5功能缺失性突变是导致临床上一种罕见疾病骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征发生的根本原因[27]，相关体外实验以及动物模型研究也得出了相同结论[28-29]。体外研究表明，转导活化的LRP5进入经Wnt3a预先处理过的hMSCs（hMSC-LRP5 T253）后，细胞内ALP表达明显增多，而脂滴形成减少；将该细胞复合于羟基磷灰石/磷酸三钙并植于小鼠皮下后，发现细胞-支架复合物下有矿化骨形成；而转导失活的LRP5（hMSCs-LRP5 T244）则可观察到相反结果[30]。研究表明[31]，LRP5能通过上调Cbfα1/Runx2及ALP的表达促进MSCs向成骨细胞分化，同时下调CCAAT增强子结合蛋白α及过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达来抑制脂肪形成。其次，β-catenin作为Wnt信号通路的关键信号蛋白，对小鼠出生后骨骼发育及骨量维持也具有十分重要作用。β-catenin基因突变可引起小鼠骨量减少及破骨细胞数量增加[19, 32]。通过选择性敲除向成骨细胞系分化的MSCs内β-catenin基因可致异位软骨细胞形成，并且抑制正常成骨[33]。此外，Wnt/β-catenin信号通路的相关拮抗剂，如Dkks、 分泌型卷曲相关蛋白、Wnt抑制因子1、骨硬化蛋白等也可通过作用于Wnts、Fzd及LRP5/6等受体或配体，间接调节骨量及成骨分化[22]。
与BMP-Smads信号通路类似，经典Wnt信号通路在调节成骨细胞分化及骨形成方面最终也是通过作用于Runx2起作用。Hill等[34]的研究表明，Runx2基因启动子序列包含一个TCF作用元件，它能将β-catenin及TCF1募集到该位点，继而启动Runx2及下游靶基因的表达，从而调节成骨细胞分化及骨形成。此外，Kang等[35]的研究表明，在MSCs中短暂激活Wnt/β-catenin信号通路可抑制成脂特异性转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达，并诱导成骨相关转录因子Dlx5、Osx的表达以促进成骨。
2.3 Notch信号通路
研究发现，在调节细胞增殖、分化及凋亡等一系列生理病理过程中，除上述通路外，Notch信号通路也具有重要作用，尤其表现在MSCs向成骨细胞分化及骨形成过程中[36-38]。Notch信号通路主要成员包括Notch受体、配体、CSL蛋白以及Notch信号的效应分子。其中，Notch本身是一类在进化上高度保守的受体蛋白，在哺乳动物中Notch受体的同源分子有4种，分别为Notch1、2、3、4。配体同源分子目前已知有5 种，分别为Delta1、3、4以及Jagged1、2。Notch信号效应分子主要为HES，该家族包含6个成员，其中HES1与HES5在Notch信号通路中发挥主要作用[39-40]。分子遗传学研究表明，当Notch受体与相邻细胞表面的配体结合后，Notch信号通路即被激活，此时Notch受体分别在TACE及γ-分泌酶的作用下相继发生两次蛋白水解，释放出Notch受体胞内活性片段（Notch intracellular domain，NICD），并转移至细胞核内与CSL蛋白（一种DNA结合蛋白）及其共活化因子MAML结合，从而激活并启动其下游靶基因（如HES、HEY等）的表达[41-42]。
