引用本文： 付维力, 李棋, 李箭. 富血小板血浆制备技术及其组分的研究进展. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(12): 1560-1564. doi: 10.7507/1002-1892.20140337 复制
富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）含有超过生理浓度数倍的血小板，作为一种自体血来源的产品，因获取过程创伤较小、制备简便及具有生物学治疗潜能等方面的优点，被广泛用于组织再生、创面修复、感染治疗和功能重建等领域[1-2]。PRP不仅能释放大量生长因子和细胞因子发挥重要的生物学修复功能，还参与了血小板凝固和纤维蛋白产生的止血和免疫应答进程。PRP发挥生物学治疗作用有赖于血小板分泌的蛋白分子和血浆信号蛋白等组分。目前，对于用于临床的PRP制备技术尚无统一标准，不同制备技术获得的PRP所含的血小板浓度和组分也不同，导致生物学治疗效果各异[3-8]。现就PRP的作用机制、制备、组分等相关研究热点作一总结。
1 PRP的作用机制
PRP生物学作用的发挥依赖于一系列序贯发生的级联细胞分子事件，通过多层次旁分泌/自分泌的蛋白因子介导损伤修复和组织再生过程。具体作用机制为：PRP激活后，血小板释放大量的活性因子促进组织形成，活性因子首先锚定相关细胞的增殖和迁移，再介导炎性反应和血管发生，然后调控细胞外基质蛋白合成和组织重塑[9]。PRP能用于组织修复，与其能释放大量信号分子构建有利于组织重建的微环境有关[10]。此外，PRP包含的生长因子和细胞因子在创伤愈合和组织重塑过程中也发挥了重要作用[11-12]。这些因子通过激活细胞表面受体来调控基因表达，介导细胞增殖、分化，以及参与基质降解和组织重建过程[13]。PRP提供的生长因子还能刺激新生血管形成，并为受损组织的再生增加血供和营养物质，尤其是血供有限和细胞更新较缓慢的肌肉骨骼组织，如软骨、肌腱、韧带等[14]。新生的血管将带来新的细胞并清除受损组织的碎片。PRP促进组织愈合的生物学机制及临床相关性见表 1。
表1
PRP的生物学机制及其临床相关性
Table1.
The biological mechanism of PRP and their clinical correlations
2 PRP的组分
PRP中含有高浓度血小板，血小板激活后能释放大量活性分子，以及少量的白细胞和红细胞[25]。血小板是PRP中最主要成分，其在止血、凝血及炎性反应等生理及病理过程中发挥重要作用。PRP中血小板浓度过高或过低都不利于组织愈合，有学者提出最有利于组织愈合的血小板浓度为（1.5～3.0）×106/μL，约为全血血小板生理浓度的3～8倍 [26]。在损伤炎症期后立即使用血小板对组织愈合可发挥最大作用，因此一些学者认为PRP给药时机选择的重要性甚至高于所含血小板的数量[27]。
PRP还含有对组织愈合存在潜在促进作用的其他细胞类型。CD34++细胞是来源于循环血单核细胞的一类干细胞，能为组织愈合创造最佳微环境[28]。由于白细胞对健康组织存在潜在的损伤，PRP制备时是否保留白细胞仍存在争议。一方面，白细胞在组织重建和免疫应答过程中发挥重要功能；另一方面，白细胞可能加剧炎性反应，例如在损伤炎症期，白细胞中的中性粒细胞产生过量的基质金属蛋白酶和IL，可能引起肌肉损伤。中性粒细胞是对抗病原微生物和局部炎性反应主要的防御系统，它还释放大量的蛋白酶和活性氧来对抗微生物[29]。另一类白细胞即单核-巨噬细胞，来源于循环血单核细胞，有助于组织损伤至修复过程中坏死物质的清除。白细胞如单核和多核粒细胞可锚定局部炎性反应，适当的炎性反应有利于组织修复进程；再者适当浓度的中性粒细胞还能控制感染[30]。含有一定浓度白细胞的PRP常用于预防关节置换和其他外科手术操作中可能发生的感染[31]。PRP中通常含有少量的红细胞，红细胞的主要功能是携带氧气，有利于组织修复。
