引用本文： 王小燕, 陈颖, 黄云超, 周友全, 赵光强, 叶联华, 雷玉洁, 汤琦. 表皮葡萄球菌生物膜形成相关基因在表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合生物膜形成中的作用研究. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(1): 63-68. doi: 10.7507/1002-1892.20150015 复制
表皮葡萄球菌是存在于人体皮肤和黏膜的重要条件致病菌，常随生物材料植入进入人体，并黏附在生物材料表面形成生物膜，导致术后感染反复发作、迁延不愈[1-3]。据报道，超过60%的感染性疾病与生物膜形成相关[4]。在感染治疗过程中，随着广谱抗生素、皮质类固醇制剂的应用，后期常合并多种微生物混合感染，导致治疗失败。研究显示，临床出现的多种微生物混合感染通常是由凝固酶阴性葡萄球菌尤其是表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合感染引起[5-6]。与单一微生物感染相比，混合微生物感染预后较差，死亡率是单一微生物感染的2倍[7]。目前国内外关于生物膜感染的研究多基于单一微生物感染[8-9]，表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合微生物感染研究较少，且多为生物膜观察报道。
聚氯乙烯气管导管作为修复重建外科常用的生物材料，单一微生物感染的相关研究已有报道[10-11]。本实验通过建立表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合生物膜模型，用结晶紫染色法半定量检测生物膜形成能力，二甲氧唑黄[（2，3 bis（2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl）5 〔（phenylamino）Carbonyl〕 2H tetrazolium hydroxide assay，XTT]比色法评价生物膜的体外生长动力学；扫描电镜观察生物膜超微结构；荧光定量PCR分析表皮葡萄球菌生物膜形成相关基因--胞间黏附素A（intercellular adhesion A，icaA）基因、纤维蛋白原结合蛋白（fibrinogen binding protein，fbe）基因、聚集相关蛋白（accumulation-associated protein，aap）基因的表达情况，旨在为生物材料植入所致混合微生物膜感染防治提供新思路。
1 材料与方法
1.1 实验菌株及材料
表皮葡萄球菌标准株ATCC35984购自美国典型菌种保藏中心，白假丝酵母菌标准株ATCC10231购自中国科学院微生物研究所。聚氯乙烯气管导管购自杭州坦帕医疗科技有限公司。
1.2 主要试剂及仪器
MH琼脂平板（郑州安图生物工程股份有限公司）；沙保罗琼脂平板（郑州安图生物工程股份有限公司）；胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth，TSB）培养基（广东环凯微生物科技有限公司）；XTT细菌增殖及细菌毒性检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；PBS（上海立菲生物技术有限公司）；TRNzol-A+、FastQuant cDNA第1链合成试剂盒、SuperReal荧光定量试剂盒（北京天根生化科技有限公司）。多功能酶标仪（Thermo公司，美国）；扫描电镜（HITACHI公司，日本）；荧光定量PCR仪（ABI公司，美国）。
1.3 实验分组及方法
实验分为3组，单纯表皮葡萄球菌ATCC35984培养组（表葡组）、单纯白假丝酵母菌ATCC10231培养组（白念组）、表皮葡萄球菌ATCC35984和白假丝酵母菌ATCC10231混合培养组（混合组）。
将冻存的表皮葡萄球菌ATCC35984接种至MH琼脂平板，白假丝酵母菌ATCC10231接种至沙保罗琼脂平板，于35℃培养24 h，接种环挑取平板上单个菌落，分别接种至含5 mL TSB培养基的试管中，然后将试管放入恒温振荡器中，以35℃、90转/ min培养16～18 h。待菌细胞生长至对数生长期后，用TSB培养基调整菌液浓度为1×106CFU/mL，即为表葡组和白念组。将调整浓度后的表葡组和白念组菌液按照1∶1配制即为混合组。菌液均为检测前新鲜配制。
