引用本文： 符培亮, 丛锐军, 陈松, 张雷, 丁喆如, 周琦, 李林涛, 许震宇, 吴宇黎, 吴海山. 滑膜间充质干细胞成纤维软骨分化条件初步探索. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(1): 81-91. doi: 10.7507/1002-1892.20150018 复制
半月板损伤后再生能力有限，特别是白区，长期失去半月板保护会导致膝关节疼痛、功能障碍甚至残疾。近年组织工程学的发展为半月板修复提供了新方法。滑膜间充质干细胞（synovial derived MSCs，SMSCs）取材简便、对患者创伤小、细胞量大、成纤维软骨分化能力强，有望成为理想的种子细胞来源。体外诱导SMSCs成纤维软骨分化的条件尚未明确[1-5]。本实验探索了诱导SMSCs成纤维软骨分化的最佳条件，观察不同诱导条件对SMSCs成纤维软骨分化的影响以及不同诱导条件对分化后细胞表型的影响，以期为SMSCs体外诱导构建组织工程半月板奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
15月龄雄性新西兰白兔5只，体质量（2.20 ±0.65）kg，由第二军医大学动物中心提供。
0.05 %胰蛋白酶-0.02%EDTA（- 20℃保存；GIBCO 公司，美国）；10 ng/mL TGF-β3、500 ng/ mL BMP-2、100 nmol/L 地塞米松（dexamethasone，DEX）、40 μg/mL脯氨酸、50 μg/mL柠檬酸（ascorbic acid，ASA）、100 μg/mL丙酮酸、6.25 μg/ mL胰岛素、6.25 μg/mL转铁蛋白、6.25 μg/mL亚硒酸、1.25 mg/ mL牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、5.35 mg/ mL 亚麻酸、10 ng/mL重组人TGF-β1、50 ng/ mL bFGF、1.2%藻酸盐溶液、50 ng/mL BMP-7、10 ng/mL IGF、10 ng/mL TGF-β2、50 ng/mL BMP-4、Taq DNA聚合酶、10×PCR缓冲液、dNTP +荧光酶（Sigma公司，美国）；PBS缓冲液、0.01 mol/ L柠檬酸盐缓冲液、0.5 mol/L EDTA缓冲液、1 mol/L TBS缓冲液、4%多聚甲醛、10%山羊血清、3%甲醇-H 2O2溶液（上海试剂厂）；鼠抗兔Ⅰ型胶原（collagen typeⅠ，ColⅠ）、Ⅱ型胶原蛋白一抗、鼠抗兔CD105一抗（BioLegend公司，美国）；FITC标记的马抗鼠二抗、TRITC标记的马抗鼠二抗、鼠抗兔CD44一抗（BD Pharmingen公司，美国）。
5060/BB16自动温控CO2培养箱（Heraeus公司，德国）；压力控制外设（第二军医大学组胚实验室改装）；超净台（苏州净化设备有限公司）；HIMAC CR21高速冷冻离心机（Hitachi公司，日本）；低速离心机（Thermo公司，美国）；倒置相差显微镜、HFX-DX显微摄影系统（Nikon公司，日本）；超低温冰箱（Forma Scientific公司，美国）；Labconco Water PROTMPS超纯水制备系统（Labconco公司，美国）；微量加样器（Gilson公司，法国）；一次性培养瓶、培养皿及培养板、10 mL/5 mL一次性吸管、冻存管、离心管、细胞培养皿（Geriner＆Corning公司，美国）；程序降温盒（Nalgen公司，美国）；FACSCalibur 流式细胞仪、CellQuest 软件系统（Becton Dickinson公司，美国）。
1.2 SMSCs分离培养及鉴定
1.2.1 SMSCs分离培养
无菌条件下取新西兰白兔膝关节1 cm×1 cm滑膜组织，无菌PBS溶液反复冲洗3次，加入1%（V/V）抗生素（10 000 U/mL青霉素、10 000 μg/mL链霉素、25 μg/mL两性霉素B）。于DMEM中加入3 mg/mL胶原蛋白酶Ⅱ消化组织块。37℃、5%CO2孵育过夜，40 μm尼龙细胞滤器移除不溶物。4℃以150 × g离心7 min，DMEM冲洗2遍后重悬收获细胞；37℃、5%CO2培养箱中培养72 h，移除未贴壁细胞，加入含10%（V/V）小牛血清的α-MEM培养基培养细胞，每周换液2次，待细胞长满培养皿后，0.05%胰蛋白酶消化并传代，倒置相差显微镜下观察细胞形态。
1.2.2 细胞扩增分析
SMSCs培养期间每隔3 d检测细胞扩增情况。采用Proteinase K试剂盒提取细胞DNA，PicoGreen Assay测量细胞总DNA量，通过DNA量反映细胞扩增情况，绘制细胞扩增曲线。
1.2.3 SMSCs鉴定
① 流式细胞术：根据文献[2]方法采用流式细胞仪鉴定原代贴壁细胞表面标志物CD44、CD90、CD105、CD14、CD34和CD45表达。
② 成软骨分化：取20 μL第4代SMSCs，调整细胞浓度为2×107个/mL，接种于24孔板，贴壁3 h后加入成软骨诱导培养液（含10 ng/mL TGF-β1、50 μg/ mL抗坏血酸、6.25 μg/mL胰岛素、6.25 μg/ mL转铁蛋白、6.25 ng/mL亚硒酸、1.25 mg/mL BSA、5.35 mg/mL亚麻酸、100 nmol/L DEX的DMEM培养基），每2天更换培养基，维持TGF-β1浓度为10 ng/mL。培养14 d后PBS冲洗，- 20℃甲醇固定30 min，甲苯胺蓝染色过夜，蒸馏水反复冲洗，以200 μL 6 mol/L盐酸胍室温下萃取，分光光度法测定波长630 nm处吸光度（A）值。
③ 成骨分化：如前步骤于24孔板内加入成骨诱导培养基（含100 nmol/L DEX、0.2 mmol/L ASA、10 mmol/L β-甘油磷酸钠的DMEM培养基），培养21 d后加入0.2 nmol/L CaCl2，PBS冲洗后，4%多聚甲醛固定，2%茜素红染色（pH4.2）3 min，蒸馏水冲洗，倒置相差显微镜下观察。