此外，PRP中的PDGF、VEGF、bFGF等蛋白浓度较高[32]，因此有学者提出含有特定浓度生长因子的PRP有利于组织修复[33]。PDGF是组织愈合初期最关键的生长因子，能促进相关组织细胞，尤其是干细胞、成纤维细胞和软骨细胞的趋化和有丝分裂，还能趋化炎性细胞产生级联生长因子释放；TGF-β能促进细胞增殖和分化，基质合成；VEGF与内皮细胞表面受体结合后促进内皮细胞迁移和有丝分裂，刺激血管生成；HGF能协同VEGF促进血管化，但其促进骨分化作用尚不明确；bFGF和IGF在组织修复、成熟和重塑阶段都发挥重要作用[34-35]。PRP中还包括促迁移、黏附、增殖和分化的细胞因子和黏附分子等，如基质细胞衍生因子1α激活介导细胞迁移和归巢到修复区。PRP中各种生长因子在组织愈合的不同阶段和不同部位发挥不同的作用，形成错综复杂的信号分子调控网络。此外，PRP还能释放一些表现抑制作用的蛋白，如TGF-β1。PRP中凝血酶的准确作用尚不明确，凝血酶是纤维蛋白原向纤维蛋白转化的前提条件，还包括血小板分泌生长因子，有研究表明外源性凝血酶激活PRP可能降低脱钙骨基质诱导成骨的能力[36]。纤维蛋白也是PRP重要成分，它能产生一个合适的三维结构，为修复细胞提供良好支架，有利于生长因子的分泌和组织修复，还可收缩创面，促进凝血，刺激组织再生，促进创面闭合[37]。
3 PRP的制备
3.1 PRP的分离及采集方法
PRP的制备是基于血小板浓缩过程，根据全血不同成分的密度经梯度离心分离获得。首先无菌条件下采集自体静脉血于抗凝管中。PRP制备中最常用的抗凝剂是枸橼酸钠，它是一种较弱的钙螯合剂，可通过抑制凝血和血小板功能达到抗凝效果，用于PRP制备副作用较小[38-39]。将采集的自体静脉血采用2次离心血浆提取法获得PRP：第1阶段为相对低速离心（100×g，离心10 min），使血浆和血小板与红细胞和白细胞分开；第2阶段为相对高速离心（400×g，离心10 min），进一步浓缩PRP和分离贫血小板血浆组分，获得最佳的血小板浓度[40]。离心后，各成分根据比重不同分为3层：下层为红细胞，中间层为白细胞和血小板，上层为淡黄色血浆层，吸取中间层混匀即为PRP。PRP在抗凝状态下一般可保存8 h。但目前对是否需要进行第2阶段离心仍存在争议，部分商业化产品均无这一步骤[41]。
3.2 血小板激活载体的选择
PRP必须通过激活血小板来释放生长因子，因此血小板激活载体的选择非常重要。既往研究采用牛凝血酶作为血小板激活载体，但近年研究表明其所含的抗牛凝血因子V抗体可与人凝血因子V交叉反应，引起凝血功能障碍，因此已不再使用[42]。目前较常用的血小板激活载体为氯化钙，其优点是安全、无朊蛋白或病毒暴露风险，但激活速度较慢，活化血小板至少需要20 min[43]。近年来，自体凝血酶试剂盒被认为是安全、快速、高效的血小板激活载体，它是通过将10%氯化钙和制备的少量PRP或血液混合装于带有负电荷粒子（例如玻璃纤维）的注射器中，室温条件下孵育10～15 min，然后过滤去除细胞和纤维蛋白成分，即可作为血小板激活载体用于激活血小板。采用该方法制备的自体凝血酶，常通过双针筒注射器与PRP同时注射[36]，经自体凝血酶活化血小板后，TGF-β1和PDGF-AB等生长因子会立即释放[44]。
3.3 不同制备方法对PRP组分的影响
目前，对于用于临床的PRP产品的制备技术尚无统一标准，主要涉及3个基本技术：①重力血小板封存（gravitationalplatelet sequestration，GPS）技术；②标准的细胞分离技术；③自体选择性细胞过滤技术（血小板过滤）。不同方法制备的PRP，其组分有一定差异[45-47]。目前已有多种商业化PRP制备装置，获得的血小板浓度、复苏率和组分均不相同（表 2）。任何PRP产品最终的血小板浓度取决于采集全血的体积、制备系统、离心力与温度和时间、血小板复苏率、悬浮一定浓度血小板的血浆体积、白细胞和/或红细胞的相对浓度、凝血酶的沾染、保存方法与时间，此外还与患者个体因素有关，如外周静脉血的参数、有无并发症、年龄和循环血中生长因子和细胞组分等，如血脂高将增加血小板浓度[48-49]。
表2
PRP的制备装置、血小板浓度、复苏率和组分
Table2.