1.4 观测指标
1.4.1 结晶紫染色法生物膜半定量检测
取各组菌液100 μL，接种于96孔板，置于35℃温箱培养，分别于培养后2、4、6、8、12、24、48、72 h，各组取10孔弃培养基，PBS洗去未黏附菌。将2%结晶紫100 μL加入孔内，35℃孵育30 min，PBS洗3次，加入DMSO溶解后，采用多功能酶标仪测定波长490 nm处的吸光度（A）值[12]；以A值大小反映黏附能力强弱，间接反映微生物形成生物膜的厚度。以只加入TSB培养基作为空白对照。以各实验组A值与空白对照A值差值作为最终检测值。实验重复6次。
1.4.2 XTT比色法生长动力学检测
同1.4.1方法接种培养生物膜，分别于上述各时间点各组取10孔，弃培养基，PBS洗去未黏附菌，各孔加入100 μL TSB培养基和20 μL XTT溶液，35℃继续避光孵育2 h。以只加入TSB培养基和XTT溶液作为空白对照。采用多功能酶标仪测定波长450 nm处A值，以A值大小反应菌细胞活度[13]。以各实验组A值与空白对照A值差值作为最终检测值。实验重复6次。
1.4.3 扫描电镜观察生物膜超微结构
取聚氯乙烯气管导管套囊，用打孔器制备直径0.8 cm的圆片，低温等离子灭菌器灭菌。将气管导管圆片置于24孔板中，每孔1片，分别加入各组菌液2 mL/孔，35℃温箱孵育24、72 h后取出气管导管圆片；PBS冲洗后置于3.5%戊二醛，4℃固定24 h；PBS冲洗3次，每次10 min；置于1%锇酸溶液，4℃固定2 h；乙醇梯度脱水，醋酸异戊酯置换20 min；叔丁醇40℃渗透2 h；-20℃冷冻、CO2临界点干燥、真空镀金。扫描电镜下观察气管导管圆片表面生物膜形成情况。
1.4.4 荧光定量PCR检测
荧光定量PCR分析表葡组及混合组中表皮葡萄球菌生物膜形成相关基因的表达。将气管导管圆片置于24孔板中，每孔1片，分别加入表葡组及混合组菌液2 mL/孔，各组10片。置于35℃温箱孵育，每24小时更换TSB培养基。孵育72 h取出气管导管圆片，按照TRNzol-A+操作步骤提取生物膜总RNA。使用FastQuant cDNA第1链合成试剂盒，逆转录成cDNA后，SuperReal荧光定量试剂盒行RT-PCR检测。参照文献[14-15]设计icaA、fbe、aap及16s RNA特异性引物，引物由Invitrogen公司合成，引物序列见表 1。95℃孵育15 min预变性，95℃孵育10 s变性，60℃ 31 s退火/延伸，共40个循环。以各目的基因与16sRNA表达比值作为其相对表达量。各样品重复测量3次。
表1
各目的基因引物序列及产物长度
Table1.
The primer sequence and length of product
1.5 统计学方法
采用SPSS11.5统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 结晶紫染色法生物膜半定量检测
混合组和表葡组均在培养12 h生物膜明显增厚，24 h出现迅速增长趋势，72 h混合组超过表葡组；白念组12 h出现生物膜，48 h出现明显增长趋势并维持至72 h。在整个培养周期，白念组生物膜厚度均低于混合组。组间比较，培养2、4、6、72 h表葡组A值低于混合组，但8、12、24、48 h高于混合组；除72 h差异无统计学意义（P＞0.05）外，其余各时间点两组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；白念组在2～72 h整个培养周期，A值均显著低于混合组，组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 1。
图1
各组不同时点结晶紫染色法生物膜半定量检测 2.2 XTT比色法生长动力学检测
XTT比色法生长动力学检测示，各组均在培养6 h生长加速，12～48 h维持高生长动力，72 h再次出现生长明显加快。混合组生长速度快于白念组，且48 h后超过表葡组。组间比较：混合组2、4、6、8、12、24 h时A值低于表葡组，48、72 h时高于表葡组；但除12 h两组差异有统计学意义（P＜0.05）外，其余各时间点两组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。混合组2、4 h时A值低于白念组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；6 h后各时间点混合组A值均显著高于白念组，组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 2。