④ 成脂分化：根据文献[4]方法进行成脂分化鉴定。如前步骤于24孔板内加入成脂诱导培养基（含1 μmol/L DEX、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、100 μmol/L吲哚美辛、10 μg/mL胰岛素的DMEM培养基）。诱导21 d后4%多聚甲醛固定1 h，0.5%油红O染色2 h，倒置相差显微镜下观察。
1.3 缺失实验设计
首先使用缺失实验方法，探索SMSCs成纤维软骨分化的必要条件，再根据缺失实验结果设计正交实验。缺失实验实验条件包括：10 ng/ mL TGF-β3、500 ng/ mL BMP-2、100 nmol/L DEX、40 μg/mL 脯氨酸、50 μg/ mL ASA、100 μg/mL丙酮酸、6.25 μg/mL胰岛素、6.25 μg/ mL转铁蛋白、6.25 μg/mL亚硒酸、1.25 mg/ mL BSA、5.35 mg/mL亚麻酸、10 ng/mL重组人TGF-β1、50 ng/mL bFGF、1.2%藻酸盐溶液、循环间断静水压（intermittent hydraulic pressure，IHP；0.5 kPa、1 Hz）、低氧环境（2%O2）、50 ng/mL BMP-7、10 ng/ mL IGF、10 ng/mL TGF-β2、50 ng/mL BMP-4、37℃、三维环境、5%CO2。上述条件中，三维环境采用小肠黏膜下层（small intestinal submucosa，SIS）支架，三维条件缺失时采用凝胶支架，实现单层培养。为明确温度对SMSCs成纤维软骨分化的影响，设立独立对照实验：采用随机数字表法定义46.4、4.5、20.0℃作为温度对照，并采用30～40℃连续0.5℃阶梯变温，探索温度对SMSCs成纤维软骨分化能力的调控作用。
取第4代SMSCs以2.5 ×105个/mL按上述实验条件诱导，每组缺失1个条件（1～23组，见表 1），以加入所有诱导条件为阳性对照组（24组）。倒置相差显微镜下观察各组细胞形态；培养14 d甲苯胺蓝染色，倒置相差显微镜下观察支架复合体形态及染色情况；并行半定量RT-PCR和免疫组织化学染色测定各组细胞是否表达SOX9、聚集蛋白聚糖（Aggrecan，AGN）、ColⅠ、ColⅡ以及ColⅨ。① 半定量RT-PCR：使用RNeasy Mini Kit试剂盒提取总RNA，使用SuperScriptⅢFirst-Strand Synthesis System Kit试剂盒逆转录得到cDNA，采用半定量RT-PCT对目的基因进行扩增，引物序列见表 2；在扩增进入平台期前，检测各孔A值，对基因浓度进行半定量分析，数据仅用于辅助分析成软骨分化趋势。② 免疫组织化学染色：采用免疫荧光法检测高表达ColⅠ的细胞占软骨细胞比例。封闭抗原后，采用鼠抗兔ColⅠ、ColⅡ一抗，连接了荧光素酶的马抗鼠二抗，使用FITC和TRITC显色。手工板计数，随机取10个不同视野下10个大格内全部软骨细胞作为总体，由于弹性软骨细胞数量稀少，所以高表达ColⅠ的纤维软骨细胞与高表达ColⅡ的透明软骨细胞之和应等于软骨细胞总体；高表达ColⅠ的纤维软骨细胞计数与该总体比值视为纤维软骨转化率（N），以10个视野下各转化单元N值的复合标准差作为实验的总体标准差。实验重复3次。
表1
缺失法探索SMSCs成纤维软骨分化的必要条件
Table1.
The necessary conditions of SMSCs diffferentiating into fibrocartilage screened by missing test
表2
半定量RT-PCR目的基因引物序列
Table2.
Primer sequence of objective genes by semi-quantitative RT-PCR
引入rate作为缺失实验检验指标，rate定义为CD151+/CD44+细胞数与N值的乘积；再进一步结合细胞形态、甲苯胺蓝染色、半定量RT-PCR检测SOX9、AGN、ColⅠ、ColⅡ、ColⅨ基因表达来验证rate值的信度。SMSCs成纤维软骨分化后流式细胞计数和染色得到的N值必须与半定量RT-PCR检测的基因表达趋势一致，rate值才能用于统计分析，差异表达的结果不会出现在结果部分。为提高实验信度，实验平行3次，结果中报道的转化值为最有代表性的实验结果，而不是3次实验的均值，存在交互作用的因子进一步行相关性分析，成直线正相关的两个因子仅保留N值相对较高的因子。
1.4 正交实验设计
根据缺失实验筛选出调控条件：TGF-β1、BMP-2、DEX、脯氨酸、ASA、丙酮酸、胰岛素+转铁蛋白+亚硒酸预混液（insulin + transferring + seleniousacid，ITS）、BSA、bFGF、IHP、BMP-7、IGF对SMSCs成纤维软骨调节作用显著（表 3），纳入2水平正交实验，各因子的水平参考文献[1-5]获得；温度、CO2浓度和低氧环境存在交互作用，这些条件改变或缺失后SMSCs不能成纤维软骨分化。其中，ITS预混溶液中各因子对SMSCs成纤维软骨分化的影响存在直线正相关，此处将胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸作为一个因素设计为ITS。根据我们的实验条件可进行单组＜64孔的培养，选择L60（212）正交设计能够满足实验且最大限度保证结果准确性。使用SPSS18.0统计软件设计正交实验表头（表 4），定义两个水平值为水平1、水平2；根据表 1中的不同实验条件对SMSCs行成纤维软骨诱导。采用流式细胞仪计数，检测CD151+/CD44+细胞并记录N值；采用免疫组织化学染色，结合细胞形态、甲苯胺蓝染色、半定量RT-PCR检测SOX9、AGN、ColⅠ、ColⅡ、ColⅨ基因表达，进一步验证结果。检验指标rate是CD151+/CD44+细胞与N值的乘积，计算方法同缺失实验。
表3
正交实验条件及水平
Table3.
