引用本文： 付维力, 陈刚, 唐新, 李棋, 李箭. BMP-12重组腺病毒载体转染外周血MSCs向肌腱/韧带细胞分化研究. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(4): 472-476. doi: 10.7507/1002-1892.20150102 复制
肌腱/韧带损伤或病变因其自身愈合能力非常有限，其治疗仍是骨科及运动医学面临的巨大挑战，细胞治疗和基因治疗手段为其带来了新希望[1]。中胚层来源的成体干细胞MSCs因具有较强的自我更新、多向分化潜能及免疫调控等优点，已被广泛应用于肌腱/韧带再生医学领域[2]。骨髓是BMSCs最主要来源，也是用于肌腱/韧带再生最多的种子细胞来源[3-4]；但BMSCs含量很低（约0.001%），且获取骨髓创伤较大，存在供区并发症[5-6]。外周血来源的MSCs，由于取材微创，且样品处理过程中危险度低，可实现自体细胞移植，其作为一种可供选择的MSCs来源用于肌腱/韧带再生修复已成为近年研究焦点，具有临床应用前景[7]。BMP-12也称为生长分化因子7或软骨衍生形态发生蛋白3，属于TGF-β超家族成员，具有较强的诱导肌腱/韧带样组织形成能力[8-11]，但其对外周血MSCs的分化作用尚未证实。因此，本研究采用BMP-12基因转染诱导外周血MSCs向肌腱/韧带细胞分化，为临床肌腱/韧带损伤或病变的再生研究奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、试剂、仪器
3～4月龄新西兰兔5只，雌雄不限，体重约3 kg，由四川大学华西医学中心实验动物部提供。携带BMP-12基因的cDNA第1代血清型5型腺病毒载体和AdEasy腺病毒载体系统由北京大学基础医学院周春燕教授惠赠。293A细胞购自美国ATCC公司。
密度为1.077 g/mL的Ficoll淋巴细胞分离液（北京鼎国生物技术有限责任公司）；FBS（HyClone公司，美国）；青霉素、链霉素、两性霉素B（华北制药有限公司）；L-谷氨酰胺、αMEM培养基（GIBCO公司，美国）； Lipofectamine2000、Trizol试剂（In ve tro gen公司，美国）；山羊血清、山羊抗小鼠二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；Ⅰ型胶原抗体（Merck公司，德国）；逆转录酶（Promega公司，美国）；SYBR Green real-time PCR Master Mix（TOY OBO公司，日本）。
流式细胞仪（flow cytometry，FCM；BD公司,美国）；倒置相差显微镜、荧光显微镜（Olympus公司，日本）；ABI7700 型实时定量PCR 仪（ABI公司，美国）。
1.2 外周血MSCs分离培养
于麻醉和无菌条件下，用含300 U/mL肝素带18号针头的注射器从新西兰兔耳中央动脉抽吸10 mL外周血。每份血液样本用1∶1 PBS稀释，小心加在等体积Ficoll淋巴细胞分离液上层，室温以1 258×g离心30 min；仔细吸出中间棕黄色的单核细胞层，PBS洗涤后以200×g离心10 min收集细胞，重悬于完全培养基（含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/ mL链霉素、25 ng/mL两性霉素B、2 mmol/L L-谷氨酰胺的αMEM培养基）中，置于37℃、 5%CO2和饱和湿度培养箱中孵育。3～5 d后弃非贴壁细胞和碎片，PBS清洗，更换新的完全培养基；每3～4天换液1次。10～15 d细胞达80%～90%融合时，0.25%胰蛋白酶/0.1%EDTA消化传代。收集第3代细胞用于以下实验[12]。
1.3 BMP-12重组腺病毒载体构建、病毒包装及扩增纯化
使用AdEasy腺病毒载体系统制备BMP-12重组腺病毒载体[13]。插入目的基因片段BMP-12-cDNA的穿梭质粒pAdtrack-CMV-BMP-12，用PmeΙ行酶切线性化后，转入携带腺病毒骨架载体pAdEasy-1的E.coli.BJ5183菌株进行细菌内重组。将线性化的重组质粒按照Lipofectamine2000说明书转入293A细胞中进行病毒包装。BMP-12基因随着重组腺病毒在感染的293A细胞中大量扩增，液氮反复冻融细胞3～4次，以13 400×g离心30 min，取上清收获病毒，并通过氯化铯梯度离心法纯化。纯化的病毒液中加入10% FBS，以1×1010 pfu/ mL滴度[14]于-80℃保存备用。
1.4 BMP-12重组腺病毒体外转染外周血MSCs
取第3代外周血MSCs生长至80%～90%融合时，用巴氏吸管吸除培养液，PBS洗涤1次后加入含感染复数为100[15]的病毒液的无血清αMEM培养基，于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱孵育6～8 h后，换含10%FBS的αMEM培养基继续培养，每3天换液1次。