2.3 扫描电镜观察
扫描电镜观察示，表葡组培养24 h可见表皮葡萄球菌生物膜呈团块状、蘑菇样，具有多层结构，初步形成成熟生物膜；72 h葡萄球菌生长更密集，形成层次更复杂、更成熟的生物膜。白念组培养24 h可见白假丝酵母菌形成的生物膜中有大量孢子及假菌丝，孢子与假菌丝形成密集排列的网状立体结构，孢子沿着菌丝成团聚集；72 h可见孢子及菌丝密集排列、相互交织，形成更为成熟的生物膜。混合组培养24 h可见表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌的孢子及假菌丝呈团块状混杂生长，在孢子与假菌丝形成立体网状结构中混有大量表皮葡萄球菌；72 h可见更多的表皮葡萄球菌黏附在白假丝酵母菌菌丝和孢子表面，几乎将菌丝和孢子完全包裹，生物膜更加成熟。见图 3。
2.4 荧光定量PCR检测
荧光定量PCR结果显示，培养72 h时混合组fbe、icaA、aap基因相对表达量分别为28.60±0.20、24.72±0.22及25.27±0.14，与表葡组的29.67±0.38、25.45±0.05及25.94±0.04相比，平均分别增高了1.93、1.52、1.46倍，差异均有统计学意义（t=4.737，P=0.009；t=4.231，P=0.013；t=3.119，P=0.036）。
3 讨论
近年来，随着生物材料的广泛应用，生物材料表面细菌生物膜感染已成为常见医院内感染。生物材料的植入不仅增加了细菌入侵宿主的途径，还降低了诱发机体感染的最低细菌数量。大量临床报道显示[5-7, 10]，混合微生物感染的发病率逐年升高，且混合微生物感染较单一微生物感染更易出现耐药，治疗效果不佳、病情反复明显。综合分析本研究结晶紫半定量检测、XTT比色法生长动力学检测及扫描电镜观察结果，提示表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌同时存在于生物材料表面后，能形成较单一微生物生长动力学更高以及结构更致密、更复杂的混合生物膜；表皮葡萄球菌黏附在白假丝酵母菌菌丝及孢子表面，使抗菌药物更难发挥作用及抗真菌能效降低，这可能是临床表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合感染耐药性增加、病情迁延不愈的原因。
表皮葡萄球菌icaA基因编码的多糖胞间黏附素（polysaccharide intercellular adhesion，PIA）、aap基因编码的聚集相关蛋白（Aap）、fbe基因编码的纤维蛋白原结合蛋白（Fbe）参与了生物膜形成。在表皮葡萄球菌形成生物膜的黏附阶段，fbe基因编码合成Fbe，与宿主纤维蛋白原结合，介导表皮葡萄球菌黏附于生物材料表面，促使生物膜形成。在细菌增殖和聚集阶段则通过PIA、Aap等因子发挥作用。研究表明，在表皮葡萄球菌生物膜形成所致感染中，ica基因在生物膜形成过程中起重要作用[16-17]。其编码的PIA不仅参与生物膜形成，还与生物膜耐药性密切相关，并影响生物膜的立体结构，是目前发现的与表皮葡萄球菌致病性关系最为密切的因子。国内外研究显示，ica基因阴性的表皮葡萄球菌通过aap基因编码的Aap形成蛋白依赖的生物膜，说明Aap作为聚集阶段的另一重要因子，在生物膜形成中发挥一定作用[18-19]。宋超等[20]研究发现，假单胞菌属、克雷白菌属、链球菌菌属存在伴随生长关系，在生物膜形成过程中相互作用。本研究荧光定量PCR结果显示，与表葡组相比，混合组 fbe、icaA、aap基因表达量分别增高1.93、1.52、1.46倍。结合宋超等[20]研究结果，我们分析在混合生物膜形成过程中，可能存在细菌与真菌之间不同水平相互作用，通过不同通路使表皮葡萄球菌icaA、fbe、aap表达量上调，在混合生物膜形成中起重要作用。
目前，临床生物材料相关感染多为混合生物膜感染，国内外有关研究集中在生物膜观察、可能药物预防等方面[21-22]，对发生机制罕见报道。我们根据既往研究，设计并实施了本次研究，以期对临床常见生物材料相关混合微生物感染的防治提供思路。通过观察发现，表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合生长能形成较单一微生物更厚、结构更复杂的混合生物膜，进而导致慢性感染耐药及迁延不愈；混合生物膜较单一生物膜更厚，可能与表皮葡萄球菌icaA、fbe、aap基因表达增加有关。生物膜的形成与调控是多层次、多通路的复杂过程，除此基因之外还有哪些机制参与调控尚有待进一步研究。