The conditions and levels of orthogonal experiment
1.5 统计学方法
为防止不同个体来源SMSCs成纤维软骨分化差异影响，采用来源于同一动物的SMSCs重复3 次实验，取均值和标准差，并计算95%可信区间。来源于其余4只实验动物的SMSCs作为对照，只有5组同时得到有意义的阳性结果，且结果趋势一致，才能作为实验结果，结果部分报道的N值是最典型的1只实验动物的数据。缺失实验采用方差分析，比较各组与标准条件组间的关系，排除非必要的调控因子；正交实验结果采用直观观察和主体间方差分析方法，考虑部分因子间的1阶交互作用，组间比较采用LSD和q检验，采用Ⅲ型平方和校正模型；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 SMSCs形态学观察及鉴定
2.1.1 SMSCs形态学观察及细胞扩增结果
原代细胞呈多边形或星形；第1代细胞形态逐渐变成圆形和梭形；随着传代代次增加，细胞形态逐渐均一，呈“向日葵”样分布，第3代细胞呈梭形。见图 1。细胞倍增时间为28 h，细胞扩增曲线见图 2。
图1
SMSCs形态学观察（倒置相差显微镜×40） ⓐ 原代细胞 ⓑ 第3代细胞 2.1.2 SMSCs鉴定
流式细胞仪检测示SMSCs表面标志CD44、CD90、CD105呈阳性表达，CD14、CD34、CD45呈阴性表达。多向分化鉴定示，成骨诱导21 d茜素红染色、成软骨诱导14 d甲苯胺蓝染色及成脂诱导21 d油红O染色均呈阳性（图 3）。
2.2 SMSCs体外成软骨分化观察
按照正交实验培养条件诱导3 d后，细胞聚集成小团状，其趋化因子不清楚，细胞沿支架间隙爬行生长；支架体积在培养5 d倍增；14 d细胞-支架复合物甲苯胺蓝染色呈阳性（图 4）。软骨细胞免疫组织化学染色示ColⅠ、ColⅡ呈阳性染色（图 5）。半定量RT-PCR检测示，诱导后细胞表达SOX9、AGN、ColⅠ、ColⅡ、ColⅨ基因（图 6），各组基因表达不同，误差线表示50%可信区间。
2.3 缺失实验结果
缺失实验结果显示，TGF-β1、BMP-2、DEX、脯氨酸、抗坏血酸、丙酮酸、ITS、BSA、bFGF、IHP、BPM-7、IGF对SMSCs成纤维软骨分化调控作用显著（表 5），且各因子间不存在交互作用，作为独立因子参与正交实验。温度降低、升高，高氧环境以及使用凝胶限制细胞接触的状态下，细胞诱导分化明显延迟。来源于同一细胞株的SMSCs，限制细胞接触后成纤维软骨分化能力不同；温度对SMSCs成纤维软骨分化的影响并非成线性，在35.5～38.5℃范围内，成纤维软骨分化能力无显著差异，当温度高于或低于此范围时，SMSCs成纤维软骨分化能力下降。因此，温度、氧环境以及细胞间接触是SMSCs成纤维软骨分化必不可少的条件，但条件本身在阈值范围内改变时影响并不显著，超过阈值后SMSCs几乎不能成纤维软骨分化，因此不作为正交实验因子。亚麻酸缺失对成纤维软骨分化影响不显著，且与其他因子不存在交互作用，为非必要调控因素；方差分析显示TGF-β1、TGF-β3与 TGF-β2存在交互作用，成线性正相关，且不与其他因子交互，TGF-β1、TGF-β2与TGF-β3同时缺失，SMSCs不能成纤维软骨分化，缺失TGF-β1时SMSCs成纤维软骨分化能力较强，但纤维软骨细胞分化率仅为1.18%，而缺失TGF-β3、TGF-β2时为61.89%和75.13%，因此保留TGF-β1作为调控因子。藻酸盐缺失状态下，SMSCs成纤维软骨分化率为62.64%，与阳性对照组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），且与各指标间无交互作用，为非必要调控因素。
表5
缺失实验结果
Table5.
The results of missing test
2.4 正交实验结果
正交实验结果见表 6，直观分析显示，按转化率降序扩展排序后，取转化率中位数为分界线区组观察，第1因子TGF-β1对转化率的作用最明显，TGF-β1高浓度组转化率均＞30%、低浓度组转化率＜30%；其余分界线两侧的水平值加和均为45，直观条件下无法判断其转化率差异。取转化率1/4位数区组观察，见第11因子BMP-7第1区组转化率最高，水平值加和显示第1区组为30，第2、3、4区组（转化率依次降低）水平值加和分别为15、23、22，说明BMP-7采用水平2有利于得到更高的纤维软骨转化率；其余第1区组水平值加和高于22.5的因子有第3、5、7、9、12因子，第4区组的水平值加和均低于22.5，说明采用本正交实验表头设计的正交实验，各因子与转化率之间有较好的相关性。
表6
正交实验方差分析
Table6.
