引用本文： 周晓囡, 吴嫣爽, 雷蕾. 猪来源异种细胞移植临床前研究进展. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(12): 1536-1539. doi: 10.7507/1002-1892.20140332 复制
细胞移植是将有功能的细胞植入人体内，以替代因退变、损伤、基因缺陷或自身免疫而毁损的细胞，从而达到治疗疾病的目的。采用人自体或同种异体细胞移植来源有限，且存在伦理问题，猪来源的异种细胞为细胞移植提供了另一个选择[1]。随着新型免疫抑制剂、免疫隔离技术及转基因猪[2]的诞生，猪来源异种细胞，包括神经细胞、胰岛细胞、肝细胞和各种类型干细胞在细胞移植方面取得了显著成果[1-5]。本文拟从普通体细胞和干细胞两方面，对猪来源异种细胞移植临床前研究进展作一总结。
1 普通体细胞的异种移植
1.1 异种神经细胞移植
细胞移植在治疗帕金森病方面具有巨大潜力，其中采用人胎儿脑神经母细胞移植被认为是最有效方法，但受到伦理限制。猪与灵长类动物大脑体积相似，且来源丰富、易进行基因修饰，神经突长度也与人类神经元类似，被认为是最合适的异种神经细胞来源[6]。1997年Deacon等[7]对1例帕金森患者行右侧纹状体注入胎猪脑神经细胞悬液治疗，患者在治疗后7个月死于肺栓塞，经观察其脑组织中发现了猪多巴胺能神经元及其他猪神经和神经胶质细胞，且猪神经元的轴突在宿主脑组织中有一定程度延伸。该研究首次用组织学方法证明了非人类多巴胺能神经元可在人脑中存在。
虽然动物学研究表明，与其他部位异种移植相比，宿主的大脑对异种移植物的排斥反应程度相对较低[8]，避免了急性排斥反应，但排斥反应仍然存在。目前随着免疫抑制剂的应用和转基因猪的诞生，T细胞介导的免疫排斥反应得到一定程度抑制。2007年Krystkowiak等[9]将人胎儿脑神经母细胞注入亨廷顿患者大脑后，患者出现体重下降、舞蹈症恶化、步态不稳等症状，在排除其他原因后，怀疑为同种异体免疫排斥反应，在使用免疫抑制剂后，患者以上症状得到恢复。大脑内能发生同种异体免疫排斥反应，也可能发生异种移植免疫排斥反应，因此需要寻找可降低大脑免疫排斥反应的方法。2005年产生了一种在神经元特异烯醇化酶启动子作用下表达hCTLA4-Ig（人细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白）免疫抑制剂蛋白的转基因猪，抑制hCTLA4-Ig表达后，能相应抑制CD4+T细胞介导的免疫排斥反应[10]。2010年这种转基因猪的中脑神经组织被植入帕金森猴模型的脑中，结果表明猪的中脑神经组织能在猴脑中存活，存活时间超过460 d[11]。
异种神经细胞移植已取得了很大进步，但距临床应用还有一定距离。如果异种移植免疫排斥反应得到有效控制，将促进猪异种神经细胞在临床的应用。
1.2 异种胰岛细胞移植
糖尿病是严重威胁人类生命健康的疾病之一，至今尚无根治方法。1986年Ricordi发明了“半自动化胰岛分离”的方法[12]；2000年Shapiro等[13]采用无糖皮质激素的免疫抑制方案对7例1型糖尿病患者经门静脉移植人胰岛细胞，移植后患者获血糖水平稳定，并且脱离胰岛素治疗长达1年。但同种胰岛细胞来源有限，限制了胰岛细胞移植的临床应用，因此人们将研究重点放在异种胰岛细胞移植。自1893年首次报道异种胰岛细胞移植开始，异种胰岛细胞移植已有100多年历史。异种胰岛细胞供体来源主要有猪、牛、猴等，其中猪胰岛素的氨基酸排列顺序以及血糖调定点与人接近，胰岛细胞来源充足，胰岛细胞在含人新鲜血清的培养基中能很好地存活与增殖，因此猪胰岛细胞被认为是最适合的移植供体[14]。