1.5 观测指标
1.5.1 转染效率检测
① 倒置相差显微镜观察：转染后24 h，于倒置相差显微镜下观察细胞形态和生长情况。② 荧光显微镜观察：转染后8、24 h在荧光显微镜下观察转染组的转染效果。③ FCM检测：转染后24 h，用0.25%胰蛋白酶/0.1%EDTA消化细胞，PBS洗涤，流式细胞仪检测转染组细胞转染效率，并设未转染组为对照组。
1.5.2 肌腱/韧带特异标记表达水平检测
① 免疫组织化学染色：取转染后即刻（0 d）、转染后7 d和14 d细胞爬片，经PBS漂洗后，丙酮固定20 min，3%H2O2阻断细胞内源性过氧化物酶15 min，5%山羊血清封闭15 min，滴加一抗（1∶200）室温孵育1 h。PBS漂洗3次后，滴加二抗（1∶200）室温孵育30 min。DAB显色，光镜下观察。② 实时荧光定量PCR检测：转染组转染后14 d，采用实时荧光定量PCR检测肌腱/韧带特异基因Tenomodulin、Tenascin-C和Decorin mRNA表达水平。采用Trizol法提取细胞总RNA，经AMV 逆转录酶转录合成cDNA。采用SYBR Green Real-time PCR Master Mix在实时定量PCR 仪上行PCR反应，引物序列见表 1。反应体系15 μL： 2×SYBR Green缓冲液7.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，灭菌去离子水补齐至15 μL。反应条件：95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、1 min，40个循环。以GAPDH为对照基因，采用2-ΔΔCt 法计算各目的基因mRNA表达水平。同时设未转染组细胞作为对照。
表1
实时荧光定量PCR检测目的基因引物序列
Table1.
Primer sequences of genes for real-time fluorescent quantitative PCR
1.6 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 转染效率观察
2.1.1 倒置相差显微镜观察
转染后24 h，镜下可见细胞生长增殖缓慢，细胞形态及轮廓清晰（图 1）。
图1
转染后24 h倒置相差显微镜观察细胞形态（×100） 图 2 转染后24 h荧光显微镜观察GFP表达（×100） 图 3 转染后24 h FCM检测 ⓐ 转染组 ⓑ 未转染组 图 4 转染后各时间点免疫组织化学染色观察Ⅰ型胶原表达（×100） ⓐ 0 d ⓑ 7 d ⓒ 14 d
Figure1.
The morphological characteristics of peripheral blood MSCs after transfected with Ad-BMP-12 for 24 hours under inverted phase contrast microscope (×100) Fig. 2 GFP expression after transfected with Ad-BMP-12 for 24 hours under fluorescence microscopy (×100) Fig. 3 Flow cytometry detection after transfected with Ad-BMP-12 for 24 hours ⓐ Transfected group ⓑ Untransfected group Fig. 4 The immunohistochemical staining of collagen type Ι after transfected with Ad-BMP-12 at different time (×100) ⓐ 0 day ⓑ Seven days ⓒ Fourteen days
2.1.2 荧光显微镜观察
转染后8 h，荧光显微镜下可见GFP表达；随着体外培养时间延长，表达GFP的细胞逐渐增多，荧光强度也逐渐增强，转染24 h，几乎所有细胞均可见GFP表达，细胞质和细胞核均显示绿色荧光（图 2）。
2.1.3 FCM检测
转染后24 h FCM检测示，转染组转染效率为99.57%，未转染组为2.46%（图 3）。
2.2 肌腱/韧带特异标记表达水平检测
2.2.1 免疫组织化学染色
光镜观察示，随转染时间延长，Ⅰ型胶原表达逐渐增强（图 4）。
2.2.2 实时荧光定量PCR检测
