引用本文： 王运涛, 吴小涛, 王锋, 朱厚毅, 王小虎, 时睿. 髓核中p16INK4a的表达及其对椎间盘退变的影响. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(12): 1514-1518. doi: 10.7507/1002-1892.20140328 复制
椎间盘退变是一个多因素参与的慢性过程，退变的椎间盘共同表现为髓核细胞（nucleus pulposus cells，NPCs）数量减少和功能降低，Ⅱ型胶原、蛋白聚糖等基质大分子降解[1-5]。遗传倾向、炎性因子、细胞凋亡、营养障碍等因素均与椎间盘退变相关，而细胞的衰老在此过程中起着重要作用[6-9]。在人类很多衰老体细胞中均可见p16INK4a表达累积现象，它是衰老的重要调控基因[6- 8，10]。Le Maitre等[7]发现随着患者年龄和椎间盘退变分级的增加，衰老NPCs比例增加，而p16INK4a在这一过程中起重要作用；但Kim等[6]对p16INK4a参与这一过程的调控持否定观点，认为是端粒依赖的p53/p21途径起主导作用。鉴于此，本研究拟对同一年龄段、不同程度腰椎间盘退变患者髓核中p16INK4a的表达进行探讨。由于椎间盘组织中含血小板凝血酶敏感蛋白的解聚素与金属蛋白酶5（A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5，ADAMTS 5），是降解细胞外基质成分聚集蛋白聚糖（Aggrecan）的主要金属蛋白酶，同时Sry相关的HMG盒转录因子9（Sry-related HMG box transcription factor 9，Sox-9）作为一种特异的转录因子参与了椎间盘从发育到成熟的过程[11-12]，因此本研究选取Aggrecan、ADAMTS 5、Sox-9作为椎间盘退变的评价指标，拟探讨p16INK4a的表达与椎间盘退变的关系，为退变椎间盘的生物学修复提供依据。报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（Millipore公司，美国）；彩色预染蛋白分子量标准（Fermentas公司，加拿大）；兔抗人Aggrecan多克隆抗体、兔抗人ADAMTS 5多克隆抗体、兔抗人Sox-9多克隆抗体、鼠抗人p16INK4a多克隆抗体、兔抗人GAPDH多克隆抗体（Abcam公司，英国）；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠IgG抗体（Bioworld公司，美国）；羊抗兔、羊抗鼠SP免疫组织化学染色试剂盒（福州迈新生物技术有限公司）；衰老相关-β-半乳糖苷酶（senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-gal）检测试剂盒、Western blot检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。切片机（Leica公司，德国）；BH2型光学显微镜（Olympus公司，日本）；酶标仪（Molecular Devices公司，美国）；电泳系统、凝胶成像分析仪（Bio-Rad公司，美国）。
1.2 退变髓核标本收集
经患者知情同意，取2012年11月－2013年2月于东南大学附属中大医院骨科因腰椎间盘退变接受手术治疗的17例患者退变髓核标本。其中男11例，女6例；年龄40～50岁，平均45.4岁。其中L3、4 1 例、L4、5 11例，L5、S1 5例。退变按Pfirrmann分级为Ⅲ级10例，Ⅳ级7例；Ⅲ、Ⅳ级患者年龄分别为（45.6 ± 3.3）岁和（45.1 ± 4.4）岁，差异无统计学意义（t=0.244，P=0.811）。
1.3 检测指标
1.3.1 SA-β-gal活性检测
取髓核标本制备15 μm厚切片，加入1 mL SA-β-gal染色固定液室温固定15 min；弃固定液，PBS洗3遍，加入1 mL染色工作液（配制方法：SA-β-gal染色液A 10 μL，SA-β-gal染色液B 10 μL，SA-β-gal染色液C 930 μL，X-gal溶液50 μL），37℃染色过夜。光镜下观察细胞染色情况，绿染细胞为SA-β-gal阳性细胞。随机取5个高倍视野（×250倍）计数细胞，计算阳性细胞百分比。
1.3.2 免疫组织化学染色观察