PRP preparation devices,platelet concentration,recovery ratio,and components
4 展望
目前，不同的制备方法和技术参数可获得不同组分和不同浓度的PRP，为临床医生根据不同患者需要选择最适合的PRP产品奠定了基础。除了制备方法外，PRP的有效性还取决于使用方法、患者个体差异及适应证的选择等因素。相信随着这些问题的解决，PRP将更好地向临床转化。
富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）含有超过生理浓度数倍的血小板，作为一种自体血来源的产品，因获取过程创伤较小、制备简便及具有生物学治疗潜能等方面的优点，被广泛用于组织再生、创面修复、感染治疗和功能重建等领域[1-2]。PRP不仅能释放大量生长因子和细胞因子发挥重要的生物学修复功能，还参与了血小板凝固和纤维蛋白产生的止血和免疫应答进程。PRP发挥生物学治疗作用有赖于血小板分泌的蛋白分子和血浆信号蛋白等组分。目前，对于用于临床的PRP制备技术尚无统一标准，不同制备技术获得的PRP所含的血小板浓度和组分也不同，导致生物学治疗效果各异[3-8]。现就PRP的作用机制、制备、组分等相关研究热点作一总结。
1 PRP的作用机制
PRP生物学作用的发挥依赖于一系列序贯发生的级联细胞分子事件，通过多层次旁分泌/自分泌的蛋白因子介导损伤修复和组织再生过程。具体作用机制为：PRP激活后，血小板释放大量的活性因子促进组织形成，活性因子首先锚定相关细胞的增殖和迁移，再介导炎性反应和血管发生，然后调控细胞外基质蛋白合成和组织重塑[9]。PRP能用于组织修复，与其能释放大量信号分子构建有利于组织重建的微环境有关[10]。此外，PRP包含的生长因子和细胞因子在创伤愈合和组织重塑过程中也发挥了重要作用[11-12]。这些因子通过激活细胞表面受体来调控基因表达，介导细胞增殖、分化，以及参与基质降解和组织重建过程[13]。PRP提供的生长因子还能刺激新生血管形成，并为受损组织的再生增加血供和营养物质，尤其是血供有限和细胞更新较缓慢的肌肉骨骼组织，如软骨、肌腱、韧带等[14]。新生的血管将带来新的细胞并清除受损组织的碎片。PRP促进组织愈合的生物学机制及临床相关性见表 1。
表1
PRP的生物学机制及其临床相关性
Table1.
The biological mechanism of PRP and their clinical correlations
2 PRP的组分
PRP中含有高浓度血小板，血小板激活后能释放大量活性分子，以及少量的白细胞和红细胞[25]。血小板是PRP中最主要成分，其在止血、凝血及炎性反应等生理及病理过程中发挥重要作用。PRP中血小板浓度过高或过低都不利于组织愈合，有学者提出最有利于组织愈合的血小板浓度为（1.5～3.0）×106/μL，约为全血血小板生理浓度的3～8倍 [26]。在损伤炎症期后立即使用血小板对组织愈合可发挥最大作用，因此一些学者认为PRP给药时机选择的重要性甚至高于所含血小板的数量[27]。
PRP还含有对组织愈合存在潜在促进作用的其他细胞类型。CD34++细胞是来源于循环血单核细胞的一类干细胞，能为组织愈合创造最佳微环境[28]。由于白细胞对健康组织存在潜在的损伤，PRP制备时是否保留白细胞仍存在争议。一方面，白细胞在组织重建和免疫应答过程中发挥重要功能；另一方面，白细胞可能加剧炎性反应，例如在损伤炎症期，白细胞中的中性粒细胞产生过量的基质金属蛋白酶和IL，可能引起肌肉损伤。中性粒细胞是对抗病原微生物和局部炎性反应主要的防御系统，它还释放大量的蛋白酶和活性氧来对抗微生物[29]。另一类白细胞即单核-巨噬细胞，来源于循环血单核细胞，有助于组织损伤至修复过程中坏死物质的清除。白细胞如单核和多核粒细胞可锚定局部炎性反应，适当的炎性反应有利于组织修复进程；再者适当浓度的中性粒细胞还能控制感染[30]。含有一定浓度白细胞的PRP常用于预防关节置换和其他外科手术操作中可能发生的感染[31]。PRP中通常含有少量的红细胞，红细胞的主要功能是携带氧气，有利于组织修复。