转染组转染后14 d，肌腱/韧带特异基因Tenomodulin、Tenascin-C和Decorin mRNA表达水平分别为0.061±0.013、0.029±0.008、0.679±0.067，均显著高于未转染组的0.004±0.002、0.003±0.001、0.142±0.024，差异有统计学意义（t= -7.700，P=0.031；t= -5.741，P=0.020；t= -1 2.998，P=0.000）。
3 讨论
相比其他来源的MSCs，外周血来源MSCs具有取材微创、采集简便等优点，且有利于实现自体细胞微创移植，在骨骼肌肉系统损伤治疗以及肌腱/韧带修复重建方面具有应用前景[16-17]。BMP-12具有较强的成肌腱/韧带组织能力，有学者在兔模型上采用BMP-12基因修饰促进了后交叉韧带损伤的组织学和生物力学愈合[18]。传统的外源性BMP-12能有效诱导MSCs向肌腱样细胞分化。直接添加外源性生长因子价格较昂贵且发挥生物活性时间短[19]。故本研究构建BMP-12重组腺病毒表达载体，采用基因工程的方法将BMP-12基因转入至外周血MSCs，使外源性基因在一定时间内高效表达。用BMP-12重组腺病毒表达载体转染外周血MSCs，可明显促进外周血MSCs向肌腱/韧带成纤维细胞表型分化并促进肌腱/韧带特异基因表达和细胞外基质分泌。但目前尚无单一的表型标记来鉴定成熟的肌腱/韧带成纤维细胞，因此本研究采用免疫组织化学和实时荧光定量PCR，从蛋白和基因水平来评价BMP-12重组腺病毒表达载体转染外周血MSCs促进其向肌腱/韧带细胞分化效果。
有学者研究BMP-12诱导脂肪来源干细胞成肌腱细胞分化能力，在犬和小鼠模型上BMP-12能有效增加肌腱标志物scleraxis 和 tenomodulin mRNA和蛋白表达水平。BMPs发挥作用是通过激活经典的Smad信号通路和非经典的MAPK通路进行调节，BMP-12是通过激活脂肪来源干细胞Smad1/5/8的磷酸化或p38 MAPK发挥作用[20]。
本研究采用BMP-12重组腺病毒表达载体成功转染外周血MSCs，并诱导其向肌腱/韧带细胞分化。重组腺病毒表达载体具有滴度高、易感染、毒性低、病毒粒子相对稳定、容纳量大、非整合宿主染色体无插入突变风险等优点，被广泛应用于基因工程表达载体系统，但存在有免疫原性、外源基因表达时间较短等缺陷。因此未来携带基因表达载体的研究应集中于腺病毒载体的优化改良或开发非病毒载体系统[21]。
综上述，本研究将Ad-BMP12成功传染外周血MSCs，诱导其成肌腱/韧带细胞分化取得了较好效果，为外周血MSCs参与肌腱/韧带损伤或病变的再生修复提供了参考，但确切机制尚需进一步研究。
肌腱/韧带损伤或病变因其自身愈合能力非常有限，其治疗仍是骨科及运动医学面临的巨大挑战，细胞治疗和基因治疗手段为其带来了新希望[1]。中胚层来源的成体干细胞MSCs因具有较强的自我更新、多向分化潜能及免疫调控等优点，已被广泛应用于肌腱/韧带再生医学领域[2]。骨髓是BMSCs最主要来源，也是用于肌腱/韧带再生最多的种子细胞来源[3-4]；但BMSCs含量很低（约0.001%），且获取骨髓创伤较大，存在供区并发症[5-6]。外周血来源的MSCs，由于取材微创，且样品处理过程中危险度低，可实现自体细胞移植，其作为一种可供选择的MSCs来源用于肌腱/韧带再生修复已成为近年研究焦点，具有临床应用前景[7]。BMP-12也称为生长分化因子7或软骨衍生形态发生蛋白3，属于TGF-β超家族成员，具有较强的诱导肌腱/韧带样组织形成能力[8-11]，但其对外周血MSCs的分化作用尚未证实。因此，本研究采用BMP-12基因转染诱导外周血MSCs向肌腱/韧带细胞分化，为临床肌腱/韧带损伤或病变的再生研究奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、试剂、仪器
3～4月龄新西兰兔5只，雌雄不限，体重约3 kg，由四川大学华西医学中心实验动物部提供。携带BMP-12基因的cDNA第1代血清型5型腺病毒载体和AdEasy腺病毒载体系统由北京大学基础医学院周春燕教授惠赠。293A细胞购自美国ATCC公司。
密度为1.077 g/mL的Ficoll淋巴细胞分离液（北京鼎国生物技术有限责任公司）；FBS（HyClone公司，美国）；青霉素、链霉素、两性霉素B（华北制药有限公司）；L-谷氨酰胺、αMEM培养基（GIBCO公司，美国）； Lipofectamine2000、Trizol试剂（In ve tro gen公司，美国）；山羊血清、山羊抗小鼠二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；Ⅰ型胶原抗体（Merck公司，德国）；逆转录酶（Promega公司，美国）；SYBR Green real-time PCR Master Mix（TOY OBO公司，日本）。
流式细胞仪（flow cytometry，FCM；BD公司,美国）；倒置相差显微镜、荧光显微镜（Olympus公司，日本）；ABI7700 型实时定量PCR 仪（ABI公司，美国）。