表皮葡萄球菌是存在于人体皮肤和黏膜的重要条件致病菌，常随生物材料植入进入人体，并黏附在生物材料表面形成生物膜，导致术后感染反复发作、迁延不愈[1-3]。据报道，超过60%的感染性疾病与生物膜形成相关[4]。在感染治疗过程中，随着广谱抗生素、皮质类固醇制剂的应用，后期常合并多种微生物混合感染，导致治疗失败。研究显示，临床出现的多种微生物混合感染通常是由凝固酶阴性葡萄球菌尤其是表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合感染引起[5-6]。与单一微生物感染相比，混合微生物感染预后较差，死亡率是单一微生物感染的2倍[7]。目前国内外关于生物膜感染的研究多基于单一微生物感染[8-9]，表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合微生物感染研究较少，且多为生物膜观察报道。
聚氯乙烯气管导管作为修复重建外科常用的生物材料，单一微生物感染的相关研究已有报道[10-11]。本实验通过建立表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合生物膜模型，用结晶紫染色法半定量检测生物膜形成能力，二甲氧唑黄[（2，3 bis（2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl）5 〔（phenylamino）Carbonyl〕 2H tetrazolium hydroxide assay，XTT]比色法评价生物膜的体外生长动力学；扫描电镜观察生物膜超微结构；荧光定量PCR分析表皮葡萄球菌生物膜形成相关基因--胞间黏附素A（intercellular adhesion A，icaA）基因、纤维蛋白原结合蛋白（fibrinogen binding protein，fbe）基因、聚集相关蛋白（accumulation-associated protein，aap）基因的表达情况，旨在为生物材料植入所致混合微生物膜感染防治提供新思路。
1 材料与方法
1.1 实验菌株及材料
表皮葡萄球菌标准株ATCC35984购自美国典型菌种保藏中心，白假丝酵母菌标准株ATCC10231购自中国科学院微生物研究所。聚氯乙烯气管导管购自杭州坦帕医疗科技有限公司。
1.2 主要试剂及仪器
MH琼脂平板（郑州安图生物工程股份有限公司）；沙保罗琼脂平板（郑州安图生物工程股份有限公司）；胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth，TSB）培养基（广东环凯微生物科技有限公司）；XTT细菌增殖及细菌毒性检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；PBS（上海立菲生物技术有限公司）；TRNzol-A+、FastQuant cDNA第1链合成试剂盒、SuperReal荧光定量试剂盒（北京天根生化科技有限公司）。多功能酶标仪（Thermo公司，美国）；扫描电镜（HITACHI公司，日本）；荧光定量PCR仪（ABI公司，美国）。
1.3 实验分组及方法
实验分为3组，单纯表皮葡萄球菌ATCC35984培养组（表葡组）、单纯白假丝酵母菌ATCC10231培养组（白念组）、表皮葡萄球菌ATCC35984和白假丝酵母菌ATCC10231混合培养组（混合组）。
将冻存的表皮葡萄球菌ATCC35984接种至MH琼脂平板，白假丝酵母菌ATCC10231接种至沙保罗琼脂平板，于35℃培养24 h，接种环挑取平板上单个菌落，分别接种至含5 mL TSB培养基的试管中，然后将试管放入恒温振荡器中，以35℃、90转/ min培养16～18 h。待菌细胞生长至对数生长期后，用TSB培养基调整菌液浓度为1×106CFU/mL，即为表葡组和白念组。将调整浓度后的表葡组和白念组菌液按照1∶1配制即为混合组。菌液均为检测前新鲜配制。
1.4 观测指标
1.4.1 结晶紫染色法生物膜半定量检测