取髓核标本制备4 μm厚切片，二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水；阻断、灭活内源性过氧化物酶，抗原修复，正常羊血清工作液封闭；滴加兔抗人Aggrecan多克隆抗体、兔抗人ADAMTS 5多克隆抗体、兔抗人Sox-9多克隆抗体、鼠抗人p16INK4a多克隆抗体一抗，4℃孵育过夜，PBS洗3遍，滴加羊抗兔或羊抗鼠二抗37℃孵育15 min，PBS洗3遍，滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶，37℃孵育15 min，PBS洗3遍；DAB反应染色，苏木素复染，封片。光镜下观察目的抗原表达情况，阳性表达呈棕黄色或棕褐色。随机取5个高倍视野（×250倍），计算阳性细胞百分比。
1.3.3 Western blot检测
取髓核组织块置于匀浆器中，加裂解液（含苯甲基磺酰氟）充分匀浆，提取总蛋白。常规方法行SDS-PAGE，转膜。取出已封闭的PVDF膜，洗涤后置于含有兔抗人Aggrecan多克隆抗体、兔抗人ADAMTS 5多克隆抗体、兔抗人Sox-9多克隆抗体、鼠抗人p16INK4a多克隆抗体、兔抗人GAPDH多克隆抗体一抗的小袋中，室温孵育2 h；洗膜，将PVDF膜置于辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或羊抗鼠二抗中室温孵育1 h。取Western blot检测试剂盒ECL进行化学发光显色，采用凝胶成像分析仪进行吸光度（A）值扫描并进行半定量检测。
1.4 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；ADAMTS 5和p16INK4a蛋白表达相关性分析采用Bivariate过程。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 SA-β-gal活性检测
Ⅲ、Ⅳ级髓核组织内均可见呈绿染的SA-β-gal阳性NPCs，多呈簇状分布；Ⅲ级髓核组织内也可见到少量单个分布的绿染NPCs，细胞呈圆形，其外周由多层细胞外基质包裹；Ⅳ级髓核组织内难以见到单个分布的绿染NPCs。见图 1。Ⅲ、Ⅳ级髓核组织阳性细胞百分比分别为22.7% ± 5.4%和37.1% ± 7.6%，差异有统计学意义（t=—9.666，P=0.000）。
图1
Ⅲ、Ⅳ级髓核组织SA-β-gal染色观察（×400） ⓐⅢ级髓核组织 ⓑⅣ级髓核组织 图 2 Ⅲ、Ⅳ级髓核组织免疫组织化学染色观察（×250） ⓐⅢ级髓核组织p16INK4a ⓑⅣ级髓核组织p16INK4a ⓒⅢ级髓核组织ADAMTS 5 ⓓⅣ级髓核组织ADAMTS 5 ⓔⅢ级髓核组织Aggrecan ⓕⅣ级髓核组织Aggrecan ⓖⅢ级髓核组织Sox-9 ⓗⅣ级髓核组织Sox-9
Figure1.
SA-β-gal staining of NP with grade III or IV degeneration (×400) ⓐGrade III ⓑGrade IV Fig. 2 Immunohistochemistry staining of NP with grade III or IV degeneration (×250) ⓐp16INK4a of NP with grade III degeneration ⓑp16INK4a of NP with grade IV degeneration ⓒADAMTS 5 of NP with grade III degeneration ⓓADAMTS 5 of NP with grade IV degeneration ⓔAggrecan of NP with grade III degeneration ⓕAggrecan of NP with grade IV degeneration ⓖSox-9 of NP with grade III degeneration ⓗSox-9 of NP with grade IV degeneration
2.2 免疫组织化学染色观察
Ⅲ、Ⅳ级髓核组织内均可见到p16INK4a、ADAMTS 5、Aggrecan、Sox-9阳性的NPCs，颗粒呈棕褐色，分布于细胞质和细胞核内。其中Ⅲ级髓核组织中p16INK4a、ADAMTS 5阳性细胞内颗粒淡染，Aggrecan、Sox-9阳性细胞内颗粒浓聚；而Ⅳ级髓核组织中p16INK4a、ADAMTS 5阳性细胞内颗粒浓聚，Aggrecan、Sox-9阳性细胞内颗粒淡染。见图 2。