1.2 外周血MSCs分离培养
于麻醉和无菌条件下，用含300 U/mL肝素带18号针头的注射器从新西兰兔耳中央动脉抽吸10 mL外周血。每份血液样本用1∶1 PBS稀释，小心加在等体积Ficoll淋巴细胞分离液上层，室温以1 258×g离心30 min；仔细吸出中间棕黄色的单核细胞层，PBS洗涤后以200×g离心10 min收集细胞，重悬于完全培养基（含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/ mL链霉素、25 ng/mL两性霉素B、2 mmol/L L-谷氨酰胺的αMEM培养基）中，置于37℃、 5%CO2和饱和湿度培养箱中孵育。3～5 d后弃非贴壁细胞和碎片，PBS清洗，更换新的完全培养基；每3～4天换液1次。10～15 d细胞达80%～90%融合时，0.25%胰蛋白酶/0.1%EDTA消化传代。收集第3代细胞用于以下实验[12]。
1.3 BMP-12重组腺病毒载体构建、病毒包装及扩增纯化
使用AdEasy腺病毒载体系统制备BMP-12重组腺病毒载体[13]。插入目的基因片段BMP-12-cDNA的穿梭质粒pAdtrack-CMV-BMP-12，用PmeΙ行酶切线性化后，转入携带腺病毒骨架载体pAdEasy-1的E.coli.BJ5183菌株进行细菌内重组。将线性化的重组质粒按照Lipofectamine2000说明书转入293A细胞中进行病毒包装。BMP-12基因随着重组腺病毒在感染的293A细胞中大量扩增，液氮反复冻融细胞3～4次，以13 400×g离心30 min，取上清收获病毒，并通过氯化铯梯度离心法纯化。纯化的病毒液中加入10% FBS，以1×1010 pfu/ mL滴度[14]于-80℃保存备用。
1.4 BMP-12重组腺病毒体外转染外周血MSCs
取第3代外周血MSCs生长至80%～90%融合时，用巴氏吸管吸除培养液，PBS洗涤1次后加入含感染复数为100[15]的病毒液的无血清αMEM培养基，于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱孵育6～8 h后，换含10%FBS的αMEM培养基继续培养，每3天换液1次。
1.5 观测指标
1.5.1 转染效率检测
① 倒置相差显微镜观察：转染后24 h，于倒置相差显微镜下观察细胞形态和生长情况。② 荧光显微镜观察：转染后8、24 h在荧光显微镜下观察转染组的转染效果。③ FCM检测：转染后24 h，用0.25%胰蛋白酶/0.1%EDTA消化细胞，PBS洗涤，流式细胞仪检测转染组细胞转染效率，并设未转染组为对照组。
1.5.2 肌腱/韧带特异标记表达水平检测
① 免疫组织化学染色：取转染后即刻（0 d）、转染后7 d和14 d细胞爬片，经PBS漂洗后，丙酮固定20 min，3%H2O2阻断细胞内源性过氧化物酶15 min，5%山羊血清封闭15 min，滴加一抗（1∶200）室温孵育1 h。PBS漂洗3次后，滴加二抗（1∶200）室温孵育30 min。DAB显色，光镜下观察。② 实时荧光定量PCR检测：转染组转染后14 d，采用实时荧光定量PCR检测肌腱/韧带特异基因Tenomodulin、Tenascin-C和Decorin mRNA表达水平。采用Trizol法提取细胞总RNA，经AMV 逆转录酶转录合成cDNA。采用SYBR Green Real-time PCR Master Mix在实时定量PCR 仪上行PCR反应，引物序列见表 1。反应体系15 μL： 2×SYBR Green缓冲液7.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，灭菌去离子水补齐至15 μL。反应条件：95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、1 min，40个循环。以GAPDH为对照基因，采用2-ΔΔCt 法计算各目的基因mRNA表达水平。同时设未转染组细胞作为对照。
表1
实时荧光定量PCR检测目的基因引物序列
Table1.
Primer sequences of genes for real-time fluorescent quantitative PCR
1.6 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 转染效率观察
2.1.1 倒置相差显微镜观察
转染后24 h，镜下可见细胞生长增殖缓慢，细胞形态及轮廓清晰（图 1）。
图1
转染后24 h倒置相差显微镜观察细胞形态（×100） 图 2 转染后24 h荧光显微镜观察GFP表达（×100） 图 3 转染后24 h FCM检测 ⓐ 转染组 ⓑ 未转染组 图 4 转染后各时间点免疫组织化学染色观察Ⅰ型胶原表达（×100） ⓐ 0 d ⓑ 7 d ⓒ 14 d
Figure1.