The variance analysis results of orthogonal experiment
正交实验方差分析采用直观观察和主体间方差分析的方法，结果见表 6。校正模型P=0.000，表明该模型能够满足实验设计；截距P=0.000，表明各因子对因变量影响差异不完全相同。TGF-β1、ASA、bFGF、IGF、BMP-7等因子对因变量调控作用较其他因子显著，差异有统计学意义；即改变以上因子浓度，SMSCs成纤维软骨分化能力显著降低，上述因子是SMSCs成纤维软骨分化最重要的调节因素，与直观观察结果相似。
3 讨论
本研究结果表明，SMSCs成纤维软骨分化过程中，TGF-β1、ASA、bFGF、IGF 4个因子剂量的改变显著影响SMSCs成纤维软骨分化作用，通过合理调整上述因子浓度，可显著提高成纤维软骨细胞分化转化率；但由于检索资源限制，我们的实验设计不可能覆盖所有敏感因子，这4个因子并不是SMSCs成纤维软骨分化唯一调控因素。TGF-β是公认的SMSCs向软骨细胞分化最关键的启动因素[1-2]，但对不同亚型的TGF-β促MSCs成纤维软骨分化作用存在争议[3-5]。Kim等[5]指出瞬间暴露在高剂量TGF-β3环境中，MSCs功能和表型被诱导变异，并能在体内增强软骨修复能力。Vanneaux等[3]认为TGF-β受体Ⅱ在TGF-β1介导的MSCs向软骨细胞分化过程中至关重要，TGF-β1是介导SMSCs成纤维软骨分化的最重要因子。我们的实验表明，不同亚型的TGF-β诱导MSCs成纤维软骨分化能力不同，TGF-β1调节作用最强。胰岛素是MSCs成纤维软骨分化中必要的调节因子[6-7]，但本实验结果表明胰岛素对SMSCs成纤维软骨分化的调节作用较弱，指数级的剂量差异仍不能引起纤维软骨转化率的差异，且与TGF和亚硒酸之间存在线性交互作用，不能作为独立的调节因子。
BMP亦是重要的纤维软骨生成调节因子[8]，许多文献定义BMP为促进剂[9]，但是对各亚型BMP作用存在争议[10-11]。我们的实验表明BMP-2促SMSCs成纤维软骨分化能力最强，已经明确BMP-2调节通路是：BMP-2→TGF-β受体Ⅱ→Smad 1、5、8通路，可能由于受体的饱和作用，BMP-2调控存在天花板效应[12]，高于调控浓度上限的BMP-2不会增加SMSCs成纤维软骨分化能力，我们的实验结果表明500 ng/ mL BMP-2与100 ng/mL BMP-2间差异不显著，但是与缺失组对照，其促软骨生成能力显著提高。此外，BMP-2促MSCs成纤维软骨分化作用机制尚存在争议。压力作为独立调控因素能够通过调节内源性BMP-2表达来调控MSCs成纤维软骨分化过程；同时，压力因素与BMP-2存在交互作用，Valhmu等[13]实验证实压力具有促进MSCs成纤维软骨分化和促进软骨细胞分泌AGN的作用。Wong等[14]研究也证实了压力能够促进软骨细胞基质分泌。Feng等[15-16]认为鼠类BMP-2、4的启动子区域存在与压力应答共存的区域，这可能是压力调控的基因基础。Rui等[17]、Lui等[18]、Ando等[19]均认为细胞外基质的破坏和重构与该过程密切相关。Chikazu等[20]提出了BMP-2→COX2→前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）（Cbfa）→骨/软骨形成的调控模型，认为PGF2存在对BMP-2的抑制作用，Cbfa基因的高表达促进成骨作用，抑制成软骨作用，可能与BMP-2浓度的天花板效应相关。Siddhivarn等[21]提出的Δ12-PGF J2/过氧化物酶体增殖物激活受体-γ2/BMP-2通路可能是压力与BMP-2相关的调节通路。
ASA在MSCs成骨分化中的作用及调控通路已被广泛研究[22-23]，在成纤维软骨分化过程中，ASA是MSCs重要细胞因子，但其在成纤维软骨分化过程中的调控作用研究较少[24]。关于ASA和SMSCs间相互作用的报道，在笔者委托的查新报告中未见收获。我们的实验表明，ASA在SMSCs成纤维软骨分化过程中可作为单独的调控因子，且与其他因子不存在交互作用。bFGF促进MSCs成软骨分化的作用是明确的[25]，其调节通路主要通过抑制α-平滑肌动蛋白的表达，维持成软骨必要的三维形态，从而促进MSCs成软骨分化过程。Kim等[26]研究证实，10 ng/ mL bFGF在成纤维软骨前的预处理能显著促进SMSCs成纤维软骨分化作用；值得注意的是，同组研究者在2009年却发布了截然相反的报道，Lee等[27]认为加入20 ng/mL bFGF和血清后，成纤维软骨分化过程受到显著抑制；这一因子的调节通路至今尚未得到深入研究。我们的实验结果表明，50 ng/ mL bFGF较空白对照组显著增强了SMSCs成纤维软骨分化能力，成透明软骨能力显著下降，但在加入高浓度（200 ng/ mL）bFGF后，SMSCs成纤维软骨和透明软骨能力均显著下降；针对bFGF可能调节通路的下游因子实验，我们在5组动物实验中得到矛盾的结果，故未在本文报道，目前我们仍不能确定该因子的作用机制，将在后续研究中进一步探讨。
其他作用因子对MSCs成纤维软骨分化的作用存在争议，如DEX作为独立调节因子作用不稳定，Nogami等[9]报道DEX能够增强人MSCs成纤维软骨分化过程，但Liu等[28]报道认为无论是否添加DEX，TGF-β2均能很好诱导成软骨，我们的研究同样表明，DEX作为独立因子，对SMSCs成纤维软骨调控能力不显著，少量DEX（＜100 μg/ mL）能促进SMSCs成纤维软骨分化，但大剂量DEX（＞1 000 μg/ mL）对SMSCs成脂分化表现出更强的促进作用。此外，我们观察到扩增阶段培养基中糖和血清的浓度对成软骨分化存在调控作用，目前未见相关报道，这一作用有待深入研究。
综上述，本文采用正交实验方法，探索了SMSCs成纤维软骨分化条件，找到了效率相对较高的SMSCs成纤维软骨分化实验条件，但细胞生长是一动态变化过程，许多条件的时间相关性还需深入探索。