猪胰岛素已成功应用于临床数十年，充分证明了其纠正糖尿病高血糖状态的安全性和有效性。2006年Hering等[15]将猪胰岛细胞经肝门静脉注入糖尿病短尾猕猴体内，结果显示猴体内可重新建立血糖控制机制逆转糖尿病达100 d。α-1，3半乳糖转移酶基因敲除（α-1，3-galactosyltransferase knockout，GTKO）猪和CTLA4-Ig猪出现后，从这些基因改造猪中获得的胰岛细胞抗原性明显降低，避免了超急性免疫排斥反应和T细胞介导的免疫排斥反应发生，延长了猪胰岛细胞在非人灵长类动物中存活时间[16-17]。
然而，猪来源的异种胰岛细胞移植仍面临很多问题，如进一步降低移植物的抗原性以减少免疫抑制剂用量，以及避免猪内源性逆转录病毒感染的可能性。为此人们采用免疫隔离方案如胰岛微囊化技术来防止免疫排斥，在不使用免疫抑制剂的情况下延长移植胰岛细胞的存活时间[18-21]。新型胰岛细胞提取技术、免疫隔离技术和新的免疫抑制剂的出现，也加快了异种胰岛细胞移植的发展速度。
1.3 异种肝细胞移植
目前肝细胞移植术已应用于临床，是一种能有效治疗终末期肝病和遗传代谢性肝病的方法，也是等待原位肝移植的过渡性治疗方法之一[22]。目前肝细胞的主要来源是不适于肝移植的肝脏[23]，以及作劈离式肝移植时，在保证劈离的2块肝组织能满足患者肝移植后，切取的第4肝段[24]。除人原代肝细胞外，异种肝细胞[25]也是来源之一，特别是猪来源肝细胞。2007年Nagata等[26]将猪肝细胞用1%海藻酸钠制成细胞悬液，注入猕猴脾脏内，肝细胞最终存活了253 d。异种肝细胞移植存在的免疫排斥反应较大，除应用免疫抑制剂和转基因猪外，也可使用微囊包被肝细胞进行输注。微囊化的肝细胞能使细胞生长所需物质通过半透膜，而宿主的免疫细胞、免疫球蛋白及补体则不能通过，因此延长了肝细胞在宿主内存活时间，且避免了免疫排斥反应[27]。异种肝细胞移植可解决肝细胞来源短缺问题，但如何降低和避免免疫排斥反应和种间逆转录病毒的传播仍需要深入研究。
2 异种干细胞移植
2.1 异种MSCs移植
目前临床上进行的自体或同种异体MSCs移植，MSCs主要来自于人骨髓、脐带血和脂肪等。由于移植所需MSCs数量较大，供体细胞无法满足临床需求[4]，故需寻找其他MSCs来源。研究表明人对GTKO猪MSCs的免疫排斥反应与对人MSCs免疫排斥反应类似[28-29]，如果将GTKO猪转入人类的补体调节基因或免疫抑制基因，则会保护MSCs免受人类体液免疫和细胞免疫，在一定程度上避免了种间免疫排斥反应。截至2011年底共有94例关于异种MSCs移植的报道，其中88例（93.6%）移植成功[4]。这些研究结果表明MSCs是可以跨越种族屏障在异种体内存在。
2007年Nakamura等[30]将猪BMSCs在体外传代培养至一定代次后，注入心肌梗死的非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷（non-obese diabetic/severe combined immunodeficient，NOD/SCID）小鼠的梗死灶内，BMSCs在小鼠心肌梗死区内至少存活4周，左心室射血分数与梗死区注射生理盐水的对照组相比有明显改善。2008年Eguchi等[31]将猪髂骨来源的BMSCs联合猪椎骨内骨髓细胞，共同注入经全身辐射的NOD/SCID小鼠双侧胫骨骨髓腔内，6周后小鼠骨髓异种嵌合率明显高于仅注射骨髓细胞的对照组。说明BMSCs可在异种动物体内进行短暂移植，并改善其功能。猪来源MSCs是否能用于灵长类动物，目前尚缺乏有效的实验数据证明，其可行性以及免疫排斥和种间病毒传播等情况有待进一步研究。
2.2 异种造血干细胞移植