The morphological characteristics of peripheral blood MSCs after transfected with Ad-BMP-12 for 24 hours under inverted phase contrast microscope (×100) Fig. 2 GFP expression after transfected with Ad-BMP-12 for 24 hours under fluorescence microscopy (×100) Fig. 3 Flow cytometry detection after transfected with Ad-BMP-12 for 24 hours ⓐ Transfected group ⓑ Untransfected group Fig. 4 The immunohistochemical staining of collagen type Ι after transfected with Ad-BMP-12 at different time (×100) ⓐ 0 day ⓑ Seven days ⓒ Fourteen days
2.1.2 荧光显微镜观察
转染后8 h，荧光显微镜下可见GFP表达；随着体外培养时间延长，表达GFP的细胞逐渐增多，荧光强度也逐渐增强，转染24 h，几乎所有细胞均可见GFP表达，细胞质和细胞核均显示绿色荧光（图 2）。
2.1.3 FCM检测
转染后24 h FCM检测示，转染组转染效率为99.57%，未转染组为2.46%（图 3）。
2.2 肌腱/韧带特异标记表达水平检测
2.2.1 免疫组织化学染色
光镜观察示，随转染时间延长，Ⅰ型胶原表达逐渐增强（图 4）。
2.2.2 实时荧光定量PCR检测
转染组转染后14 d，肌腱/韧带特异基因Tenomodulin、Tenascin-C和Decorin mRNA表达水平分别为0.061±0.013、0.029±0.008、0.679±0.067，均显著高于未转染组的0.004±0.002、0.003±0.001、0.142±0.024，差异有统计学意义（t= -7.700，P=0.031；t= -5.741，P=0.020；t= -1 2.998，P=0.000）。
3 讨论
相比其他来源的MSCs，外周血来源MSCs具有取材微创、采集简便等优点，且有利于实现自体细胞微创移植，在骨骼肌肉系统损伤治疗以及肌腱/韧带修复重建方面具有应用前景[16-17]。BMP-12具有较强的成肌腱/韧带组织能力，有学者在兔模型上采用BMP-12基因修饰促进了后交叉韧带损伤的组织学和生物力学愈合[18]。传统的外源性BMP-12能有效诱导MSCs向肌腱样细胞分化。直接添加外源性生长因子价格较昂贵且发挥生物活性时间短[19]。故本研究构建BMP-12重组腺病毒表达载体，采用基因工程的方法将BMP-12基因转入至外周血MSCs，使外源性基因在一定时间内高效表达。用BMP-12重组腺病毒表达载体转染外周血MSCs，可明显促进外周血MSCs向肌腱/韧带成纤维细胞表型分化并促进肌腱/韧带特异基因表达和细胞外基质分泌。但目前尚无单一的表型标记来鉴定成熟的肌腱/韧带成纤维细胞，因此本研究采用免疫组织化学和实时荧光定量PCR，从蛋白和基因水平来评价BMP-12重组腺病毒表达载体转染外周血MSCs促进其向肌腱/韧带细胞分化效果。
有学者研究BMP-12诱导脂肪来源干细胞成肌腱细胞分化能力，在犬和小鼠模型上BMP-12能有效增加肌腱标志物scleraxis 和 tenomodulin mRNA和蛋白表达水平。BMPs发挥作用是通过激活经典的Smad信号通路和非经典的MAPK通路进行调节，BMP-12是通过激活脂肪来源干细胞Smad1/5/8的磷酸化或p38 MAPK发挥作用[20]。
本研究采用BMP-12重组腺病毒表达载体成功转染外周血MSCs，并诱导其向肌腱/韧带细胞分化。重组腺病毒表达载体具有滴度高、易感染、毒性低、病毒粒子相对稳定、容纳量大、非整合宿主染色体无插入突变风险等优点，被广泛应用于基因工程表达载体系统，但存在有免疫原性、外源基因表达时间较短等缺陷。因此未来携带基因表达载体的研究应集中于腺病毒载体的优化改良或开发非病毒载体系统[21]。
综上述，本研究将Ad-BMP12成功传染外周血MSCs，诱导其成肌腱/韧带细胞分化取得了较好效果，为外周血MSCs参与肌腱/韧带损伤或病变的再生修复提供了参考，但确切机制尚需进一步研究。