目前，Notch信号通路在调节MSCs向成骨细胞分化过程中的重要作用，已在多种体内外模型中得到印证。Ugarte等[43]的研究表明，Notch信号通路在体外具有诱导和抑制成骨细胞分化的双向调节作用。Zanotti等[44]研究发现，Notch信号通路具有抑制成骨细胞分化以及降低骨量的作用。Engin等[45]通过转基因小鼠实验证实，当成骨细胞中过表达NICD信号可致骨质密集或硬化骨形成，而当γ-分泌酶（Notch通路关键酶）基因发生突变时，可引起迟发型年龄相关性骨质疏松症。其中，导致硬化骨形成的原因不是由于降低了破骨细胞活性，而是提高了未成熟成骨细胞的增殖、分化能力；同样，Notch功能缺失型小鼠发生骨质疏松的原因也不是因提高了破骨细胞的活性，而是成骨细胞增殖分化能力下降所致。Watanabe等[46]认为，Notch信号通路能提高成骨细胞增殖能力，可能是通过转录激活Osterix/Sp7启动子，以及上调细胞周期蛋白D和周期蛋白E来实现的，还可通过结合Runx2来抑制成骨细胞成熟。Hilton等[47]通过免疫共沉淀实验表明，瞬时转染NICD、HES及HEY的MSCs均可通过降低Runx2生物活性而抑制成骨。
此外，Notch信号通路还参与调节BMP及Wnt信号诱导的成骨细胞分化及骨形成。例如，Deregowski等[48]报道，在MSCs中NICD过度表达可导致BMP-2及Wnt3α对ALP活性起抑制作用。Zamurovic等[49]报道，Notch的目的基因HEYl在成骨细胞前体MC3B细胞株中可以被BMP-2诱导。总之，Notch信号通路可通过多种途径直接或间接地参与调控成骨细胞分化及骨形成。
2.4 Hedgehog信号通路
Hedgehog基因最早由Lee等于1980年从果蝇胚胎体内分离得到，目前已被证实是一种高度保守基因，该基因突变时可致果蝇胚胎发育成毛团状，酷似刺猬，故又被称为刺猬基因。其编码的Hedgehog蛋白是一类分泌型信号蛋白，在哺乳动物体内Hedgehog蛋白家族主要包括3种同源蛋白，即Indian hedgehog（Ihh）、Sonic hedgehog（Shh）及Desert hedgehog（Dhh）[50]。分子遗传学研究表明，Hedgehog信号通路与其他信号通路类似，也是由Hedgehog相应配体（Ihh、Shh、Dhh）、受体（Patched/Ptc、Smoothened/Smo）及细胞内信号分子（Cos2/Kif7、Fu、Ci/Gli）等组成[51]。当Hedgehog蛋白与细胞膜上特殊受体Ptc结合时，Smo得以活化，活化的Smo与Cos2、Fu结合形成复合物，该复合物可激活锌指蛋白家族Ci/Gli，促使它们进入核内聚集并激活转录，从而启动下游靶基因（如Cyclin D/E、HIP、Myc等）的表达。
既往研究显示[52-53]，Hedgehog信号通路在胚胎发育及肿瘤发生过程中扮演着重要角色，它在调节各种组织器官的生长发育及形态功能上具有独特的生物学功能。近期研究发现[54-55]，Hedgehog信号通路在调节细胞增殖、分化过程中亦具有十分重要作用；其中以研究Hedgehog通路在MSCs增殖、分化过程中的调控作用较多。该信号通路主要参与促进MSCs向成骨细胞及软骨细胞分化，而阻止其向脂肪细胞分化[56]。在成骨细胞分化方面，Ihh及Shh是调控肢体发育及成骨细胞分化的重要信号分子。其中，Shh是成骨细胞分化早期的关键信号之一，而Ihh主要在后期参与分化的调控[57-58]。也有研究表明，Shh能促进间充质细胞系C3H10T1/2及前成骨细胞系MC3T3-E1合成及表达ALP；而Ihh参与了软骨内成骨的调节[59-60]。此外，Shimoyama等[61]报道，Hedgehog信号通路中的Gli2蛋白也与MSCs成骨分化密切相关。Gli2过度表达能诱导ALP、骨钙素的表达，使MSCs钙化；经Ihh处理或使Gli2过度表达后能使MSCs的Runx2的表达上调，而经同样处理的Runx2缺陷MSCs则不能增加ALP活性；在未敲除Runx2的MSCs中，显型阴性的Gli2可明显抑制Ihh诱导的成骨分化。由此表明Ihh是通过Gli2上调Runx2的表达来调控成骨细胞分化。