造血干细胞移植是指在患者接受超剂量化疗或放疗后，将各种来源的骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞或脐带血造血干细胞通过静脉输注移植入患者体内，重建被摧毁或已衰竭的造血及免疫功能。自1955年Thomas首先开展骨髓造血干细胞移植以来，该方法已广泛用于血液病的临床治疗，已成为治疗恶性血液病、重型再生障碍性贫血及部分实体瘤等疾病的最有效方法，但存在造血干细胞来源有限、数量少以及人类白细胞抗原匹配等问题。为进一步丰富造血干细胞的来源，人们进行了异种造血干细胞来源的探索。
1999年Sablinski等[32]首次尝试将猪骨髓移植入恒河猴体内。术前所有猴均行脾切除和全身辐射，术后使用免疫抑制剂，其中1只猴同时静脉输注猪特异IL-3和干细胞生长因子；结果发现接受了IL-3和干细胞生长因子的猴在移植后180 d和302 d观测到了细胞嵌合现象，而其余猴未见该现象。研究者认为细胞未能长期嵌合可能与猪造血祖细胞在猴体内成熟后表达半乳糖有关。2004年Tseng等[33]首次尝试将GTKO猪骨髓移植入3只狒狒体内，其中1只狒狒于术后6 d因突发出血死亡，余2只狒狒分别于9～16 d和7～17 d在血液中检测到少量猪细胞（< 1%），说明骨髓移植可能转移；整个实验过程中除了宿主对移植细胞的低反应性延长外，未发现长时间的移植嵌合。随着新型免疫抑制剂的出现和转基因猪的应用，有望使异种嵌合的效率和时间大大延长。
2.3 异种脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）移植
ADSCs易从脂肪组织中获得，在体外具有稳定的扩增能力，并且在适当诱导条件下可分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和肌细胞等。ADSCs因缺乏人类白细胞抗原-DR表达，能抑制异源活化的淋巴细胞增殖[34-35]和炎性因子产生，刺激抗炎性因子产生[36-37]等，已被证明有免疫特权。目前ADSCs被广泛应用于再生医学，如整形美容、心肌梗死、神经退行性疾病和骨组织缺陷等方面的研究，除了同种异体ADSCs移植外，研究者们也进行了异种移植研究[5]。因为相比人类自体或同种异体移植，异种移植脂肪来源更丰富，尤其是猪来源脂肪组织。
Lin等[5]将2012年之前有关ADSCs的异种移植研究进行了统计，发现有27例异种移植实验是将人类ADSCs移植至非人类动物体内。其中2003年报道了首例异种ADSCs移植，研究者将人ADSCs移植入大脑缺血的大鼠脑组织内，发现大鼠神经功能有所改善[38]。2014年Ghasemi等[39]将人ADSCs移植入溶血卵磷脂所致的局部髓鞘病变大鼠脊髓内，大鼠运动功能有所改善，该研究结果表明人ADSCs能够分化为少突胶质细胞，并促进髓鞘再生。2013年Zhu等[40]将猪ADSCs通过肝门静脉移植入慢加急性肝衰竭模型的兔体内，结果表明ADSCs能延长兔存活时间，改善肝功能，并有分化为肝细胞的趋势。
异种ADSCs由于易获得、来源丰富、可重复强、免疫特权等优点得到了科学家的青睐，但是也存在很多问题需要解决[5]，如ADSCs无统一鉴别标准、ADSCs向神经系统分化还未明确等。
3 小结
异种细胞移植与同种细胞移植相比，虽然免疫排斥反应相应增加，但在来源和数量上具有较大优势，可重复性强。尤其是猪源细胞，与其他非灵长类动物相比，猪与人类在体型、生理和解剖结构上更相似，且来源丰富，取材相对容易。随着GTKO猪的出现，异种细胞移植取得了较快发展，目前已涉及多个器官、组织和细胞。近年来SCID猪[41]和微囊化包被细胞技术的出现，也为异种细胞移植提供了更为便利的条件。相信随着新型免疫抑制剂的出现、组织工程技术的进步以及转基因猪的产生，猪可能成为人类器官、组织和细胞主要来源。