Ⅲ级髓核组织中p16INK4a、ADAMTS 5、Aggrecan、Sox-9染色阳性细胞百分比分别为26.5% ± 9.0%、24.7% ± 8.3%、42.2% ± 7.9%和38.6% ± 10.7%，Ⅳ级髓核组织中分别为39.3% ± 9.6%、40.4% ± 10.0%、22.3% ± 5.9%、25.3% ± 6.4%，两级间比较差异均有统计学意义（t=—6.272，P=0.000；t=—7.854，P=0.000；t=12.753，P=0.000；t=7.144，P=0.000）。
2.3 Western blot检测
Ⅲ、Ⅳ级髓核组织中均可见p16INK4a、ADAMTS 5、Aggrecan、Sox-9蛋白表达（图 3）。Ⅳ级髓核组织中p16INK4a、ADAMTS 5蛋白相对表达量明显多于Ⅲ级，而Aggrecan、Sox-9蛋白相对表达量明显少于Ⅲ级，差异均有统计学意义（t=—2.762，P=0.008；t=—2.581，P=0.013；t=5.826，P=0.000；t=3.611，P=0.001）。见图 4。两级髓核组织中ADAMTS 5与p16INK4a的蛋白相对表达量间成线性相关（r=0.908，P=0.000），见图 5。
图2
Western blot检测Ⅲ、Ⅳ级髓核组织中各目的蛋白表达Mr：相对分子质量 1：Ⅲ级髓核组织 2：Ⅳ级髓核组织 图 4 Western blot检测Ⅲ、Ⅳ级髓核组织中各目的蛋白相对表达量 图 5 退变髓核组织中p16INK4a与ADAMTS 5蛋白相对表达量的相关性
Figure2.
Protein expressions of NP with grade III or IV degeneration by Western blot Mr: Relative molecular mass 1: Grade III 2: Grade IV Fig. 4 Relative protein levels of Aggrecan,ADAMTS 5,Sox-9,and p16INK4a in NP with grade III or IV degeneration by Western blot Fig. 5 Correlation of p16INK4a and ADAMTS 5 protein expression in NP
3 讨论
下腰痛是脊柱外科常见疾患，发病率高，椎间盘退变是导致下腰痛最常见的原因[13-14]。椎间盘退变起源于髓核，多数研究认为髓核退变主要起因于NPCs和细胞外基质的改变[1, 15]。与多次分裂后端粒缩短引起的复制性衰老不同，应激诱导的过早衰老是由生长因子匮乏、营养障碍、异常细胞接触等应激因素诱发的分裂停滞[16-17]。椎间盘是人体最大的无血管组织，其含氧量低，任何可以引起髓核中氧自由基增加的因素均可导致NPCs过早衰老，如椎间盘长期承受不当应力、髓核周缘组织血管化等，继而导致有功能的NPCs数量减少、大量炎性因子和基质降解酶表达，从而恶化邻近正常细胞赖以生存的微环境，加速椎间盘退变[7, 13]。因此，需要探讨退变椎间盘中NPCs过早衰老的机制，为下一步选择合适的窗口期进行有效生物学干预提供依据。
Pfirrmann分级系统是在Thompson的大体形态学分类基础之上，利用MRI成像技术对退变椎间盘进行分级的一种方法[18]，目前已被广泛用于临床，我们依据该分级系统对收集的髓核组织进行分组。为排除增龄所致的复制性衰老影响，我们仅选取了腰椎间盘退变好发年龄段中40～50岁患者的髓核组织。该年龄段人群中PfirrmannⅠ级几乎不存在，Ⅱ级多无需手术治疗，Ⅴ级中已不存在髓核组织，因此我们仅对该年龄段中PfirrmannⅢ、Ⅳ级的髓核组织进行探讨。结果发现，Ⅲ、Ⅳ级髓核组织内均可见到SA-β-gal阳性NPCs，且Ⅳ级髓核组织中阳性细胞数明显增加。另外，在Ⅲ级髓核组织中阳性NPCs除少量呈单个分布外，多呈簇状分布，而Ⅳ级髓核组织中阳性NPCs呈簇状分布，考虑可能原因是：在退变中后期，NPCs通过代偿性增殖已不足以弥补其数量减少或功能降低[19]；而随着一部分衰老NPCs聚集，其释放的小分子物质导致了低水平炎症的发生，继而进一步引发邻近NPCs的衰老和组织衰退[10]。