半月板损伤后再生能力有限，特别是白区，长期失去半月板保护会导致膝关节疼痛、功能障碍甚至残疾。近年组织工程学的发展为半月板修复提供了新方法。滑膜间充质干细胞（synovial derived MSCs，SMSCs）取材简便、对患者创伤小、细胞量大、成纤维软骨分化能力强，有望成为理想的种子细胞来源。体外诱导SMSCs成纤维软骨分化的条件尚未明确[1-5]。本实验探索了诱导SMSCs成纤维软骨分化的最佳条件，观察不同诱导条件对SMSCs成纤维软骨分化的影响以及不同诱导条件对分化后细胞表型的影响，以期为SMSCs体外诱导构建组织工程半月板奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
15月龄雄性新西兰白兔5只，体质量（2.20 ±0.65）kg，由第二军医大学动物中心提供。
0.05 %胰蛋白酶-0.02%EDTA（- 20℃保存；GIBCO 公司，美国）；10 ng/mL TGF-β3、500 ng/ mL BMP-2、100 nmol/L 地塞米松（dexamethasone，DEX）、40 μg/mL脯氨酸、50 μg/mL柠檬酸（ascorbic acid，ASA）、100 μg/mL丙酮酸、6.25 μg/ mL胰岛素、6.25 μg/mL转铁蛋白、6.25 μg/mL亚硒酸、1.25 mg/ mL牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、5.35 mg/ mL 亚麻酸、10 ng/mL重组人TGF-β1、50 ng/ mL bFGF、1.2%藻酸盐溶液、50 ng/mL BMP-7、10 ng/mL IGF、10 ng/mL TGF-β2、50 ng/mL BMP-4、Taq DNA聚合酶、10×PCR缓冲液、dNTP +荧光酶（Sigma公司，美国）；PBS缓冲液、0.01 mol/ L柠檬酸盐缓冲液、0.5 mol/L EDTA缓冲液、1 mol/L TBS缓冲液、4%多聚甲醛、10%山羊血清、3%甲醇-H 2O2溶液（上海试剂厂）；鼠抗兔Ⅰ型胶原（collagen typeⅠ，ColⅠ）、Ⅱ型胶原蛋白一抗、鼠抗兔CD105一抗（BioLegend公司，美国）；FITC标记的马抗鼠二抗、TRITC标记的马抗鼠二抗、鼠抗兔CD44一抗（BD Pharmingen公司，美国）。
5060/BB16自动温控CO2培养箱（Heraeus公司，德国）；压力控制外设（第二军医大学组胚实验室改装）；超净台（苏州净化设备有限公司）；HIMAC CR21高速冷冻离心机（Hitachi公司，日本）；低速离心机（Thermo公司，美国）；倒置相差显微镜、HFX-DX显微摄影系统（Nikon公司，日本）；超低温冰箱（Forma Scientific公司，美国）；Labconco Water PROTMPS超纯水制备系统（Labconco公司，美国）；微量加样器（Gilson公司，法国）；一次性培养瓶、培养皿及培养板、10 mL/5 mL一次性吸管、冻存管、离心管、细胞培养皿（Geriner＆Corning公司，美国）；程序降温盒（Nalgen公司，美国）；FACSCalibur 流式细胞仪、CellQuest 软件系统（Becton Dickinson公司，美国）。
1.2 SMSCs分离培养及鉴定
1.2.1 SMSCs分离培养
无菌条件下取新西兰白兔膝关节1 cm×1 cm滑膜组织，无菌PBS溶液反复冲洗3次，加入1%（V/V）抗生素（10 000 U/mL青霉素、10 000 μg/mL链霉素、25 μg/mL两性霉素B）。于DMEM中加入3 mg/mL胶原蛋白酶Ⅱ消化组织块。37℃、5%CO2孵育过夜，40 μm尼龙细胞滤器移除不溶物。4℃以150 × g离心7 min，DMEM冲洗2遍后重悬收获细胞；37℃、5%CO2培养箱中培养72 h，移除未贴壁细胞，加入含10%（V/V）小牛血清的α-MEM培养基培养细胞，每周换液2次，待细胞长满培养皿后，0.05%胰蛋白酶消化并传代，倒置相差显微镜下观察细胞形态。
1.2.2 细胞扩增分析
SMSCs培养期间每隔3 d检测细胞扩增情况。采用Proteinase K试剂盒提取细胞DNA，PicoGreen Assay测量细胞总DNA量，通过DNA量反映细胞扩增情况，绘制细胞扩增曲线。
1.2.3 SMSCs鉴定
① 流式细胞术：根据文献[2]方法采用流式细胞仪鉴定原代贴壁细胞表面标志物CD44、CD90、CD105、CD14、CD34和CD45表达。
② 成软骨分化：取20 μL第4代SMSCs，调整细胞浓度为2×107个/mL，接种于24孔板，贴壁3 h后加入成软骨诱导培养液（含10 ng/mL TGF-β1、50 μg/ mL抗坏血酸、6.25 μg/mL胰岛素、6.25 μg/ mL转铁蛋白、6.25 ng/mL亚硒酸、1.25 mg/mL BSA、5.35 mg/mL亚麻酸、100 nmol/L DEX的DMEM培养基），每2天更换培养基，维持TGF-β1浓度为10 ng/mL。培养14 d后PBS冲洗，- 20℃甲醇固定30 min，甲苯胺蓝染色过夜，蒸馏水反复冲洗，以200 μL 6 mol/L盐酸胍室温下萃取，分光光度法测定波长630 nm处吸光度（A）值。
③ 成骨分化：如前步骤于24孔板内加入成骨诱导培养基（含100 nmol/L DEX、0.2 mmol/L ASA、10 mmol/L β-甘油磷酸钠的DMEM培养基），培养21 d后加入0.2 nmol/L CaCl2，PBS冲洗后，4%多聚甲醛固定，2%茜素红染色（pH4.2）3 min，蒸馏水冲洗，倒置相差显微镜下观察。