细胞移植是将有功能的细胞植入人体内，以替代因退变、损伤、基因缺陷或自身免疫而毁损的细胞，从而达到治疗疾病的目的。采用人自体或同种异体细胞移植来源有限，且存在伦理问题，猪来源的异种细胞为细胞移植提供了另一个选择[1]。随着新型免疫抑制剂、免疫隔离技术及转基因猪[2]的诞生，猪来源异种细胞，包括神经细胞、胰岛细胞、肝细胞和各种类型干细胞在细胞移植方面取得了显著成果[1-5]。本文拟从普通体细胞和干细胞两方面，对猪来源异种细胞移植临床前研究进展作一总结。
1 普通体细胞的异种移植
1.1 异种神经细胞移植
细胞移植在治疗帕金森病方面具有巨大潜力，其中采用人胎儿脑神经母细胞移植被认为是最有效方法，但受到伦理限制。猪与灵长类动物大脑体积相似，且来源丰富、易进行基因修饰，神经突长度也与人类神经元类似，被认为是最合适的异种神经细胞来源[6]。1997年Deacon等[7]对1例帕金森患者行右侧纹状体注入胎猪脑神经细胞悬液治疗，患者在治疗后7个月死于肺栓塞，经观察其脑组织中发现了猪多巴胺能神经元及其他猪神经和神经胶质细胞，且猪神经元的轴突在宿主脑组织中有一定程度延伸。该研究首次用组织学方法证明了非人类多巴胺能神经元可在人脑中存在。
虽然动物学研究表明，与其他部位异种移植相比，宿主的大脑对异种移植物的排斥反应程度相对较低[8]，避免了急性排斥反应，但排斥反应仍然存在。目前随着免疫抑制剂的应用和转基因猪的诞生，T细胞介导的免疫排斥反应得到一定程度抑制。2007年Krystkowiak等[9]将人胎儿脑神经母细胞注入亨廷顿患者大脑后，患者出现体重下降、舞蹈症恶化、步态不稳等症状，在排除其他原因后，怀疑为同种异体免疫排斥反应，在使用免疫抑制剂后，患者以上症状得到恢复。大脑内能发生同种异体免疫排斥反应，也可能发生异种移植免疫排斥反应，因此需要寻找可降低大脑免疫排斥反应的方法。2005年产生了一种在神经元特异烯醇化酶启动子作用下表达hCTLA4-Ig（人细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白）免疫抑制剂蛋白的转基因猪，抑制hCTLA4-Ig表达后，能相应抑制CD4+T细胞介导的免疫排斥反应[10]。2010年这种转基因猪的中脑神经组织被植入帕金森猴模型的脑中，结果表明猪的中脑神经组织能在猴脑中存活，存活时间超过460 d[11]。
异种神经细胞移植已取得了很大进步，但距临床应用还有一定距离。如果异种移植免疫排斥反应得到有效控制，将促进猪异种神经细胞在临床的应用。
1.2 异种胰岛细胞移植
糖尿病是严重威胁人类生命健康的疾病之一，至今尚无根治方法。1986年Ricordi发明了“半自动化胰岛分离”的方法[12]；2000年Shapiro等[13]采用无糖皮质激素的免疫抑制方案对7例1型糖尿病患者经门静脉移植人胰岛细胞，移植后患者获血糖水平稳定，并且脱离胰岛素治疗长达1年。但同种胰岛细胞来源有限，限制了胰岛细胞移植的临床应用，因此人们将研究重点放在异种胰岛细胞移植。自1893年首次报道异种胰岛细胞移植开始，异种胰岛细胞移植已有100多年历史。异种胰岛细胞供体来源主要有猪、牛、猴等，其中猪胰岛素的氨基酸排列顺序以及血糖调定点与人接近，胰岛细胞来源充足，胰岛细胞在含人新鲜血清的培养基中能很好地存活与增殖，因此猪胰岛细胞被认为是最适合的移植供体[14]。猪胰岛素已成功应用于临床数十年，充分证明了其纠正糖尿病高血糖状态的安全性和有效性。2006年Hering等[15]将猪胰岛细胞经肝门静脉注入糖尿病短尾猕猴体内，结果显示猴体内可重新建立血糖控制机制逆转糖尿病达100 d。α-1，3半乳糖转移酶基因敲除（α-1，3-galactosyltransferase knockout，GTKO）猪和CTLA4-Ig猪出现后，从这些基因改造猪中获得的胰岛细胞抗原性明显降低，避免了超急性免疫排斥反应和T细胞介导的免疫排斥反应发生，延长了猪胰岛细胞在非人灵长类动物中存活时间[16-17]。