研究表明，在人类很多衰老体细胞中均可见到p16INK4a表达累积现象；一些细胞中p16INK4a的激活会促进衰老相关异染色质灶的形成；生存环境压力胁迫、DNA损伤或染色体端粒受损等不仅是衰老的诱因，同时也是诱导p16INK4a表达的主要因素[6-8, 20]。因此，越来越多学者认可p16INK4a是细胞衰老的关键效应基因，它不仅能在一定程度上反映衰老进程，还可能对衰老细胞再生修复产生影响[10, 21]。p16INK4a通过抑制CDK4和CDK6激酶的活性，使磷酸化Rb蛋白维持在低磷酸化，从而使细胞处于生长抑制状态。我们检测发现，Ⅲ、Ⅳ级髓核组织内均可见p16INK4a阳性NPCs，且Ⅳ级中p16INK4a表达明显增强。NPCs为类软骨细胞，其表达Aggrecan等的表型特征与软骨细胞之间存在相似之处；相关研究[11- 12，15]也发现转录因子Sox-9在椎间盘组织中存在特定的表达及调控，且这种调控从胚胎时期就已开始并不断发挥作用，向退变的人椎间盘细胞中转染Sox-9基因，证实其可促进椎间盘细胞增殖、Ⅱ型胶原及Aggrecan的合成。我们检测发现Ⅳ级髓核组织内特异的转录因子Sox-9和Aggrecan的表达较Ⅲ级髓核组织中明显减少。说明p16INK4a参与的NPCs过早衰老与椎间盘退变的进程之间存在联系。
ADAMTS 5是降解Aggrecan的主要金属蛋白酶，我们进一步检测发现其表达在Ⅳ级髓核组织中明显增强，且与p16INK4a的表达成线性相关，说明p16INK4a参与的NPCs过早衰老对椎间盘退变的进程起着主导作用。但这与Kim等[6]的研究结果相反，他们认为是端粒介导的p53/p21途径在NPCs衰老过程中起主导作用，而非p16INK4a/磷酸化Rb途径，这一差异可能与所收集的髓核组织年龄段不同有关。
尽管由于标本来源的限制，本研究只对Ⅲ、Ⅳ级退变髓核组织进行了观测，但仍在一定程度上反映了p16INK4a参与的NPCs过早衰老在椎间盘退变进程中发挥的作用，为下一步通过生物学干预适时逆转NPCs过早衰老或清除衰老的NPCs，从而有效延缓椎间盘退变提供了新思路。另外，p16INK4a参与的NPCs过早衰老的启动有待进一步探讨。
椎间盘退变是一个多因素参与的慢性过程，退变的椎间盘共同表现为髓核细胞（nucleus pulposus cells，NPCs）数量减少和功能降低，Ⅱ型胶原、蛋白聚糖等基质大分子降解[1-5]。遗传倾向、炎性因子、细胞凋亡、营养障碍等因素均与椎间盘退变相关，而细胞的衰老在此过程中起着重要作用[6-9]。在人类很多衰老体细胞中均可见p16INK4a表达累积现象，它是衰老的重要调控基因[6- 8，10]。Le Maitre等[7]发现随着患者年龄和椎间盘退变分级的增加，衰老NPCs比例增加，而p16INK4a在这一过程中起重要作用；但Kim等[6]对p16INK4a参与这一过程的调控持否定观点，认为是端粒依赖的p53/p21途径起主导作用。鉴于此，本研究拟对同一年龄段、不同程度腰椎间盘退变患者髓核中p16INK4a的表达进行探讨。由于椎间盘组织中含血小板凝血酶敏感蛋白的解聚素与金属蛋白酶5（A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5，ADAMTS 5），是降解细胞外基质成分聚集蛋白聚糖（Aggrecan）的主要金属蛋白酶，同时Sry相关的HMG盒转录因子9（Sry-related HMG box transcription factor 9，Sox-9）作为一种特异的转录因子参与了椎间盘从发育到成熟的过程[11-12]，因此本研究选取Aggrecan、ADAMTS 5、Sox-9作为椎间盘退变的评价指标，拟探讨p16INK4a的表达与椎间盘退变的关系，为退变椎间盘的生物学修复提供依据。报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（Millipore公司，美国）；彩色预染蛋白分子量标准（Fermentas公司，加拿大）；兔抗人Aggrecan多克隆抗体、兔抗人ADAMTS 5多克隆抗体、兔抗人Sox-9多克隆抗体、鼠抗人p16INK4a多克隆抗体、兔抗人GAPDH多克隆抗体（Abcam公司，英国）；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠IgG抗体（Bioworld公司，美国）；羊抗兔、羊抗鼠SP免疫组织化学染色试剂盒（福州迈新生物技术有限公司）；衰老相关-β-半乳糖苷酶（senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-gal）检测试剂盒、Western blot检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。切片机（Leica公司，德国）；BH2型光学显微镜（Olympus公司，日本）；酶标仪（Molecular Devices公司，美国）；电泳系统、凝胶成像分析仪（Bio-Rad公司，美国）。