④ 成脂分化：根据文献[4]方法进行成脂分化鉴定。如前步骤于24孔板内加入成脂诱导培养基（含1 μmol/L DEX、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、100 μmol/L吲哚美辛、10 μg/mL胰岛素的DMEM培养基）。诱导21 d后4%多聚甲醛固定1 h，0.5%油红O染色2 h，倒置相差显微镜下观察。
1.3 缺失实验设计
首先使用缺失实验方法，探索SMSCs成纤维软骨分化的必要条件，再根据缺失实验结果设计正交实验。缺失实验实验条件包括：10 ng/ mL TGF-β3、500 ng/ mL BMP-2、100 nmol/L DEX、40 μg/mL 脯氨酸、50 μg/ mL ASA、100 μg/mL丙酮酸、6.25 μg/mL胰岛素、6.25 μg/ mL转铁蛋白、6.25 μg/mL亚硒酸、1.25 mg/ mL BSA、5.35 mg/mL亚麻酸、10 ng/mL重组人TGF-β1、50 ng/mL bFGF、1.2%藻酸盐溶液、循环间断静水压（intermittent hydraulic pressure，IHP；0.5 kPa、1 Hz）、低氧环境（2%O2）、50 ng/mL BMP-7、10 ng/ mL IGF、10 ng/mL TGF-β2、50 ng/mL BMP-4、37℃、三维环境、5%CO2。上述条件中，三维环境采用小肠黏膜下层（small intestinal submucosa，SIS）支架，三维条件缺失时采用凝胶支架，实现单层培养。为明确温度对SMSCs成纤维软骨分化的影响，设立独立对照实验：采用随机数字表法定义46.4、4.5、20.0℃作为温度对照，并采用30～40℃连续0.5℃阶梯变温，探索温度对SMSCs成纤维软骨分化能力的调控作用。
取第4代SMSCs以2.5 ×105个/mL按上述实验条件诱导，每组缺失1个条件（1～23组，见表 1），以加入所有诱导条件为阳性对照组（24组）。倒置相差显微镜下观察各组细胞形态；培养14 d甲苯胺蓝染色，倒置相差显微镜下观察支架复合体形态及染色情况；并行半定量RT-PCR和免疫组织化学染色测定各组细胞是否表达SOX9、聚集蛋白聚糖（Aggrecan，AGN）、ColⅠ、ColⅡ以及ColⅨ。① 半定量RT-PCR：使用RNeasy Mini Kit试剂盒提取总RNA，使用SuperScriptⅢFirst-Strand Synthesis System Kit试剂盒逆转录得到cDNA，采用半定量RT-PCT对目的基因进行扩增，引物序列见表 2；在扩增进入平台期前，检测各孔A值，对基因浓度进行半定量分析，数据仅用于辅助分析成软骨分化趋势。② 免疫组织化学染色：采用免疫荧光法检测高表达ColⅠ的细胞占软骨细胞比例。封闭抗原后，采用鼠抗兔ColⅠ、ColⅡ一抗，连接了荧光素酶的马抗鼠二抗，使用FITC和TRITC显色。手工板计数，随机取10个不同视野下10个大格内全部软骨细胞作为总体，由于弹性软骨细胞数量稀少，所以高表达ColⅠ的纤维软骨细胞与高表达ColⅡ的透明软骨细胞之和应等于软骨细胞总体；高表达ColⅠ的纤维软骨细胞计数与该总体比值视为纤维软骨转化率（N），以10个视野下各转化单元N值的复合标准差作为实验的总体标准差。实验重复3次。
表1
缺失法探索SMSCs成纤维软骨分化的必要条件
Table1.
The necessary conditions of SMSCs diffferentiating into fibrocartilage screened by missing test
表2
半定量RT-PCR目的基因引物序列
Table2.
Primer sequence of objective genes by semi-quantitative RT-PCR
引入rate作为缺失实验检验指标，rate定义为CD151+/CD44+细胞数与N值的乘积；再进一步结合细胞形态、甲苯胺蓝染色、半定量RT-PCR检测SOX9、AGN、ColⅠ、ColⅡ、ColⅨ基因表达来验证rate值的信度。SMSCs成纤维软骨分化后流式细胞计数和染色得到的N值必须与半定量RT-PCR检测的基因表达趋势一致，rate值才能用于统计分析，差异表达的结果不会出现在结果部分。为提高实验信度，实验平行3次，结果中报道的转化值为最有代表性的实验结果，而不是3次实验的均值，存在交互作用的因子进一步行相关性分析，成直线正相关的两个因子仅保留N值相对较高的因子。
1.4 正交实验设计
根据缺失实验筛选出调控条件：TGF-β1、BMP-2、DEX、脯氨酸、ASA、丙酮酸、胰岛素+转铁蛋白+亚硒酸预混液（insulin + transferring + seleniousacid，ITS）、BSA、bFGF、IHP、BMP-7、IGF对SMSCs成纤维软骨调节作用显著（表 3），纳入2水平正交实验，各因子的水平参考文献[1-5]获得；温度、CO2浓度和低氧环境存在交互作用，这些条件改变或缺失后SMSCs不能成纤维软骨分化。其中，ITS预混溶液中各因子对SMSCs成纤维软骨分化的影响存在直线正相关，此处将胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸作为一个因素设计为ITS。根据我们的实验条件可进行单组＜64孔的培养，选择L60（212）正交设计能够满足实验且最大限度保证结果准确性。使用SPSS18.0统计软件设计正交实验表头（表 4），定义两个水平值为水平1、水平2；根据表 1中的不同实验条件对SMSCs行成纤维软骨诱导。采用流式细胞仪计数，检测CD151+/CD44+细胞并记录N值；采用免疫组织化学染色，结合细胞形态、甲苯胺蓝染色、半定量RT-PCR检测SOX9、AGN、ColⅠ、ColⅡ、ColⅨ基因表达，进一步验证结果。检验指标rate是CD151+/CD44+细胞与N值的乘积，计算方法同缺失实验。
表3
正交实验条件及水平
Table3.