取各组菌液100 μL，接种于96孔板，置于35℃温箱培养，分别于培养后2、4、6、8、12、24、48、72 h，各组取10孔弃培养基，PBS洗去未黏附菌。将2%结晶紫100 μL加入孔内，35℃孵育30 min，PBS洗3次，加入DMSO溶解后，采用多功能酶标仪测定波长490 nm处的吸光度（A）值[12]；以A值大小反映黏附能力强弱，间接反映微生物形成生物膜的厚度。以只加入TSB培养基作为空白对照。以各实验组A值与空白对照A值差值作为最终检测值。实验重复6次。
1.4.2 XTT比色法生长动力学检测
同1.4.1方法接种培养生物膜，分别于上述各时间点各组取10孔，弃培养基，PBS洗去未黏附菌，各孔加入100 μL TSB培养基和20 μL XTT溶液，35℃继续避光孵育2 h。以只加入TSB培养基和XTT溶液作为空白对照。采用多功能酶标仪测定波长450 nm处A值，以A值大小反应菌细胞活度[13]。以各实验组A值与空白对照A值差值作为最终检测值。实验重复6次。
1.4.3 扫描电镜观察生物膜超微结构
取聚氯乙烯气管导管套囊，用打孔器制备直径0.8 cm的圆片，低温等离子灭菌器灭菌。将气管导管圆片置于24孔板中，每孔1片，分别加入各组菌液2 mL/孔，35℃温箱孵育24、72 h后取出气管导管圆片；PBS冲洗后置于3.5%戊二醛，4℃固定24 h；PBS冲洗3次，每次10 min；置于1%锇酸溶液，4℃固定2 h；乙醇梯度脱水，醋酸异戊酯置换20 min；叔丁醇40℃渗透2 h；-20℃冷冻、CO2临界点干燥、真空镀金。扫描电镜下观察气管导管圆片表面生物膜形成情况。
1.4.4 荧光定量PCR检测
荧光定量PCR分析表葡组及混合组中表皮葡萄球菌生物膜形成相关基因的表达。将气管导管圆片置于24孔板中，每孔1片，分别加入表葡组及混合组菌液2 mL/孔，各组10片。置于35℃温箱孵育，每24小时更换TSB培养基。孵育72 h取出气管导管圆片，按照TRNzol-A+操作步骤提取生物膜总RNA。使用FastQuant cDNA第1链合成试剂盒，逆转录成cDNA后，SuperReal荧光定量试剂盒行RT-PCR检测。参照文献[14-15]设计icaA、fbe、aap及16s RNA特异性引物，引物由Invitrogen公司合成，引物序列见表 1。95℃孵育15 min预变性，95℃孵育10 s变性，60℃ 31 s退火/延伸，共40个循环。以各目的基因与16sRNA表达比值作为其相对表达量。各样品重复测量3次。
表1
各目的基因引物序列及产物长度
Table1.
The primer sequence and length of product
1.5 统计学方法
采用SPSS11.5统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 结晶紫染色法生物膜半定量检测
混合组和表葡组均在培养12 h生物膜明显增厚，24 h出现迅速增长趋势，72 h混合组超过表葡组；白念组12 h出现生物膜，48 h出现明显增长趋势并维持至72 h。在整个培养周期，白念组生物膜厚度均低于混合组。组间比较，培养2、4、6、72 h表葡组A值低于混合组，但8、12、24、48 h高于混合组；除72 h差异无统计学意义（P＞0.05）外，其余各时间点两组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；白念组在2～72 h整个培养周期，A值均显著低于混合组，组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 1。
图1
各组不同时点结晶紫染色法生物膜半定量检测 2.2 XTT比色法生长动力学检测
XTT比色法生长动力学检测示，各组均在培养6 h生长加速，12～48 h维持高生长动力，72 h再次出现生长明显加快。混合组生长速度快于白念组，且48 h后超过表葡组。组间比较：混合组2、4、6、8、12、24 h时A值低于表葡组，48、72 h时高于表葡组；但除12 h两组差异有统计学意义（P＜0.05）外，其余各时间点两组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。混合组2、4 h时A值低于白念组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；6 h后各时间点混合组A值均显著高于白念组，组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 2。
2.3 扫描电镜观察