1.2 退变髓核标本收集
经患者知情同意，取2012年11月－2013年2月于东南大学附属中大医院骨科因腰椎间盘退变接受手术治疗的17例患者退变髓核标本。其中男11例，女6例；年龄40～50岁，平均45.4岁。其中L3、4 1 例、L4、5 11例，L5、S1 5例。退变按Pfirrmann分级为Ⅲ级10例，Ⅳ级7例；Ⅲ、Ⅳ级患者年龄分别为（45.6 ± 3.3）岁和（45.1 ± 4.4）岁，差异无统计学意义（t=0.244，P=0.811）。
1.3 检测指标
1.3.1 SA-β-gal活性检测
取髓核标本制备15 μm厚切片，加入1 mL SA-β-gal染色固定液室温固定15 min；弃固定液，PBS洗3遍，加入1 mL染色工作液（配制方法：SA-β-gal染色液A 10 μL，SA-β-gal染色液B 10 μL，SA-β-gal染色液C 930 μL，X-gal溶液50 μL），37℃染色过夜。光镜下观察细胞染色情况，绿染细胞为SA-β-gal阳性细胞。随机取5个高倍视野（×250倍）计数细胞，计算阳性细胞百分比。
1.3.2 免疫组织化学染色观察
取髓核标本制备4 μm厚切片，二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水；阻断、灭活内源性过氧化物酶，抗原修复，正常羊血清工作液封闭；滴加兔抗人Aggrecan多克隆抗体、兔抗人ADAMTS 5多克隆抗体、兔抗人Sox-9多克隆抗体、鼠抗人p16INK4a多克隆抗体一抗，4℃孵育过夜，PBS洗3遍，滴加羊抗兔或羊抗鼠二抗37℃孵育15 min，PBS洗3遍，滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶，37℃孵育15 min，PBS洗3遍；DAB反应染色，苏木素复染，封片。光镜下观察目的抗原表达情况，阳性表达呈棕黄色或棕褐色。随机取5个高倍视野（×250倍），计算阳性细胞百分比。
1.3.3 Western blot检测
取髓核组织块置于匀浆器中，加裂解液（含苯甲基磺酰氟）充分匀浆，提取总蛋白。常规方法行SDS-PAGE，转膜。取出已封闭的PVDF膜，洗涤后置于含有兔抗人Aggrecan多克隆抗体、兔抗人ADAMTS 5多克隆抗体、兔抗人Sox-9多克隆抗体、鼠抗人p16INK4a多克隆抗体、兔抗人GAPDH多克隆抗体一抗的小袋中，室温孵育2 h；洗膜，将PVDF膜置于辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或羊抗鼠二抗中室温孵育1 h。取Western blot检测试剂盒ECL进行化学发光显色，采用凝胶成像分析仪进行吸光度（A）值扫描并进行半定量检测。
1.4 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；ADAMTS 5和p16INK4a蛋白表达相关性分析采用Bivariate过程。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 SA-β-gal活性检测
Ⅲ、Ⅳ级髓核组织内均可见呈绿染的SA-β-gal阳性NPCs，多呈簇状分布；Ⅲ级髓核组织内也可见到少量单个分布的绿染NPCs，细胞呈圆形，其外周由多层细胞外基质包裹；Ⅳ级髓核组织内难以见到单个分布的绿染NPCs。见图 1。Ⅲ、Ⅳ级髓核组织阳性细胞百分比分别为22.7% ± 5.4%和37.1% ± 7.6%，差异有统计学意义（t=—9.666，P=0.000）。
图1
Ⅲ、Ⅳ级髓核组织SA-β-gal染色观察（×400） ⓐⅢ级髓核组织 ⓑⅣ级髓核组织 图 2 Ⅲ、Ⅳ级髓核组织免疫组织化学染色观察（×250） ⓐⅢ级髓核组织p16INK4a ⓑⅣ级髓核组织p16INK4a ⓒⅢ级髓核组织ADAMTS 5 ⓓⅣ级髓核组织ADAMTS 5 ⓔⅢ级髓核组织Aggrecan ⓕⅣ级髓核组织Aggrecan ⓖⅢ级髓核组织Sox-9 ⓗⅣ级髓核组织Sox-9
Figure1.