The conditions and levels of orthogonal experiment
1.5 统计学方法
为防止不同个体来源SMSCs成纤维软骨分化差异影响，采用来源于同一动物的SMSCs重复3 次实验，取均值和标准差，并计算95%可信区间。来源于其余4只实验动物的SMSCs作为对照，只有5组同时得到有意义的阳性结果，且结果趋势一致，才能作为实验结果，结果部分报道的N值是最典型的1只实验动物的数据。缺失实验采用方差分析，比较各组与标准条件组间的关系，排除非必要的调控因子；正交实验结果采用直观观察和主体间方差分析方法，考虑部分因子间的1阶交互作用，组间比较采用LSD和q检验，采用Ⅲ型平方和校正模型；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 SMSCs形态学观察及鉴定
2.1.1 SMSCs形态学观察及细胞扩增结果
原代细胞呈多边形或星形；第1代细胞形态逐渐变成圆形和梭形；随着传代代次增加，细胞形态逐渐均一，呈“向日葵”样分布，第3代细胞呈梭形。见图 1。细胞倍增时间为28 h，细胞扩增曲线见图 2。
图1
SMSCs形态学观察（倒置相差显微镜×40） ⓐ 原代细胞 ⓑ 第3代细胞 2.1.2 SMSCs鉴定
流式细胞仪检测示SMSCs表面标志CD44、CD90、CD105呈阳性表达，CD14、CD34、CD45呈阴性表达。多向分化鉴定示，成骨诱导21 d茜素红染色、成软骨诱导14 d甲苯胺蓝染色及成脂诱导21 d油红O染色均呈阳性（图 3）。
2.2 SMSCs体外成软骨分化观察
按照正交实验培养条件诱导3 d后，细胞聚集成小团状，其趋化因子不清楚，细胞沿支架间隙爬行生长；支架体积在培养5 d倍增；14 d细胞-支架复合物甲苯胺蓝染色呈阳性（图 4）。软骨细胞免疫组织化学染色示ColⅠ、ColⅡ呈阳性染色（图 5）。半定量RT-PCR检测示，诱导后细胞表达SOX9、AGN、ColⅠ、ColⅡ、ColⅨ基因（图 6），各组基因表达不同，误差线表示50%可信区间。
2.3 缺失实验结果
缺失实验结果显示，TGF-β1、BMP-2、DEX、脯氨酸、抗坏血酸、丙酮酸、ITS、BSA、bFGF、IHP、BPM-7、IGF对SMSCs成纤维软骨分化调控作用显著（表 5），且各因子间不存在交互作用，作为独立因子参与正交实验。温度降低、升高，高氧环境以及使用凝胶限制细胞接触的状态下，细胞诱导分化明显延迟。来源于同一细胞株的SMSCs，限制细胞接触后成纤维软骨分化能力不同；温度对SMSCs成纤维软骨分化的影响并非成线性，在35.5～38.5℃范围内，成纤维软骨分化能力无显著差异，当温度高于或低于此范围时，SMSCs成纤维软骨分化能力下降。因此，温度、氧环境以及细胞间接触是SMSCs成纤维软骨分化必不可少的条件，但条件本身在阈值范围内改变时影响并不显著，超过阈值后SMSCs几乎不能成纤维软骨分化，因此不作为正交实验因子。亚麻酸缺失对成纤维软骨分化影响不显著，且与其他因子不存在交互作用，为非必要调控因素；方差分析显示TGF-β1、TGF-β3与 TGF-β2存在交互作用，成线性正相关，且不与其他因子交互，TGF-β1、TGF-β2与TGF-β3同时缺失，SMSCs不能成纤维软骨分化，缺失TGF-β1时SMSCs成纤维软骨分化能力较强，但纤维软骨细胞分化率仅为1.18%，而缺失TGF-β3、TGF-β2时为61.89%和75.13%，因此保留TGF-β1作为调控因子。藻酸盐缺失状态下，SMSCs成纤维软骨分化率为62.64%，与阳性对照组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），且与各指标间无交互作用，为非必要调控因素。
表5
缺失实验结果
Table5.
The results of missing test
2.4 正交实验结果
正交实验结果见表 6，直观分析显示，按转化率降序扩展排序后，取转化率中位数为分界线区组观察，第1因子TGF-β1对转化率的作用最明显，TGF-β1高浓度组转化率均＞30%、低浓度组转化率＜30%；其余分界线两侧的水平值加和均为45，直观条件下无法判断其转化率差异。取转化率1/4位数区组观察，见第11因子BMP-7第1区组转化率最高，水平值加和显示第1区组为30，第2、3、4区组（转化率依次降低）水平值加和分别为15、23、22，说明BMP-7采用水平2有利于得到更高的纤维软骨转化率；其余第1区组水平值加和高于22.5的因子有第3、5、7、9、12因子，第4区组的水平值加和均低于22.5，说明采用本正交实验表头设计的正交实验，各因子与转化率之间有较好的相关性。
表6
正交实验方差分析
Table6.