扫描电镜观察示，表葡组培养24 h可见表皮葡萄球菌生物膜呈团块状、蘑菇样，具有多层结构，初步形成成熟生物膜；72 h葡萄球菌生长更密集，形成层次更复杂、更成熟的生物膜。白念组培养24 h可见白假丝酵母菌形成的生物膜中有大量孢子及假菌丝，孢子与假菌丝形成密集排列的网状立体结构，孢子沿着菌丝成团聚集；72 h可见孢子及菌丝密集排列、相互交织，形成更为成熟的生物膜。混合组培养24 h可见表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌的孢子及假菌丝呈团块状混杂生长，在孢子与假菌丝形成立体网状结构中混有大量表皮葡萄球菌；72 h可见更多的表皮葡萄球菌黏附在白假丝酵母菌菌丝和孢子表面，几乎将菌丝和孢子完全包裹，生物膜更加成熟。见图 3。
2.4 荧光定量PCR检测
荧光定量PCR结果显示，培养72 h时混合组fbe、icaA、aap基因相对表达量分别为28.60±0.20、24.72±0.22及25.27±0.14，与表葡组的29.67±0.38、25.45±0.05及25.94±0.04相比，平均分别增高了1.93、1.52、1.46倍，差异均有统计学意义（t=4.737，P=0.009；t=4.231，P=0.013；t=3.119，P=0.036）。
3 讨论
近年来，随着生物材料的广泛应用，生物材料表面细菌生物膜感染已成为常见医院内感染。生物材料的植入不仅增加了细菌入侵宿主的途径，还降低了诱发机体感染的最低细菌数量。大量临床报道显示[5-7, 10]，混合微生物感染的发病率逐年升高，且混合微生物感染较单一微生物感染更易出现耐药，治疗效果不佳、病情反复明显。综合分析本研究结晶紫半定量检测、XTT比色法生长动力学检测及扫描电镜观察结果，提示表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌同时存在于生物材料表面后，能形成较单一微生物生长动力学更高以及结构更致密、更复杂的混合生物膜；表皮葡萄球菌黏附在白假丝酵母菌菌丝及孢子表面，使抗菌药物更难发挥作用及抗真菌能效降低，这可能是临床表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合感染耐药性增加、病情迁延不愈的原因。
表皮葡萄球菌icaA基因编码的多糖胞间黏附素（polysaccharide intercellular adhesion，PIA）、aap基因编码的聚集相关蛋白（Aap）、fbe基因编码的纤维蛋白原结合蛋白（Fbe）参与了生物膜形成。在表皮葡萄球菌形成生物膜的黏附阶段，fbe基因编码合成Fbe，与宿主纤维蛋白原结合，介导表皮葡萄球菌黏附于生物材料表面，促使生物膜形成。在细菌增殖和聚集阶段则通过PIA、Aap等因子发挥作用。研究表明，在表皮葡萄球菌生物膜形成所致感染中，ica基因在生物膜形成过程中起重要作用[16-17]。其编码的PIA不仅参与生物膜形成，还与生物膜耐药性密切相关，并影响生物膜的立体结构，是目前发现的与表皮葡萄球菌致病性关系最为密切的因子。国内外研究显示，ica基因阴性的表皮葡萄球菌通过aap基因编码的Aap形成蛋白依赖的生物膜，说明Aap作为聚集阶段的另一重要因子，在生物膜形成中发挥一定作用[18-19]。宋超等[20]研究发现，假单胞菌属、克雷白菌属、链球菌菌属存在伴随生长关系，在生物膜形成过程中相互作用。本研究荧光定量PCR结果显示，与表葡组相比，混合组 fbe、icaA、aap基因表达量分别增高1.93、1.52、1.46倍。结合宋超等[20]研究结果，我们分析在混合生物膜形成过程中，可能存在细菌与真菌之间不同水平相互作用，通过不同通路使表皮葡萄球菌icaA、fbe、aap表达量上调，在混合生物膜形成中起重要作用。
目前，临床生物材料相关感染多为混合生物膜感染，国内外有关研究集中在生物膜观察、可能药物预防等方面[21-22]，对发生机制罕见报道。我们根据既往研究，设计并实施了本次研究，以期对临床常见生物材料相关混合微生物感染的防治提供思路。通过观察发现，表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合生长能形成较单一微生物更厚、结构更复杂的混合生物膜，进而导致慢性感染耐药及迁延不愈；混合生物膜较单一生物膜更厚，可能与表皮葡萄球菌icaA、fbe、aap基因表达增加有关。生物膜的形成与调控是多层次、多通路的复杂过程，除此基因之外还有哪些机制参与调控尚有待进一步研究。