总之，Hedgehog信号通路不仅在胚胎发育及肿瘤发生过程中扮演着重要角色，同时也可通过间接调控Runx2的表达来调节成骨细胞分化及骨形成等，因而也被视作调控成骨细胞分化及骨形成关键信号通路之一，但其具体调节机制目前还未完全阐明，仍需进一步研究。
2.5 FGF信号通路
FGFs家族是一类由23种基因编码的结构相关的分泌性蛋白。目前研究显示，FGF通过与细胞表面的特异性受体FGFR（FGFR1～5）结合，使FGFR发生二聚化，并促使FGFR胞内酪氨酸残基磷酸化，再通过相应机制活化并启动其下游信号转导路径，如Ras、丝裂原活化蛋白激酶、3-磷脂酰肌醇激酶/苏氨酸激酶、蛋白激酶C等，将细胞外信号传递至细胞内，从而激活下游靶基因的表达[62]。研究表明，FGF信号通路参与了胚胎发育及多种细胞生物学活动的调节，对细胞的增殖、分化、凋亡起着重要的调控作用[63]。其中，关于骨骼系统，Marie等[64]报道FGF信号通路对出生前后骨骼系统的发育具有重要的调节作用。因此，探明FGF信号通路在成骨细胞分化及骨代谢中的调节机制已逐渐成为一个新的研究热点，特别是在细胞及分子学水平上揭示其作用机制，对深入研究相关骨代谢疾病的发病机制具有重要意义。
Su等[65]报道，FGF可刺激多种细胞系的增殖及分化，其中包括成骨前体细胞及MSCs等。Fei等[66]报道，FGF-2作为FGFs家族的重要成员之一，可由成骨细胞合成并表达，然后存储于细胞外基质，其对成骨细胞分化及骨形成具有正向调节作用。也有研究显示[67]，FGF-2可诱导人MSCs中ALP的表达，但并不改变骨钙素mRNA的表达水平，表明FGF-2可能参与了成骨细胞分化早期的调节。此外，针对小鼠及人类的细胞及遗传学研究证实，FGF信号通路可通过募集与活化成软骨细胞及成骨细胞系来调控软骨生成、成骨细胞分化及骨形成等[68-69]。最新研究发现，FGF信号通路也可通过激活Runx2及BMP-2的表达来调控成骨分化及骨形成。例如，Kodama等[70]通过凝胶系统持续向小鼠体内释放人重组FGF-2，结果显示实验组小鼠的下颌骨体积较对照组大1.5倍，且分化的成骨细胞数目较对照组增多，Runx2及BMP-2的表达也明显提高。Agas等[71]通过培养敲除FGF-2基因的小鼠MSCs，发现细胞中Runx2 mRNA表达明显下调，而加入FGF-2后Runx2 mRNA表达则明显提高。此外，Kim等[72]通过研究证实，FGF-2可诱导Runx2发生磷酸化并活化，从而调节成骨细胞分化。
以上研究结果表明，FGF信号通路不但对胚胎发育及细胞增殖、分化、凋亡起着重要调控作用；而且对成骨细胞分化及骨形成也具有关键作用，并且也可间接调节Runx2及BMP-2的表达，从而与上述其他信号通路组成复杂的调控网络，共同参与成骨细胞分化及骨形成的调节。
3 小结
综上述，成骨细胞分化及骨形成受诸如BMP、Wnt、Notch、Hedgehog、FGF等多条关键信号通路的调节，它们通过直接或间接作用于Runx2或Osterix等关键转录因子而彼此相互联系，相互影响，从而组成了错综复杂的调控网络，协同参与成骨细胞分化及骨形成的调节。尽管目前对相关信号通路的研究较多，并且也取得了一些重大研究成果，但有关各信号通路在调控成骨细胞分化及骨形成方面的确切分子机制及相互作用方式仍不十分明了。相信随着有关研究的进一步深入，有望彻底揭开成骨细胞分化及骨形成过程的完整分子机制，从而为临床有效防治与成骨分化及骨形成异常相关的疾病（如骨质疏松症、异位骨化等）提供新的理论依据与治疗靶点。