SA-β-gal staining of NP with grade III or IV degeneration (×400) ⓐGrade III ⓑGrade IV Fig. 2 Immunohistochemistry staining of NP with grade III or IV degeneration (×250) ⓐp16INK4a of NP with grade III degeneration ⓑp16INK4a of NP with grade IV degeneration ⓒADAMTS 5 of NP with grade III degeneration ⓓADAMTS 5 of NP with grade IV degeneration ⓔAggrecan of NP with grade III degeneration ⓕAggrecan of NP with grade IV degeneration ⓖSox-9 of NP with grade III degeneration ⓗSox-9 of NP with grade IV degeneration
2.2 免疫组织化学染色观察
Ⅲ、Ⅳ级髓核组织内均可见到p16INK4a、ADAMTS 5、Aggrecan、Sox-9阳性的NPCs，颗粒呈棕褐色，分布于细胞质和细胞核内。其中Ⅲ级髓核组织中p16INK4a、ADAMTS 5阳性细胞内颗粒淡染，Aggrecan、Sox-9阳性细胞内颗粒浓聚；而Ⅳ级髓核组织中p16INK4a、ADAMTS 5阳性细胞内颗粒浓聚，Aggrecan、Sox-9阳性细胞内颗粒淡染。见图 2。
Ⅲ级髓核组织中p16INK4a、ADAMTS 5、Aggrecan、Sox-9染色阳性细胞百分比分别为26.5% ± 9.0%、24.7% ± 8.3%、42.2% ± 7.9%和38.6% ± 10.7%，Ⅳ级髓核组织中分别为39.3% ± 9.6%、40.4% ± 10.0%、22.3% ± 5.9%、25.3% ± 6.4%，两级间比较差异均有统计学意义（t=—6.272，P=0.000；t=—7.854，P=0.000；t=12.753，P=0.000；t=7.144，P=0.000）。
2.3 Western blot检测
Ⅲ、Ⅳ级髓核组织中均可见p16INK4a、ADAMTS 5、Aggrecan、Sox-9蛋白表达（图 3）。Ⅳ级髓核组织中p16INK4a、ADAMTS 5蛋白相对表达量明显多于Ⅲ级，而Aggrecan、Sox-9蛋白相对表达量明显少于Ⅲ级，差异均有统计学意义（t=—2.762，P=0.008；t=—2.581，P=0.013；t=5.826，P=0.000；t=3.611，P=0.001）。见图 4。两级髓核组织中ADAMTS 5与p16INK4a的蛋白相对表达量间成线性相关（r=0.908，P=0.000），见图 5。
图2
Western blot检测Ⅲ、Ⅳ级髓核组织中各目的蛋白表达Mr：相对分子质量 1：Ⅲ级髓核组织 2：Ⅳ级髓核组织 图 4 Western blot检测Ⅲ、Ⅳ级髓核组织中各目的蛋白相对表达量 图 5 退变髓核组织中p16INK4a与ADAMTS 5蛋白相对表达量的相关性
Figure2.