The variance analysis results of orthogonal experiment
正交实验方差分析采用直观观察和主体间方差分析的方法，结果见表 6。校正模型P=0.000，表明该模型能够满足实验设计；截距P=0.000，表明各因子对因变量影响差异不完全相同。TGF-β1、ASA、bFGF、IGF、BMP-7等因子对因变量调控作用较其他因子显著，差异有统计学意义；即改变以上因子浓度，SMSCs成纤维软骨分化能力显著降低，上述因子是SMSCs成纤维软骨分化最重要的调节因素，与直观观察结果相似。
3 讨论
本研究结果表明，SMSCs成纤维软骨分化过程中，TGF-β1、ASA、bFGF、IGF 4个因子剂量的改变显著影响SMSCs成纤维软骨分化作用，通过合理调整上述因子浓度，可显著提高成纤维软骨细胞分化转化率；但由于检索资源限制，我们的实验设计不可能覆盖所有敏感因子，这4个因子并不是SMSCs成纤维软骨分化唯一调控因素。TGF-β是公认的SMSCs向软骨细胞分化最关键的启动因素[1-2]，但对不同亚型的TGF-β促MSCs成纤维软骨分化作用存在争议[3-5]。Kim等[5]指出瞬间暴露在高剂量TGF-β3环境中，MSCs功能和表型被诱导变异，并能在体内增强软骨修复能力。Vanneaux等[3]认为TGF-β受体Ⅱ在TGF-β1介导的MSCs向软骨细胞分化过程中至关重要，TGF-β1是介导SMSCs成纤维软骨分化的最重要因子。我们的实验表明，不同亚型的TGF-β诱导MSCs成纤维软骨分化能力不同，TGF-β1调节作用最强。胰岛素是MSCs成纤维软骨分化中必要的调节因子[6-7]，但本实验结果表明胰岛素对SMSCs成纤维软骨分化的调节作用较弱，指数级的剂量差异仍不能引起纤维软骨转化率的差异，且与TGF和亚硒酸之间存在线性交互作用，不能作为独立的调节因子。
BMP亦是重要的纤维软骨生成调节因子[8]，许多文献定义BMP为促进剂[9]，但是对各亚型BMP作用存在争议[10-11]。我们的实验表明BMP-2促SMSCs成纤维软骨分化能力最强，已经明确BMP-2调节通路是：BMP-2→TGF-β受体Ⅱ→Smad 1、5、8通路，可能由于受体的饱和作用，BMP-2调控存在天花板效应[12]，高于调控浓度上限的BMP-2不会增加SMSCs成纤维软骨分化能力，我们的实验结果表明500 ng/ mL BMP-2与100 ng/mL BMP-2间差异不显著，但是与缺失组对照，其促软骨生成能力显著提高。此外，BMP-2促MSCs成纤维软骨分化作用机制尚存在争议。压力作为独立调控因素能够通过调节内源性BMP-2表达来调控MSCs成纤维软骨分化过程；同时，压力因素与BMP-2存在交互作用，Valhmu等[13]实验证实压力具有促进MSCs成纤维软骨分化和促进软骨细胞分泌AGN的作用。Wong等[14]研究也证实了压力能够促进软骨细胞基质分泌。Feng等[15-16]认为鼠类BMP-2、4的启动子区域存在与压力应答共存的区域，这可能是压力调控的基因基础。Rui等[17]、Lui等[18]、Ando等[19]均认为细胞外基质的破坏和重构与该过程密切相关。Chikazu等[20]提出了BMP-2→COX2→前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）（Cbfa）→骨/软骨形成的调控模型，认为PGF2存在对BMP-2的抑制作用，Cbfa基因的高表达促进成骨作用，抑制成软骨作用，可能与BMP-2浓度的天花板效应相关。Siddhivarn等[21]提出的Δ12-PGF J2/过氧化物酶体增殖物激活受体-γ2/BMP-2通路可能是压力与BMP-2相关的调节通路。
ASA在MSCs成骨分化中的作用及调控通路已被广泛研究[22-23]，在成纤维软骨分化过程中，ASA是MSCs重要细胞因子，但其在成纤维软骨分化过程中的调控作用研究较少[24]。关于ASA和SMSCs间相互作用的报道，在笔者委托的查新报告中未见收获。我们的实验表明，ASA在SMSCs成纤维软骨分化过程中可作为单独的调控因子，且与其他因子不存在交互作用。bFGF促进MSCs成软骨分化的作用是明确的[25]，其调节通路主要通过抑制α-平滑肌动蛋白的表达，维持成软骨必要的三维形态，从而促进MSCs成软骨分化过程。Kim等[26]研究证实，10 ng/ mL bFGF在成纤维软骨前的预处理能显著促进SMSCs成纤维软骨分化作用；值得注意的是，同组研究者在2009年却发布了截然相反的报道，Lee等[27]认为加入20 ng/mL bFGF和血清后，成纤维软骨分化过程受到显著抑制；这一因子的调节通路至今尚未得到深入研究。我们的实验结果表明，50 ng/ mL bFGF较空白对照组显著增强了SMSCs成纤维软骨分化能力，成透明软骨能力显著下降，但在加入高浓度（200 ng/ mL）bFGF后，SMSCs成纤维软骨和透明软骨能力均显著下降；针对bFGF可能调节通路的下游因子实验，我们在5组动物实验中得到矛盾的结果，故未在本文报道，目前我们仍不能确定该因子的作用机制，将在后续研究中进一步探讨。
其他作用因子对MSCs成纤维软骨分化的作用存在争议，如DEX作为独立调节因子作用不稳定，Nogami等[9]报道DEX能够增强人MSCs成纤维软骨分化过程，但Liu等[28]报道认为无论是否添加DEX，TGF-β2均能很好诱导成软骨，我们的研究同样表明，DEX作为独立因子，对SMSCs成纤维软骨调控能力不显著，少量DEX（＜100 μg/ mL）能促进SMSCs成纤维软骨分化，但大剂量DEX（＞1 000 μg/ mL）对SMSCs成脂分化表现出更强的促进作用。此外，我们观察到扩增阶段培养基中糖和血清的浓度对成软骨分化存在调控作用，目前未见相关报道，这一作用有待深入研究。
综上述，本文采用正交实验方法，探索了SMSCs成纤维软骨分化条件，找到了效率相对较高的SMSCs成纤维软骨分化实验条件，但细胞生长是一动态变化过程，许多条件的时间相关性还需深入探索。