此外，PRP中的PDGF、VEGF、bFGF等蛋白浓度较高[32]，因此有学者提出含有特定浓度生长因子的PRP有利于组织修复[33]。PDGF是组织愈合初期最关键的生长因子，能促进相关组织细胞，尤其是干细胞、成纤维细胞和软骨细胞的趋化和有丝分裂，还能趋化炎性细胞产生级联生长因子释放；TGF-β能促进细胞增殖和分化，基质合成；VEGF与内皮细胞表面受体结合后促进内皮细胞迁移和有丝分裂，刺激血管生成；HGF能协同VEGF促进血管化，但其促进骨分化作用尚不明确；bFGF和IGF在组织修复、成熟和重塑阶段都发挥重要作用[34-35]。PRP中还包括促迁移、黏附、增殖和分化的细胞因子和黏附分子等，如基质细胞衍生因子1α激活介导细胞迁移和归巢到修复区。PRP中各种生长因子在组织愈合的不同阶段和不同部位发挥不同的作用，形成错综复杂的信号分子调控网络。此外，PRP还能释放一些表现抑制作用的蛋白，如TGF-β1。PRP中凝血酶的准确作用尚不明确，凝血酶是纤维蛋白原向纤维蛋白转化的前提条件，还包括血小板分泌生长因子，有研究表明外源性凝血酶激活PRP可能降低脱钙骨基质诱导成骨的能力[36]。纤维蛋白也是PRP重要成分，它能产生一个合适的三维结构，为修复细胞提供良好支架，有利于生长因子的分泌和组织修复，还可收缩创面，促进凝血，刺激组织再生，促进创面闭合[37]。
3 PRP的制备
3.1 PRP的分离及采集方法
PRP的制备是基于血小板浓缩过程，根据全血不同成分的密度经梯度离心分离获得。首先无菌条件下采集自体静脉血于抗凝管中。PRP制备中最常用的抗凝剂是枸橼酸钠，它是一种较弱的钙螯合剂，可通过抑制凝血和血小板功能达到抗凝效果，用于PRP制备副作用较小[38-39]。将采集的自体静脉血采用2次离心血浆提取法获得PRP：第1阶段为相对低速离心（100×g，离心10 min），使血浆和血小板与红细胞和白细胞分开；第2阶段为相对高速离心（400×g，离心10 min），进一步浓缩PRP和分离贫血小板血浆组分，获得最佳的血小板浓度[40]。离心后，各成分根据比重不同分为3层：下层为红细胞，中间层为白细胞和血小板，上层为淡黄色血浆层，吸取中间层混匀即为PRP。PRP在抗凝状态下一般可保存8 h。但目前对是否需要进行第2阶段离心仍存在争议，部分商业化产品均无这一步骤[41]。
3.2 血小板激活载体的选择
PRP必须通过激活血小板来释放生长因子，因此血小板激活载体的选择非常重要。既往研究采用牛凝血酶作为血小板激活载体，但近年研究表明其所含的抗牛凝血因子V抗体可与人凝血因子V交叉反应，引起凝血功能障碍，因此已不再使用[42]。目前较常用的血小板激活载体为氯化钙，其优点是安全、无朊蛋白或病毒暴露风险，但激活速度较慢，活化血小板至少需要20 min[43]。近年来，自体凝血酶试剂盒被认为是安全、快速、高效的血小板激活载体，它是通过将10%氯化钙和制备的少量PRP或血液混合装于带有负电荷粒子（例如玻璃纤维）的注射器中，室温条件下孵育10～15 min，然后过滤去除细胞和纤维蛋白成分，即可作为血小板激活载体用于激活血小板。采用该方法制备的自体凝血酶，常通过双针筒注射器与PRP同时注射[36]，经自体凝血酶活化血小板后，TGF-β1和PDGF-AB等生长因子会立即释放[44]。
3.3 不同制备方法对PRP组分的影响
目前，对于用于临床的PRP产品的制备技术尚无统一标准，主要涉及3个基本技术：①重力血小板封存（gravitationalplatelet sequestration，GPS）技术；②标准的细胞分离技术；③自体选择性细胞过滤技术（血小板过滤）。不同方法制备的PRP，其组分有一定差异[45-47]。目前已有多种商业化PRP制备装置，获得的血小板浓度、复苏率和组分均不相同（表 2）。任何PRP产品最终的血小板浓度取决于采集全血的体积、制备系统、离心力与温度和时间、血小板复苏率、悬浮一定浓度血小板的血浆体积、白细胞和/或红细胞的相对浓度、凝血酶的沾染、保存方法与时间，此外还与患者个体因素有关，如外周静脉血的参数、有无并发症、年龄和循环血中生长因子和细胞组分等，如血脂高将增加血小板浓度[48-49]。
表2
PRP的制备装置、血小板浓度、复苏率和组分
Table2.
PRP preparation devices,platelet concentration,recovery ratio,and components
4 展望
目前，不同的制备方法和技术参数可获得不同组分和不同浓度的PRP，为临床医生根据不同患者需要选择最适合的PRP产品奠定了基础。除了制备方法外，PRP的有效性还取决于使用方法、患者个体差异及适应证的选择等因素。相信随着这些问题的解决，PRP将更好地向临床转化。