Protein expressions of NP with grade III or IV degeneration by Western blot Mr: Relative molecular mass 1: Grade III 2: Grade IV Fig. 4 Relative protein levels of Aggrecan,ADAMTS 5,Sox-9,and p16INK4a in NP with grade III or IV degeneration by Western blot Fig. 5 Correlation of p16INK4a and ADAMTS 5 protein expression in NP
3 讨论
下腰痛是脊柱外科常见疾患，发病率高，椎间盘退变是导致下腰痛最常见的原因[13-14]。椎间盘退变起源于髓核，多数研究认为髓核退变主要起因于NPCs和细胞外基质的改变[1, 15]。与多次分裂后端粒缩短引起的复制性衰老不同，应激诱导的过早衰老是由生长因子匮乏、营养障碍、异常细胞接触等应激因素诱发的分裂停滞[16-17]。椎间盘是人体最大的无血管组织，其含氧量低，任何可以引起髓核中氧自由基增加的因素均可导致NPCs过早衰老，如椎间盘长期承受不当应力、髓核周缘组织血管化等，继而导致有功能的NPCs数量减少、大量炎性因子和基质降解酶表达，从而恶化邻近正常细胞赖以生存的微环境，加速椎间盘退变[7, 13]。因此，需要探讨退变椎间盘中NPCs过早衰老的机制，为下一步选择合适的窗口期进行有效生物学干预提供依据。
Pfirrmann分级系统是在Thompson的大体形态学分类基础之上，利用MRI成像技术对退变椎间盘进行分级的一种方法[18]，目前已被广泛用于临床，我们依据该分级系统对收集的髓核组织进行分组。为排除增龄所致的复制性衰老影响，我们仅选取了腰椎间盘退变好发年龄段中40～50岁患者的髓核组织。该年龄段人群中PfirrmannⅠ级几乎不存在，Ⅱ级多无需手术治疗，Ⅴ级中已不存在髓核组织，因此我们仅对该年龄段中PfirrmannⅢ、Ⅳ级的髓核组织进行探讨。结果发现，Ⅲ、Ⅳ级髓核组织内均可见到SA-β-gal阳性NPCs，且Ⅳ级髓核组织中阳性细胞数明显增加。另外，在Ⅲ级髓核组织中阳性NPCs除少量呈单个分布外，多呈簇状分布，而Ⅳ级髓核组织中阳性NPCs呈簇状分布，考虑可能原因是：在退变中后期，NPCs通过代偿性增殖已不足以弥补其数量减少或功能降低[19]；而随着一部分衰老NPCs聚集，其释放的小分子物质导致了低水平炎症的发生，继而进一步引发邻近NPCs的衰老和组织衰退[10]。
研究表明，在人类很多衰老体细胞中均可见到p16INK4a表达累积现象；一些细胞中p16INK4a的激活会促进衰老相关异染色质灶的形成；生存环境压力胁迫、DNA损伤或染色体端粒受损等不仅是衰老的诱因，同时也是诱导p16INK4a表达的主要因素[6-8, 20]。因此，越来越多学者认可p16INK4a是细胞衰老的关键效应基因，它不仅能在一定程度上反映衰老进程，还可能对衰老细胞再生修复产生影响[10, 21]。p16INK4a通过抑制CDK4和CDK6激酶的活性，使磷酸化Rb蛋白维持在低磷酸化，从而使细胞处于生长抑制状态。我们检测发现，Ⅲ、Ⅳ级髓核组织内均可见p16INK4a阳性NPCs，且Ⅳ级中p16INK4a表达明显增强。NPCs为类软骨细胞，其表达Aggrecan等的表型特征与软骨细胞之间存在相似之处；相关研究[11- 12，15]也发现转录因子Sox-9在椎间盘组织中存在特定的表达及调控，且这种调控从胚胎时期就已开始并不断发挥作用，向退变的人椎间盘细胞中转染Sox-9基因，证实其可促进椎间盘细胞增殖、Ⅱ型胶原及Aggrecan的合成。我们检测发现Ⅳ级髓核组织内特异的转录因子Sox-9和Aggrecan的表达较Ⅲ级髓核组织中明显减少。说明p16INK4a参与的NPCs过早衰老与椎间盘退变的进程之间存在联系。
ADAMTS 5是降解Aggrecan的主要金属蛋白酶，我们进一步检测发现其表达在Ⅳ级髓核组织中明显增强，且与p16INK4a的表达成线性相关，说明p16INK4a参与的NPCs过早衰老对椎间盘退变的进程起着主导作用。但这与Kim等[6]的研究结果相反，他们认为是端粒介导的p53/p21途径在NPCs衰老过程中起主导作用，而非p16INK4a/磷酸化Rb途径，这一差异可能与所收集的髓核组织年龄段不同有关。
尽管由于标本来源的限制，本研究只对Ⅲ、Ⅳ级退变髓核组织进行了观测，但仍在一定程度上反映了p16INK4a参与的NPCs过早衰老在椎间盘退变进程中发挥的作用，为下一步通过生物学干预适时逆转NPCs过早衰老或清除衰老的NPCs，从而有效延缓椎间盘退变提供了新思路。另外，p16INK4a参与的NPCs过早衰老的启动有待进一步探讨。