然而，猪来源的异种胰岛细胞移植仍面临很多问题，如进一步降低移植物的抗原性以减少免疫抑制剂用量，以及避免猪内源性逆转录病毒感染的可能性。为此人们采用免疫隔离方案如胰岛微囊化技术来防止免疫排斥，在不使用免疫抑制剂的情况下延长移植胰岛细胞的存活时间[18-21]。新型胰岛细胞提取技术、免疫隔离技术和新的免疫抑制剂的出现，也加快了异种胰岛细胞移植的发展速度。
1.3 异种肝细胞移植
目前肝细胞移植术已应用于临床，是一种能有效治疗终末期肝病和遗传代谢性肝病的方法，也是等待原位肝移植的过渡性治疗方法之一[22]。目前肝细胞的主要来源是不适于肝移植的肝脏[23]，以及作劈离式肝移植时，在保证劈离的2块肝组织能满足患者肝移植后，切取的第4肝段[24]。除人原代肝细胞外，异种肝细胞[25]也是来源之一，特别是猪来源肝细胞。2007年Nagata等[26]将猪肝细胞用1%海藻酸钠制成细胞悬液，注入猕猴脾脏内，肝细胞最终存活了253 d。异种肝细胞移植存在的免疫排斥反应较大，除应用免疫抑制剂和转基因猪外，也可使用微囊包被肝细胞进行输注。微囊化的肝细胞能使细胞生长所需物质通过半透膜，而宿主的免疫细胞、免疫球蛋白及补体则不能通过，因此延长了肝细胞在宿主内存活时间，且避免了免疫排斥反应[27]。异种肝细胞移植可解决肝细胞来源短缺问题，但如何降低和避免免疫排斥反应和种间逆转录病毒的传播仍需要深入研究。
2 异种干细胞移植
2.1 异种MSCs移植
目前临床上进行的自体或同种异体MSCs移植，MSCs主要来自于人骨髓、脐带血和脂肪等。由于移植所需MSCs数量较大，供体细胞无法满足临床需求[4]，故需寻找其他MSCs来源。研究表明人对GTKO猪MSCs的免疫排斥反应与对人MSCs免疫排斥反应类似[28-29]，如果将GTKO猪转入人类的补体调节基因或免疫抑制基因，则会保护MSCs免受人类体液免疫和细胞免疫，在一定程度上避免了种间免疫排斥反应。截至2011年底共有94例关于异种MSCs移植的报道，其中88例（93.6%）移植成功[4]。这些研究结果表明MSCs是可以跨越种族屏障在异种体内存在。
2007年Nakamura等[30]将猪BMSCs在体外传代培养至一定代次后，注入心肌梗死的非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷（non-obese diabetic/severe combined immunodeficient，NOD/SCID）小鼠的梗死灶内，BMSCs在小鼠心肌梗死区内至少存活4周，左心室射血分数与梗死区注射生理盐水的对照组相比有明显改善。2008年Eguchi等[31]将猪髂骨来源的BMSCs联合猪椎骨内骨髓细胞，共同注入经全身辐射的NOD/SCID小鼠双侧胫骨骨髓腔内，6周后小鼠骨髓异种嵌合率明显高于仅注射骨髓细胞的对照组。说明BMSCs可在异种动物体内进行短暂移植，并改善其功能。猪来源MSCs是否能用于灵长类动物，目前尚缺乏有效的实验数据证明，其可行性以及免疫排斥和种间病毒传播等情况有待进一步研究。
2.2 异种造血干细胞移植
造血干细胞移植是指在患者接受超剂量化疗或放疗后，将各种来源的骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞或脐带血造血干细胞通过静脉输注移植入患者体内，重建被摧毁或已衰竭的造血及免疫功能。自1955年Thomas首先开展骨髓造血干细胞移植以来，该方法已广泛用于血液病的临床治疗，已成为治疗恶性血液病、重型再生障碍性贫血及部分实体瘤等疾病的最有效方法，但存在造血干细胞来源有限、数量少以及人类白细胞抗原匹配等问题。为进一步丰富造血干细胞的来源，人们进行了异种造血干细胞来源的探索。
1999年Sablinski等[32]首次尝试将猪骨髓移植入恒河猴体内。术前所有猴均行脾切除和全身辐射，术后使用免疫抑制剂，其中1只猴同时静脉输注猪特异IL-3和干细胞生长因子；结果发现接受了IL-3和干细胞生长因子的猴在移植后180 d和302 d观测到了细胞嵌合现象，而其余猴未见该现象。研究者认为细胞未能长期嵌合可能与猪造血祖细胞在猴体内成熟后表达半乳糖有关。2004年Tseng等[33]首次尝试将GTKO猪骨髓移植入3只狒狒体内，其中1只狒狒于术后6 d因突发出血死亡，余2只狒狒分别于9～16 d和7～17 d在血液中检测到少量猪细胞（< 1%），说明骨髓移植可能转移；整个实验过程中除了宿主对移植细胞的低反应性延长外，未发现长时间的移植嵌合。随着新型免疫抑制剂的出现和转基因猪的应用，有望使异种嵌合的效率和时间大大延长。
2.3 异种脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）移植
ADSCs易从脂肪组织中获得，在体外具有稳定的扩增能力，并且在适当诱导条件下可分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和肌细胞等。ADSCs因缺乏人类白细胞抗原-DR表达，能抑制异源活化的淋巴细胞增殖[34-35]和炎性因子产生，刺激抗炎性因子产生[36-37]等，已被证明有免疫特权。目前ADSCs被广泛应用于再生医学，如整形美容、心肌梗死、神经退行性疾病和骨组织缺陷等方面的研究，除了同种异体ADSCs移植外，研究者们也进行了异种移植研究[5]。因为相比人类自体或同种异体移植，异种移植脂肪来源更丰富，尤其是猪来源脂肪组织。
Lin等[5]将2012年之前有关ADSCs的异种移植研究进行了统计，发现有27例异种移植实验是将人类ADSCs移植至非人类动物体内。其中2003年报道了首例异种ADSCs移植，研究者将人ADSCs移植入大脑缺血的大鼠脑组织内，发现大鼠神经功能有所改善[38]。2014年Ghasemi等[39]将人ADSCs移植入溶血卵磷脂所致的局部髓鞘病变大鼠脊髓内，大鼠运动功能有所改善，该研究结果表明人ADSCs能够分化为少突胶质细胞，并促进髓鞘再生。2013年Zhu等[40]将猪ADSCs通过肝门静脉移植入慢加急性肝衰竭模型的兔体内，结果表明ADSCs能延长兔存活时间，改善肝功能，并有分化为肝细胞的趋势。
异种ADSCs由于易获得、来源丰富、可重复强、免疫特权等优点得到了科学家的青睐，但是也存在很多问题需要解决[5]，如ADSCs无统一鉴别标准、ADSCs向神经系统分化还未明确等。
3 小结
异种细胞移植与同种细胞移植相比，虽然免疫排斥反应相应增加，但在来源和数量上具有较大优势，可重复性强。尤其是猪源细胞，与其他非灵长类动物相比，猪与人类在体型、生理和解剖结构上更相似，且来源丰富，取材相对容易。随着GTKO猪的出现，异种细胞移植取得了较快发展，目前已涉及多个器官、组织和细胞。近年来SCID猪[41]和微囊化包被细胞技术的出现，也为异种细胞移植提供了更为便利的条件。相信随着新型免疫抑制剂的出现、组织工程技术的进步以及转基因猪的产生，猪可能成为人类器官、组织和细胞主要来源。